北京時間2023年4月6日，西湖大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院施一公團隊在《分子細胞》(Molecular Cell) 在線發(fā)表了題為“Structural basis of pre-tRNA intron removal by human tRNA splicing endonuclease”的最新研究論文，報道了pre-tRNA結(jié)合人源tRNA剪接內(nèi)切酶 (tRNA splicing endonuclease, TSEN) 復(fù)合物處于“預(yù)催化”和“催化后”兩種狀態(tài)的高分辨率結(jié)構(gòu)，結(jié)合體外生化，揭示了TSEN復(fù)合物識別和剪切pre-tRNA內(nèi)含子的分子機理。

tRNA是生物遺傳信息傳遞“中心法則”的重要參與者[1]。作為蛋白質(zhì)翻譯過程的解碼器，tRNA負責(zé)將mRNA中的遺傳信息精確地對應(yīng)到蛋白質(zhì)序列中。在tRNA合成過程中，前體tRNA (precursor tRNA, pre-tRNA) 需要經(jīng)過一系列轉(zhuǎn)錄后加工和修飾，才能生成成熟的tRNA。其中一個重要的過程是“tRNA剪接”[2]。在所有的生物中，均有一部分pre-tRNA存在內(nèi)含子。這些內(nèi)含子序列必須經(jīng)過tRNA剪接被精確地去除[3]。

在真核生物中，tRNA剪接分為“剪”和“接”兩個過程：前者負責(zé)將pre-tRNA中的內(nèi)含子去除，由TSEN復(fù)合物執(zhí)行；后者負責(zé)將切開的兩個外顯子連接，由 tRNA 連接酶復(fù)合物介導(dǎo)[4] (圖1) 。這兩個過程的精確進行對 tRNA 的正確折疊和穩(wěn)定性，以及對蛋白質(zhì)合成的效率和精度都至關(guān)重要。其功能異常會導(dǎo)致部分密碼子無法解碼，從而引起蛋白質(zhì)合成紊亂，并最終引發(fā)包括癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和發(fā)育缺陷在內(nèi)的多種人類疾病[5]。由于缺乏關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)信息，長期以來人們對pre-tRNA剪接機理的理解較為滯后。其中一個關(guān)鍵的科學(xué)問題是TSEN復(fù)合物如何準確識別在序列上并不保守的pre-tRNA，并在相應(yīng)的剪接位點完成內(nèi)含子的剪切？

圖1 tRNA剪接過程示意圖

研究人員首先純化出性質(zhì)均一的人源TSEN/CLP1復(fù)合物，然后建立體外剪切反應(yīng)，用于組裝TSEN/CLP1/pre-tRNA復(fù)合物。通過在TSEN催化亞基的活性位點引入突變的方法，成功捕獲了該復(fù)合物處于“預(yù)催化”和“催化后”的兩種狀態(tài)，并利用冷凍電鏡技術(shù)解析了相應(yīng)的結(jié)構(gòu) (圖2) 。兩種狀態(tài)的TSEN/CLP1/pre-tRNA復(fù)合物的整體結(jié)構(gòu)十分相似，但在“催化后”狀態(tài)中，pre-tRNA的剪接位點已經(jīng)完成了剪切反應(yīng)。

圖2 TSEN/pre-tRNA復(fù)合物預(yù)催化與催化后狀態(tài)的電鏡結(jié)構(gòu)

通過結(jié)構(gòu)分析，研究人員發(fā)現(xiàn)TSEN復(fù)合物的四個亞基組裝形成了一個連續(xù)的表面凹槽，非常適合容納L形的pre-tRNA底物。在“預(yù)催化”狀態(tài)中，pre-tRNA的成熟結(jié)構(gòu)域和反密碼子莖被TSEN34、TSEN54和TSEN2識別。這些相互作用將3’剪接位點 (3’-splice site, 3’SS) 導(dǎo)向TSEN34的催化中心，并且pre-tRNA在3’SS附近的磷酸骨架發(fā)生約180度的翻轉(zhuǎn)，形成一個凸起 (3’SS bulge) ，使得3’SS更加靠近TSEN34的催化中心。5’剪接位點 (5’-splice site, 5’SS) 位于反密碼子 (anticodon) 下游的一個核苷酸，反密碼子與內(nèi)含子的部分序列通過堿基配對，形成A-I螺旋 (Anticodon-intron helix) 。一旦成熟結(jié)構(gòu)域和反密碼子莖被TSEN識別，在A-I螺旋的引導(dǎo)下，5’SS也會隨之定向到TSEN2的催化中心。大部分內(nèi)含子序列不參與pre-tRNA與TSEN的相互作用，解釋了為什么內(nèi)含子長度、序列各不相同的pre-tRNA可以被TSEN結(jié)合和剪切。

總的來說，這些結(jié)構(gòu)上的發(fā)現(xiàn)以及基于結(jié)構(gòu)的生化分析，共同揭示了TSEN復(fù)合物識別、剪切pre-tRNA的分子機制。這也是施一公團隊在mRNA剪接之外，探究另一類特殊內(nèi)含子的剪接機理的一項重要工作。

西湖大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院施一公教授為本文的通訊作者，原西湖大學(xué)助理研究員張曉峰（現(xiàn)為中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)研究員）為本文的共同通訊作者。張曉峰、西湖大學(xué)博士生楊豐華、副研究員占謝超和博士生卞彤為本文的共同第一作者。西湖大學(xué)博士生邢芷涵、盧怡辰參與了本研究的部分工作。本研究得到了西湖大學(xué)冷凍電鏡平臺、高性能計算中心、晶體學(xué)平臺、質(zhì)譜與代謝組學(xué)平臺的大力支持。本研究獲得了國家自然科學(xué)基金委、西湖教育基金會、西湖大學(xué)、西湖實驗室、中國博士后科學(xué)基金、博士后創(chuàng)新人才計劃的相關(guān)經(jīng)費支持。

參考文獻：

[1] CRICK F H C. Origin of Genetic Code [J]. J Mol Biol, 1968, 38(3): 367-&.

[2] ABELSON J, TROTTA C R, LI H. tRNA splicing [J]. J Biol Chem, 1998, 273(21): 12685-8.

[3] PARISIEN M, WANG X, PAN T. Diversity of human tRNA genes from the 1000-genomes project [J]. RNA Biol, 2013, 10(12): 1853-67.

[4] HAYNE C K, LEWIS T A, STANLEY R E. Recent insights into the structure, function, and regulation of the eukaryotic transfer RNA splicing endonuclease complex [J]. Wiley Interdiscip Rev RNA, 2022: e1717.

[5] SEKULOVSKI S, DEVANT P, PANIZZA S, et al. Assembly defects of human tRNA splicing endonuclease contribute to impaired pre-tRNA processing in pontocerebellar hypoplasia [J]. Nat Commun, 2021, 12(1): 5610.

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