2024-10-24 從醫(yī)路漫漫 MedSci原創(chuàng) 發(fā)表于上海

脂肪移植通常產(chǎn)生不一致和次優(yōu)的結(jié)果，需要改進(jìn)脂肪處理技術(shù)。采用機(jī)械乳化技術(shù)制備的基質(zhì)血管組分（SVF）凝膠比傳統(tǒng)的Coleman脂肪移植物具有更高的保留率。

脂肪移植在組織修復(fù)和重建中的重要性日益得到認(rèn)可，盡管其長(zhǎng)期保留是眾所周知的不可預(yù)測(cè)的，阻礙了其更廣泛的臨床應(yīng)用。脂肪移植的成功取決于多種因素，主要是移植前的脂肪處理方法。廣泛的研究一直致力于開(kāi)發(fā)治療或設(shè)計(jì)策略，以提高移植后脂肪保留率。最初的研究將保留脂肪的關(guān)鍵歸因于脂肪細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性和活性的保存，這一概念被稱為細(xì)胞生存理論。然而，最近的研究將對(duì)脂肪形成的理解轉(zhuǎn)向了“宿主細(xì)胞替代理論”，表明新生兒脂肪細(xì)胞主要是通過(guò)再生相關(guān)細(xì)胞的分化產(chǎn)生的。這種范式轉(zhuǎn)變強(qiáng)調(diào)了探索創(chuàng)新方法的重要性，通過(guò)關(guān)注與再生相關(guān)的細(xì)胞機(jī)制來(lái)提高脂肪移植的壽命。

增強(qiáng)移植物再生的關(guān)鍵是獲得更多的再生相關(guān)細(xì)胞，特別是脂肪組織來(lái)源的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（ASCs）。大量培養(yǎng)ASCs的傳統(tǒng)方法涉及使用膠原酶消化脂肪組織，這是一種不適合人類應(yīng)用的技術(shù)。2017年，Yao等人開(kāi)發(fā)了一種創(chuàng)新方法，通過(guò)機(jī)械剪切Coleman脂肪移植物產(chǎn)生凝膠狀基質(zhì)血管組分（SVF）脂肪。這種SVF凝膠富含再生相關(guān)細(xì)胞，如ASCs，在細(xì)胞治療方面顯示出相當(dāng)大的前景。與傳統(tǒng)方法不同的是，SVF凝膠技術(shù)采用純物理方法—機(jī)械剪切，使其成為一種更安全的替代方法。傳統(tǒng)方法依賴于膠原酶等酶消化劑，這會(huì)帶來(lái)各種風(fēng)險(xiǎn)，如潛在的過(guò)敏反應(yīng)和長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)胞污染。這種方法有效地破壞了成熟的脂肪細(xì)胞，同時(shí)保留了干細(xì)胞的再生和分化能力。然而，剪切力增強(qiáng)SVF凝膠細(xì)胞再生的確切機(jī)制仍有待充分闡明。

在我們之前的研究中，我們利用流式細(xì)胞術(shù)比較了不同剪切力下的細(xì)胞亞群，闡明了細(xì)胞水平的變化，并證明了再生相關(guān)細(xì)胞的增加。我們發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)的脂肪移植技術(shù)相比，通過(guò)機(jī)械剪切和缺乏酶消化產(chǎn)生的SVF凝膠實(shí)現(xiàn)了高效穩(wěn)定的體積增強(qiáng)，并顯著豐富了表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物的群體。這表明SVF凝膠在臨床移植中比傳統(tǒng)Coleman脂肪具有明顯的優(yōu)勢(shì)，包括減少成熟脂肪細(xì)胞和增加具有高再生潛力的細(xì)胞。包括我們?cè)趦?nèi)的各種研究都使用免疫熒光染色來(lái)證明新的脂肪細(xì)胞起源于宿主來(lái)源的脂肪相關(guān)細(xì)胞。然而，脂肪移植研究的一個(gè)主要挑戰(zhàn)在于它依賴于成像觀察，而沒(méi)有全面的分子分析。因此，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)探索機(jī)械隔離誘導(dǎo)脂肪再生的機(jī)制對(duì)于推進(jìn)該領(lǐng)域的發(fā)展至關(guān)重要。

為了彌補(bǔ)這一知識(shí)差距，我們對(duì)移植到裸鼠體內(nèi)的Coleman脂肪和SVF凝膠樣本的脂肪組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。該方法利用微陣列和RNA-seq作為強(qiáng)大的工具來(lái)剖析移植后脂肪再生差異的分子機(jī)制。基因表達(dá)表現(xiàn)出強(qiáng)大的動(dòng)態(tài)，可以作為細(xì)胞內(nèi)響應(yīng)外部刺激的分子變化的實(shí)時(shí)指標(biāo)。目前，微陣列或RNA-seq技術(shù)能夠在全基因組范圍內(nèi)同時(shí)檢測(cè)動(dòng)態(tài)mRNA變化。我們使用這些方法來(lái)研究機(jī)械加工的SVF凝膠與未加工的Coleman脂肪移植后的分子事件。我們的目的是闡明機(jī)械剪切力促進(jìn)脂肪組織再生的機(jī)制。

此外，本研究可能揭示通過(guò)戰(zhàn)略性預(yù)處理提高移植脂肪保留率的特異性靶點(diǎn)分子，為提高脂肪移植治療的療效提供新的方向。

方法：本研究通過(guò)將抽脂患者吸出的脂肪（經(jīng)科爾曼脂肪移植或通過(guò)機(jī)械剪切力進(jìn)一步精制成SVF凝膠）移植到裸鼠背部來(lái)研究其作用機(jī)制。

基質(zhì)血管組分（SVF）凝膠和Coleman脂肪的制備方案。通過(guò)離心抽吸脂肪來(lái)回收Coleman脂肪。SVF凝膠是通過(guò)選擇性地保留含有油脂的上層，去除下層水層，然后施加壓力以建立包裹的脂肪來(lái)獲得的。這個(gè)程序之后是一個(gè)額外的離心步驟。這種制備涉及到使用純手工技術(shù)，不依賴于任何外部物質(zhì)。

各種脂肪的剪切力與運(yùn)動(dòng)粘度之間的關(guān)系。SVF凝膠是從最初的Coleman脂肪中獲得的，在機(jī)械隔離期間使其受到剪切力。脂肪的粘度與剪切力呈正相關(guān)，兩者之間存在顯著的線性關(guān)系。

移植脂肪組織的總體外觀、壽命和組織學(xué)改變。(A)用于實(shí)驗(yàn)的方法。(B)對(duì)兩類脂肪移植物在移植后間隔3天和60天進(jìn)行綜合觀察。(C)脂肪組織保存率的改變。與Coleman脂肪相比，SVF凝膠具有更高的保留率。*p < 0.001。(D)移植后60天的組織學(xué)分析顯示右側(cè)SVF凝膠內(nèi)有組織的脂肪結(jié)構(gòu)完全成熟，而左側(cè)Coleman脂肪移植物中觀察到殘留的油滴。顯微鏡檢查用比例尺設(shè)置為200 μm。符號(hào)“#”表示存在油滴。(E)免疫熒光染色顯示，移植后3天，SVF凝膠移植物內(nèi)的脂肪細(xì)胞出現(xiàn)壞死跡象，與Coleman脂肪移植物相比，perilipin染色陰性的區(qū)域明顯增加。這表明SVF凝膠中的成熟脂肪細(xì)胞受到剪切力誘導(dǎo)的損傷。然而，移植60天后，在右下方的SVF凝膠移植物中觀察到大量新形成的脂肪細(xì)胞，而在右上方的Coleman脂肪移植物中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)缺乏perilipin染色的區(qū)域。這些發(fā)現(xiàn)表明SVF凝膠中脂肪細(xì)胞新生的發(fā)生率較高，Coleman脂肪中脂肪細(xì)胞壞死的情況較多。顯微鏡檢查用的比例尺尺寸為100 μm。

流式細(xì)胞術(shù)定量測(cè)定不同組織間充質(zhì)干細(xì)胞的相對(duì)豐度。流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，與在Coleman脂肪中觀察到的相比，SVF凝膠中間充質(zhì)干細(xì)胞的豐度顯著增加，差異超過(guò)8倍

通過(guò)對(duì)SVF凝膠組和Coleman脂肪組的移植組織進(jìn)行微陣列和RNA-seq分析，確定移植早期的組織來(lái)源。(A)第三天移植脂肪組織的人cDNA微陣列的點(diǎn)陣圖顯示雜交信號(hào)質(zhì)量較低。該示意圖基于本研究中SVF凝膠組獲得的樣品。(B)背景校正后抽脂后直接分析的人體組織高質(zhì)量雜交信號(hào)。圖示樣本是最近獲得的未接受任何移植治療的Coleman脂肪標(biāo)本。(C)熱圖顯示了單個(gè)基因的表達(dá)水平，從綠色到紅色表示低到高水平。(D)右側(cè)灰框顯示了前10個(gè)顯著富集的生物過(guò)程/類別，以及相應(yīng)數(shù)量的參與脂質(zhì)代謝和細(xì)胞周期過(guò)程的上調(diào)/下調(diào)表達(dá)基因。

結(jié)果：移植后SVF凝膠的保留率超過(guò)了Coleman脂肪。蘇木精和伊紅（HE）染色和免疫熒光結(jié)果表明，SVF凝膠組可以形成新的脂肪組織，其特征是組織良好的成熟脂肪結(jié)構(gòu)。施加機(jī)械剪切力誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞豐度增加。移植后脂肪再生，而不僅僅是存活再生，再生細(xì)胞主要來(lái)自小鼠，微陣列分析支持了這一點(diǎn)。RNA-seq顯示在SVF凝膠組和Coleman脂肪組之間表達(dá)了601個(gè)基因，其中164個(gè)基因上調(diào)（細(xì)胞周期過(guò)程），437個(gè)基因下調(diào)（脂質(zhì)代謝）。

討論:機(jī)械剪切力的應(yīng)用可以減少并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)和促進(jìn)細(xì)胞增殖和分裂,從而提高移植脂肪的保留和再生。

原始出處：

Yuan, Ye;  Jian, Ma;  Bing-Yang, Guo;Mechanical force promotes tissue and molecular changes in adipose tissue regeneration post-transplantation.Front Cell Dev Biol 2024;12(0):1472575

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