編譯：微科盟阿Z，編輯：微科盟居居、江舜堯。

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導(dǎo)讀   目前，在現(xiàn)代系統(tǒng)生物學(xué)中，探索中草藥(HM)和腸道微生物組在體溫調(diào)節(jié)方面的潛在關(guān)系備受關(guān)注，這是人類健康的一個(gè)重要方面。然而，人們對(duì)HM在體溫調(diào)節(jié)中的機(jī)制認(rèn)識(shí)不足。本研究證明了經(jīng)典的中草藥配方理中湯(YJT)可以預(yù)防PTU誘導(dǎo)的甲狀腺功能減退大鼠的體溫過(guò)低、過(guò)度炎癥和腸道微生物群失調(diào)。值得注意的是，這些特性與腸道微生物群的改變以及小腸和棕色脂肪組織(BAT)中體溫調(diào)節(jié)和炎癥介質(zhì)之間的信號(hào)串?dāng)_有關(guān)。與治療甲狀腺功能減退癥的傳統(tǒng)藥物L(fēng)-甲狀腺素相比，YJT具有減輕系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)的功效，這與腸道TLR4和Nod2/Pglyrp1信號(hào)通路的抑制有關(guān)。本研究的結(jié)果表明，YJT可以促進(jìn)PTU誘導(dǎo)的甲狀腺功能減退大鼠的BAT產(chǎn)熱，并預(yù)防系統(tǒng)性炎癥，這與YJT在調(diào)節(jié)腸道微生物群和與腸道內(nèi)分泌功能和先天免疫系統(tǒng)有關(guān)的基因表達(dá)方面的益生元作用有關(guān)。這些結(jié)果可能會(huì)加強(qiáng)微生物群-腸道-BAT軸的理論基礎(chǔ)，從而實(shí)現(xiàn)以“Holobiont”為中心的醫(yī)學(xué)范式轉(zhuǎn)變。    

論文ID

原名：Yijung-tang improves thermogenesis and reduces inflammation associated with gut microbiota in hypothyroid rats

譯名：理中湯改善甲狀腺功能減退大鼠的生熱作用并減少與腸道菌群相關(guān)的炎癥

期刊：npj Biofilms and Microbiomes

IF：9.2

發(fā)表時(shí)間：2023.6

通訊作者：Young-Do Nam，Hojun Kim

通訊作者單位：韓國(guó)食品研究所；韓國(guó)東國(guó)大學(xué)

DOI號(hào)：10.1038/s41522-023-00396-2    

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

結(jié)果

1 YJT可緩解甲狀腺功能減退引起的體溫過(guò)低和全身性炎癥

通過(guò)丙基硫氧嘧啶(PTU)誘導(dǎo)的甲狀腺功能減退大鼠模型，研究了YJT是否能改善Tb和預(yù)防系統(tǒng)性炎癥，L-甲狀腺素(T4)作為對(duì)照藥物(圖1a)。與對(duì)照組相比，PTU處理減少了體重的增加(圖1b)，并導(dǎo)致食物攝入量減少50%(圖1c)，平均Tb下降>1℃(圖1d，圖S1a)。從給藥后約9天開始，YJT和T4都抑制了PTU引起的體重、食物攝入和Tb的降低(圖1b-d)。此外，YJT治療導(dǎo)致這些代謝參數(shù)的恢復(fù)，而長(zhǎng)期的T4治療會(huì)誘發(fā)食欲過(guò)盛和高熱癥。YJT和T4都能恢復(fù)被PTU破壞的葡萄糖耐量(圖1e)。正如預(yù)測(cè)的那樣，與對(duì)照組相比，PTU誘導(dǎo)的甲狀腺功能減退大鼠血清促甲狀腺激素(TSH)水平顯著升高，T4和三碘甲狀腺原氨酸(T3)水平下降(圖1f-h)。YJT使血清T4和T3水平恢復(fù)到對(duì)照組水平(圖1f-h)。雖然PTU不影響血清胃饑餓素水平(厭食激素，圖1i)，但它增加了胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)(厭食激素，圖1j)的分泌，導(dǎo)致接受PTU治療的大鼠攝食量減少。YJT和T4治療均能刺激胃饑餓素的分泌，YJT(而非T4)阻止了PTU誘導(dǎo)的血清GLP-1水平的升高(圖1i，j)。全身性炎癥標(biāo)志物，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和脂多糖(LPS)在PTU處理組和T4+PTU處理組中均增強(qiáng)，而YJT抑制了PTU誘導(dǎo)的全身炎癥(圖1k，l)。此外，回腸組織學(xué)顯示，甲狀腺功能減退癥擾亂了腸道屏障和吸收，表現(xiàn)為絨毛長(zhǎng)度和隱窩深度減少，而YJT和T4治療均能逆轉(zhuǎn)這些變量(圖1m)。T4治療導(dǎo)致小腸長(zhǎng)度和肝、心、脾等部分器官的質(zhì)量顯著增加(圖S1b，c)。

圖1. 理中湯(YJT)和L-甲狀腺素(T4)對(duì)甲狀腺機(jī)能減退大鼠代謝表型、血清代謝物和組織學(xué)的影響。a，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖；b，體重；c，食物攝入量；d，實(shí)驗(yàn)期間的平均核心體溫(Tb)(每組n = 5)。e，通過(guò)口服葡萄糖耐量試驗(yàn)評(píng)估葡萄糖代謝。f-h，促甲狀腺激素(TSH)、甲狀腺素(T4)和三碘甲狀腺原氨酸(T3)的水平。i-l，血清胃饑餓素、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、脂多糖(LPS)。m，四個(gè)實(shí)驗(yàn)組回腸蘇木精-伊紅染色組織學(xué)分析。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示(每組n = 7-8)。*P < 0.05，與對(duì)照組相比；#P < 0.05，與PTU相比。列上方的不同字母表示顯著差異。Con，只接受生理鹽水的；PTU，接受10 mg/kg/body PTU；YJT + PTU，接受2.1g/kg YJT和10 mg/kg/body PTU；T4 + PTU，接受0.5 mg/kg L-甲狀腺素和10 mg/kg PTU。

2 YJT調(diào)節(jié)腸道激素和炎癥細(xì)胞因子

為了進(jìn)一步檢測(cè)YJT調(diào)節(jié)的與維持腸道屏障、腸道信號(hào)和炎癥細(xì)胞因子相關(guān)的基因，通過(guò)RT-qPCR對(duì)小腸回腸中幾個(gè)關(guān)鍵標(biāo)志物的mRNA表達(dá)進(jìn)行了定量。與回腸組織學(xué)一致，與對(duì)照組相比，PTU治療大鼠中Claudin-2和zonula occludens-1(ZO-1，上皮緊密連接分子)的表達(dá)趨于下降或明顯下降。此外，這些變化在YJT和T4治療后部分或完全恢復(fù)(圖2a)。與YJT相比，T4處理增加了增殖細(xì)胞核抗原(PCNA，細(xì)胞增殖標(biāo)志物，圖2a)和組蛋白去乙酰化酶4(HDAC4，圖2a)的表達(dá)。YJT處理減弱了PTU誘導(dǎo)的促炎癥和炎癥細(xì)胞因子基因表達(dá)的增加，包括NF-κB、TNF-α、白細(xì)胞介素6(IL-6)和IL-15，而T4處理并沒(méi)有表現(xiàn)出這種對(duì)腸道炎癥的預(yù)防作用(圖2a)。此外，T4處理誘導(dǎo)了NF-κB的表達(dá)(圖2a)，并刺激了瞬時(shí)受體電位香草素1通道(Trpv1)的表達(dá)，而不是Trpv3或Trpv4(熱、炎癥和疼痛的感覺(jué)，圖2b)。此外，YJT和T4治療均逆轉(zhuǎn)了PTU誘導(dǎo)的Dio1表達(dá)減少，YJT甚至誘導(dǎo)Dio2表達(dá)增加了4.5倍(圖2b)，促進(jìn)了從無(wú)活性T4到生物活性T3的轉(zhuǎn)化。在PTU處理的大鼠中，酪氨酸羥化酶(Th)的表達(dá)減少，色氨酸羥化酶2(Tph2，5-羥色胺(5-HT)合成的限速酶)的表達(dá)增加，而YJT和T4處理后，這些情況得到逆轉(zhuǎn)(圖2b)。然而，5-HT受體HTR1F的表達(dá)沒(méi)有差異(圖2b)。與PTU處理的大鼠相比，YJT處理抑制了GLP-1R的表達(dá)，同時(shí)降低了血清GLP-1水平(圖2b)，緩解了甲狀腺功能減退癥的吞咽功能減退。此外，與PTU治療組相比，YJT治療增加了游離脂肪酸受體3(FFAR3)的表達(dá)，但沒(méi)有增加FFAR2的表達(dá)(兩者都是細(xì)菌代謝物短鏈脂肪酸的受體)，并且增加了膽汁酸G蛋白偶聯(lián)受體5(TGR5)而不是法尼醇X受體(FXR)(后兩者是膽汁酸受體，BAs)(圖2c)。此外，與PTU處理的大鼠相比，YJT處理組的腸道傳感器，如pH感應(yīng)型G蛋白偶聯(lián)受體(GPR65)、toll樣受體4(TLR-4，檢測(cè)細(xì)菌LPS)、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2(Nod2，結(jié)合細(xì)菌肽聚糖)和肽聚糖識(shí)別蛋白1(Pglyrp1)均顯著下調(diào)，而與所有其他組相比，T4處理組中Pglyrp2表達(dá)顯著上調(diào)(圖2c)。這些數(shù)據(jù)表明，YJT可促進(jìn)與腸道內(nèi)分泌功能、甲狀腺激素轉(zhuǎn)化及多種信號(hào)通路廣泛相關(guān)的腸道基因表達(dá)，抑制甲狀腺功能減退相關(guān)的腸道炎癥。

圖2. 不同處理對(duì)腸道促炎和炎癥標(biāo)志物以及代謝物相關(guān)受體相對(duì)mRNA表達(dá)的影響。a，腸道緊密連接標(biāo)志物Claudin-2和ZO-1、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、組蛋白去乙?；?(HDAC4)、NF-κB、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6和15(IL-6和IL-15)的基因。b，瞬時(shí)受體電位香草素1、3和4型(Trpv1、Trpv3和Trpv4)、1型和2型脫碘酶(Dio1和Dio2)、酪氨酸羥化酶(Th)、色氨酸羥化酶2(Tph2)、5-羥色胺受體1F(HTR1F)和胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-1R)。c，游離脂肪酸受體2和3(FFAR2和FFAR3)、膽汁酸G蛋白偶聯(lián)受體5(TGR5)、法尼醇X受體(FXR)、G蛋白偶聯(lián)受體65(GPR65)、Toll樣受體4(TLR4)、Nod樣受體2(Nod2)、肽聚糖識(shí)別蛋白1和2(Pglyrp1和Pglyrp2)。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示(每組n = 7-8)。*P < 0.05和**P < 0.01。列上方的不同字母表示顯著差異。 

3 YJT可逆轉(zhuǎn)甲狀腺功能減退相關(guān)的腸道菌群失調(diào)

為了確定甲狀腺功能減退癥是否會(huì)擾亂腸道微生物群，以及YJT治療是否可以預(yù)防這種干擾，本研究分析了四個(gè)實(shí)驗(yàn)組中26份糞便樣本的16S rRNA基因序列。樣品的Goods覆蓋指數(shù)的稀疏曲線達(dá)到了飽和(圖S2a)，反映出樣品中眾多的細(xì)菌都被鑒定出來(lái)。盡管樣品中的物種多樣性(α多樣性)沒(méi)有顯示出處理之間的差異(表S1)，但β多樣性顯示出微生物群落結(jié)構(gòu)的分離，這是基于Bray-Curtis相異性指數(shù)的主坐標(biāo)分析(PCoA)所顯示的(圖3a)。每個(gè)組中85%的樣本都表現(xiàn)出特定的核心擴(kuò)增子序列變異(ASVs)(圖S2b)。圓形圖顯示了除未培養(yǎng)分類群外的前10個(gè)屬(圖3b)。通過(guò)線性判別分析(LDA)效應(yīng)大小(LEfSe)確定不同組的生物標(biāo)志物(圖S2c)。PTU處理的大鼠受到較高比例屬的影響，如Prevotellaceae、Parabacteroides、Rikenellaceae和Ruminococcaceae，而Ruminiclostridium和Mucispirillum的比例較低，這些變化在YJT或T4處理后恢復(fù)到對(duì)照水平。

接下來(lái)，作者進(jìn)行了Pearson相關(guān)性分析和共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析，以揭示生物標(biāo)志物之間以及腸道微生物群和宿主生物標(biāo)志物之間的潛在相關(guān)性。一些屬，如Parabacteroides、Prevotellaceae、Rikenellaceae、Ruminococcaeae、Lactobacillus和Elusimiccobium與食物攝入量、血清T4水平和Tb呈負(fù)相關(guān)(圖S2d和S2e)，而Ruminiclostridium、Ruminococcaceae unclassified、Roseburia與Tb呈正相關(guān)。腸道傳感器-GPR65、TLR4、NOD2、Pglyrp1和Pglyrp2相互正相關(guān)，并與炎性IL-6和TNF-α相匹配(圖3e, S2f)。此外，腸上皮緊密連接標(biāo)志物(claudin-2和ZO-1)與Turicibacter、Ruminococcaceae UCG-010和Peptococcaceae_unclassified呈負(fù)相關(guān)；另外，Turicibacter也與Trpv1呈負(fù)相關(guān)(圖3e，圖S3)。在這個(gè)共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中，差異細(xì)菌屬主要產(chǎn)生了三個(gè)共生富集單元，即屬于f_Tannerellaceae(p_Bacteroidota)的Parabacterioides，屬于f_Ruminococcaceae(p_Firmicutes)的7個(gè)屬(紅色字體)，以及屬于f_Lachnospiraceae(p_Firmicutes)的9個(gè)屬(黃色字體)。這些來(lái)自同一門(厚壁菌門)的屬通常彼此呈正相關(guān)，而它們與來(lái)自擬桿菌門的屬呈負(fù)相關(guān)。總的來(lái)說(shuō)，不同細(xì)菌屬和宿主表型之間廣泛的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)暗示了腸道微生物在調(diào)節(jié)宿主攝食、Tb、腸道屏障和炎癥方面的潛在作用。 

  圖3. 糞便微生物群及其與腸道生物標(biāo)志物的相關(guān)性。a，基于Bray-Curtis相異性的主坐標(biāo)分析(PCoA)指示的β多樣性，以分析和可視化樣品之間的相似性和差異。采用置換多元方差分析(PERMANOVA)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。b，圓形圖顯示除未培養(yǎng)分類群外的前10個(gè)屬。c，不同細(xì)菌在屬水平上的相對(duì)豐度。d，特定屬與不同腸道標(biāo)志物和受體的mRNA表達(dá)之間的相關(guān)系數(shù)熱圖。*P < 0.05，**P < 0.01和***P < 0.001，NS，不顯著。  

4 CMT恢復(fù)了供體的熱及炎癥表型

為了進(jìn)一步證實(shí)腸道微生物群在介導(dǎo)YJT誘導(dǎo)的體溫調(diào)節(jié)和炎癥預(yù)防假說(shuō)中的作用，本研究進(jìn)行了CMT。將PTU、YJT+PTU、T4+PTU處理或?qū)φ战M大鼠的腸道微生物群轉(zhuǎn)移到抗生素處理的受體中，分別命名為CMTPTU、CMTYJT、CMTT4和CMTCon(圖4a)。正如我們預(yù)測(cè)的那樣，受體表現(xiàn)出與供體相似的熱表型和炎癥表型(圖4b，c)。持續(xù)一周的抗生素治療導(dǎo)致Tb水平在終止治療后2周內(nèi)慢性下降，體重和食物攝入量沒(méi)有明顯變化(圖4b，圖S4a,b)。CMTPTU大鼠表現(xiàn)出比對(duì)照組更低的Tb和攝食水平，而CMTYJT和CMTT4大鼠沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的差異，甚至比對(duì)照組的Tb更高(圖4b)。此外，比其他組相比，CMTPTU大鼠表現(xiàn)出較高的血糖、血清GLP-1和LPS水平，但血清T3、T4、胃饑餓素水平較低，回腸隱窩長(zhǎng)度較短(圖4c-i)。

  圖4. 盲腸微生物群轉(zhuǎn)移(CMT)調(diào)節(jié)了受體的代謝表型、血清代謝物和回腸組織學(xué)。a，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖。b，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的平均核心體溫(Tb)(每組n = 4)。c，血糖水平。d-h，通過(guò)ELISA檢測(cè)血清甲狀腺素(T4)、三碘甲狀腺原氨酸(T3)、胃饑餓素、胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、脂多糖(LPS)。i，四個(gè)實(shí)驗(yàn)組回腸蘇木精-伊紅染色組織學(xué)分析。比例尺為500 μm。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。單因素方差分析和事后LSD檢驗(yàn)。*P < 0.05與對(duì)照組相比。

5 YJT-微生物群激活BAT產(chǎn)熱并減輕腸道炎癥

BAT是一種重要的產(chǎn)熱器官，在小型哺乳動(dòng)物和人類中都有獨(dú)特的線粒體蛋白解偶聯(lián)蛋白1(UCP1)。本研究通過(guò)RT-qPCR進(jìn)一步量化了BAT中產(chǎn)熱相關(guān)基因的mRNA表達(dá)，以及與維持腸道屏障、腸道激素、神經(jīng)或免疫信號(hào)以及回腸炎癥相關(guān)生物標(biāo)志物相關(guān)的基因的表達(dá)，這些基因是用PTU、YJT+PTU、T4+PTU和對(duì)照組大鼠的腸道微生物群轉(zhuǎn)移到抗生素處理的大鼠中的。關(guān)于Tb的變化，觀察到CMTYJT組在BAT中顯示出比CMTPTU組更高的Adrb3(β3腎上腺素能受體)、Cidea、PPAR-α、PPAR-γ、PRDM16和UCP1(解偶聯(lián)蛋白1)的mRNA水平，F(xiàn)abp4(脂肪酸結(jié)合蛋白4)的mRNA水平低于CMTPTU組，而其他基因(如PGC-1α和Dio2)在各組間沒(méi)有差異(圖5)。這些數(shù)據(jù)支持YJT處理的微生物群激活BAT產(chǎn)熱功能。

在回腸中，CMTT4組claudin-2的表達(dá)明顯高于CMTPTU和CMTYJT組(圖5b)，而ZO-1、PCNA或HDAC4的表達(dá)無(wú)差異。CMTYJT組的NF-κB和TNF-α值相對(duì)低于CMTPTU組，而CMTT4組的NF-κB和IL-15水平均高于CMTYJT組(圖5b)。CMTYJT組中Trpv1和Trpv3的表達(dá)高于CMTYJT組，而Trpv4的表達(dá)在各組之間沒(méi)有差異(圖5c)。CMTPTU組和CMTYJT組中Dio1表達(dá)均低于CMTCon組，而CMTYJT組中Dio2表達(dá)高于其他組(圖5c)。Th和Tph的表達(dá)在各組中沒(méi)有差異；然而，HTR1F在CMTPTU和CMTT4組中表達(dá)較弱(圖5c)。CMTT4組中GLP-1R的表達(dá)低于CMTPTU組(圖5c)。此外，與CMTPTU組相比，CMTYJT組中FFAR2、FFAR3和FXR等受體的mRNA表達(dá)上調(diào)，TLR-4明顯下調(diào)；GPR65、Nod2、Pglyrp1和Pglyrp2在CMTYJT大鼠中的表達(dá)低于CMTPTU(圖5d)。這些結(jié)果表明，YJT處理的微生物群調(diào)節(jié)細(xì)菌相關(guān)的多種信號(hào)通路，并減輕甲狀腺功能減退相關(guān)的腸道炎癥。

圖5. 棕色脂肪組織(BAT)中產(chǎn)熱標(biāo)志物和CMT受體小腸中炎癥調(diào)節(jié)因子的表達(dá)。a，Adrb3、Cidea、PPAR-α、PPAR-γ、PRDM16、Fabp4、UCP1和Dio2。b，Claudin-2、ZO-1、PCNA、HDAC4、NF-κB、TNF-α和IL-6和IL-15。c，Trpv1、Trpv3和Trpv4，Dio1和Dio2、酪氨酸羥化酶(Th)，色氨酸羥化酶2(Tph2)，5-羥色胺受體1 F(HTR1F)和胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-1R)。d，游離脂肪酸受體2和3(FFAR2和FFAR3)、膽汁酸G蛋白偶聯(lián)受體5(TGR5)、法尼醇X受體(FXR)、G蛋白偶聯(lián)受體65(GPR65)、Toll樣受體4(TLR4)、nod-樣受體2(Nod2)，肽聚糖識(shí)別蛋白1和2(Pglyrp1和Pglyrp2)。單因素方差分析和事后LSD檢驗(yàn)。*P < 0.05，**P < 0.01和***P < 0.001。不同的字母表示顯著差異。 

6 細(xì)菌定植可調(diào)節(jié)產(chǎn)熱和炎癥

本研究對(duì)所有供體和受體的糞便樣本進(jìn)行了16S rRNA基因測(cè)序和分析，以確認(rèn)細(xì)菌定植的效率，并比較受體的組間差異。雖然受體腸道微生物群落的α和β多樣性與供體不同(圖S5a，b；表S2-5)，但一些特定的屬，如Mucispirillum、Prevotellaceae和Turicibacter，表現(xiàn)出與受體相似的模式(圖S5c)。此外，β多樣性在受體大鼠組間顯示出分離(圖6a)。在受體中篩選出各組的細(xì)菌生物標(biāo)志物(圖6b)，與CMTPTU大鼠相比，CMTYJT大鼠的Candidatus_Arthromitus相對(duì)豐度較高，Prevotellaceae和Turicibacter的相對(duì)豐度較低；而Ruminococcaceae在CMTT4大鼠中過(guò)度表達(dá)(圖6c)，表明由于來(lái)自不同供體的CMT，腸道微生物群落的結(jié)構(gòu)和組成存在差異(圖6c)。

此外，Pearson相關(guān)性和共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析顯示，這些腸道細(xì)菌的豐度與不同代謝表型(如血清T4水平)、BAT產(chǎn)熱和腸道炎癥因子相關(guān)的基因表達(dá)有潛在的相關(guān)性(圖6d，e)。核心Tb可能被腸道Trpv1感知，并受血清T3水平和BAT調(diào)節(jié)因子的調(diào)節(jié)(圖S7)。另枝菌屬(Alistipes)與腸道FFAR2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；此外，乳桿菌屬(Lactobacillus)和Eisenbergiella分別與血清GLP-1和LPS水平呈負(fù)相關(guān)(圖S7)。總體而言，共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析顯示，CMT誘導(dǎo)的細(xì)菌的相互作用有助于調(diào)節(jié)BAT產(chǎn)熱和系統(tǒng)性炎癥。

  圖6. 盲腸菌群特征及其與CMT宿主生物標(biāo)志物的相關(guān)性。a，基于Bray-Curtis相異性的主坐標(biāo)分析(PCoA)指示的β多樣性，以分析和可視化樣品之間的相似性和差異。采用置換多元方差分析(PERMANOVA)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。b ，糞便微生物群中LDA得分>2的LEfSe分析選擇的差異細(xì)菌分類。c，屬水平上不同細(xì)菌的相對(duì)豐度("+"表示數(shù)據(jù)的平均值)。d，腸道標(biāo)志物和細(xì)菌分類學(xué)之間的Mantel檢驗(yàn)和Pearson相關(guān)性的組合圖。e，特定屬與不同腸道標(biāo)志物和受體mRNA表達(dá)之間的相關(guān)系數(shù)熱圖。*P < 0.05，**P < 0.01和***P < 0.001。      

討論

近期，盡管對(duì)HM作為一種治療代謝相關(guān)疾病的有前景的藥物進(jìn)行了廣泛的研究，但對(duì)HM和腸道微生物組的結(jié)合的認(rèn)識(shí)有限，并且該領(lǐng)域的一些問(wèn)題仍未得到解答。本研究將這兩個(gè)相互依賴的領(lǐng)域結(jié)合起來(lái)，證明了YJT對(duì)PTU誘導(dǎo)的甲狀腺功能減退大鼠的Tb和甲狀腺激素代謝有顯著影響。同時(shí)，根據(jù)16S rRNA基因測(cè)序和微生物群轉(zhuǎn)移的結(jié)果，YJT的作用可以通過(guò)腸道微生物群落的變化來(lái)解釋和證實(shí)，因此，可以通過(guò)調(diào)節(jié)一組被識(shí)別為細(xì)菌代謝物和細(xì)胞壁成分的特定受體(如FFAR2/FFAR3、TGR5/FXR、Pglyrp1/2/Nod2和TLR4)來(lái)解釋和確認(rèn)。本研究強(qiáng)調(diào)了YJT-微生物群-腸道信號(hào)級(jí)聯(lián)通路在介導(dǎo)YJT激活產(chǎn)熱和預(yù)防系統(tǒng)性炎癥方面的作用。

甲狀腺功能減退癥是與腸道和系統(tǒng)生態(tài)失調(diào)有關(guān)的最常見(jiàn)的代謝性疾病之一。據(jù)報(bào)道，PTU誘導(dǎo)的甲狀腺功能減退癥大鼠的甲狀腺激素水平與甲狀腺功能減退癥患者相似。因此，在本研究中，PTU處理可誘導(dǎo)Sprague-Dawley(SD)大鼠甲狀腺功能減退。正如預(yù)期的那樣，PTU治療導(dǎo)致食欲不振，基礎(chǔ)能量代謝受到抑制，Tb下降。在甲狀腺功能減退大鼠中，這些代謝表型與厭食性腸道激素GLP-1的循環(huán)水平升高、促食欲胃饑餓素的低水平以及甲狀腺激素水平下降有關(guān)。腸道微生物群落紊亂和系統(tǒng)性炎癥的增強(qiáng)是本研究PTU大鼠模型中最明顯的結(jié)果。此外，從甲狀腺功能減退大鼠轉(zhuǎn)移微生物群的受體表現(xiàn)出與其供體相似的代謝和炎癥表型，這在以前的研究中也觀察到。因此，這些數(shù)據(jù)表明甲狀腺功能減退癥的微生物群在形成低代謝和高炎癥方面的致病作用。

為了通過(guò)研究腸道微生物群對(duì)腸道激素和炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生的貢獻(xiàn)來(lái)解釋這些變化，我們檢測(cè)了小腸中一些最重要的受體和生物標(biāo)志物的mRNA表達(dá)。值得注意的是，先天模式識(shí)別受體，如Nod2、Pglyrp1、Pglyrp2(肽聚糖傳感器)和TLR4(LPS受體)，對(duì)哺乳動(dòng)物的炎癥反應(yīng)和抗菌肽的產(chǎn)生至關(guān)重要。本研究觀察到PTU處理的大鼠中GPR65、Nod2、Pglyrp1和TLR4的表達(dá)顯著增加。這些受體通過(guò)識(shí)別細(xì)菌成分(肽聚糖和LPS)，激活炎癥反應(yīng)，突破腸道屏障，并通過(guò)增加GLP-1的分泌來(lái)降低食欲。此外，細(xì)菌LPS已被證明可以抑制Dio活性，降低循環(huán)中T3的水平，從而導(dǎo)致體溫過(guò)低。羅氏菌屬(Roseburia)、Lachnospiraceae、Peptococcaceae和Ruminiclostridium與Tb呈正相關(guān)，而Parabacteroides、Rikenellaceae和Ruminococcaceae與Tb呈負(fù)相關(guān)。與這些數(shù)據(jù)一致，作者之前在甲狀腺功能減退沙鼠模型中檢測(cè)到類似的菌群變化。此外，甲狀腺功能減退大鼠的絨毛長(zhǎng)度、隱窩深度和腸道緊密連接分子的減少表明，腸道吸收和屏障受到干擾，導(dǎo)致系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)增加。綜上所述，通過(guò)激活LPS-TLR4和肽聚糖-Nod2/Pglyrp1信號(hào)通路，腸道微生物群失調(diào)可能與甲狀腺功能減退大鼠的代謝降低和系統(tǒng)性炎癥增強(qiáng)有關(guān)。 用L-甲狀腺素作為治療甲狀腺功能減退癥的常規(guī)方法，可以補(bǔ)救甲狀腺功能減退癥大鼠的體重和攝食量的下降。同時(shí)，根據(jù)以前研究的推薦劑量，當(dāng)前的數(shù)據(jù)表明，T4治療大鼠的食物攝入量和Tb水平顯著增加；一些器官的重量增加，包括脾臟、心臟和肝臟；絨毛和隱窩長(zhǎng)度增加，腸道細(xì)胞增殖增加；以及一些促炎和炎癥標(biāo)志物在T4治療大鼠中過(guò)度表達(dá)。HDAC4是一種參與翻譯后修飾的酶，據(jù)報(bào)道可以刺激細(xì)胞增殖并增強(qiáng)上皮緊密連接，這支持我們?cè)赥4處理大鼠中發(fā)現(xiàn)的腸道HDAC4、PCNA和緊密連接標(biāo)志物的高表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明，T4治療甲狀腺功能減退癥會(huì)產(chǎn)生不良事件，如攝食過(guò)量、體溫過(guò)高和過(guò)度炎癥。 在本研究中，在藥物誘導(dǎo)的甲狀腺功能減退大鼠中給藥YJT可以解決Tb的降低，并防止系統(tǒng)性炎癥。

雖然YJT的確切組成和活性成分尚不完全清楚，但有一些證據(jù)表明，它含有具有抗氧化和抗炎特性的化合物，如黃酮類和甘草素，以及益生元多糖。這些生物活性成分可能直接被腸道上皮TRP通道感知，調(diào)節(jié)激素(如GLP-1、瘦素和脂聯(lián)素)的分泌，并促成其對(duì)BAT及相關(guān)途徑的潛在益處。另外，這些植物源性產(chǎn)物可以發(fā)酵成SCFAs，在體內(nèi)發(fā)揮抗炎和產(chǎn)熱作用。為了研究腸道微生物群是否在YJT對(duì)甲狀腺功能減退癥狀的有益作用中發(fā)揮作用，我們將YJT治療的供體的盲腸微生物群轉(zhuǎn)移到抗生素處理的大鼠中?？股靥幚聿荒芡耆谋M微生物群，但為了消除受體固有的微生物群的影響，減少了現(xiàn)有的微生物群，為供體的微生物群定植創(chuàng)造了有利的環(huán)境，這已被有效地應(yīng)用于腸道微生物群功能的研究。雖然供體微生物群由于與原有微生物的競(jìng)爭(zhēng)而不能完全定植在受體腸道內(nèi)，但一些特定的屬表現(xiàn)出與供體相似的變化模式。

在以前的研究中也采用了同樣的CMT程序。這些數(shù)據(jù)表明了移植的效率，而且受體獲得了與供體相似的代謝和炎癥表型。 微生物群的轉(zhuǎn)移也可能傳遞了YJT對(duì)小腸炎癥相關(guān)基因和BAT中產(chǎn)熱相關(guān)基因表達(dá)的影響。CMTYJT大鼠中NE合成限速酶(Th)的基因表達(dá)增加，有助于激活BAT產(chǎn)熱作用。

此外，腸道中Dio2的表達(dá)增加，促進(jìn)無(wú)活性T4向生物活性T3的轉(zhuǎn)化，也被認(rèn)為是CMTYJT大鼠產(chǎn)熱的誘導(dǎo)因素。這些結(jié)果表明，YJT或YJT處理的微生物群可能影響這些神經(jīng)遞質(zhì)和激素在體內(nèi)的產(chǎn)生和處理，這反過(guò)來(lái)可能有助于其熱特性。本研究的數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，細(xì)菌代謝物相關(guān)受體，如FXR和/或TGR5(針對(duì)BAs)和FFAR2和/或FFAR3(針對(duì)SCFAs)可能參與了腸道神經(jīng)遞質(zhì)和激素的調(diào)節(jié)。以前的研究表明，BA-TGR5/FXR-Dio信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)增強(qiáng)能量消耗和葡萄糖控制的重要性。此外，本研究的數(shù)據(jù)支持腸道LPS-TLR4和肽聚糖-Nod2/Pglyrp1信號(hào)的減少可能傳達(dá)了YJT或YJT處理的微生物群的抗炎作用。此外，接受YJT處理的微生物群的Trpv1和Trpv3表達(dá)增加，與炎癥、疼痛和熱的感受以及隨之而來(lái)的Tb調(diào)節(jié)有關(guān)?？紤]到以前的文獻(xiàn)和當(dāng)前的數(shù)據(jù)，與Dio1表達(dá)呈正相關(guān)的Oscillibacter可能增強(qiáng)抗炎反應(yīng)。此外，我們?cè)赮JT治療組觀察到的另一個(gè)變化是厚壁菌門與擬桿菌門的比例下降，這與疾病狀態(tài)有關(guān)。本研究表明，YJT處理的腸道微生物群可以對(duì)腸道先天免疫系統(tǒng)的活動(dòng)產(chǎn)生影響，并保護(hù)動(dòng)物免受甲狀腺功能減退引起的高度炎癥的影響。此外，這些數(shù)據(jù)表明，微生物群-腸道-BAT軸在介導(dǎo)YJT誘導(dǎo)的體溫調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。

因此，YJT可能作為一種益生元，通過(guò)改變腸道微生物群，提高Tb并緩解甲狀腺功能減退癥相關(guān)的炎癥反應(yīng)。這些對(duì)產(chǎn)熱的影響可能與Th和Dio2的表達(dá)增加有關(guān)，它們參與了小腸中去甲腎上腺素的合成和甲狀腺激素的代謝，最終激活BAT中的產(chǎn)熱途徑。與治療甲狀腺功能減退癥的傳統(tǒng)藥物L(fēng)-甲狀腺素相比，YJT通過(guò)抑制腸道LPS-TLR4和肽聚糖-Nod2/Pglyrp1信號(hào)通路，具有減輕系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)的獨(dú)特功效(圖7)?？傊?，本研究報(bào)道的數(shù)據(jù)表明，YJT有益的產(chǎn)熱和抗炎特性可能與腸道微生物群的改變有關(guān)，通過(guò)微生物群-腸道-BAT軸。由于每組的個(gè)體數(shù)量有限，在解釋這些結(jié)果時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎。YJT的確切活性成分及其調(diào)節(jié)熱、能量和腸道穩(wěn)態(tài)的機(jī)制仍需充分表征，以了解其益生元功能。鑒于HM在人類健康中的廣泛性，這些結(jié)果可以為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)系統(tǒng)打開一扇新的窗口。

圖7. 總結(jié)YJT通過(guò)腸道微生物群和相關(guān)的多種信號(hào)通路的產(chǎn)熱和抗炎特性。

PTU治療的甲狀腺功能減退大鼠表現(xiàn)出低體溫、低食欲和高度炎癥，這與腸道微生物群失調(diào)有關(guān)，特別是與高度富集的普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)有關(guān)。YJT作為一種益生元，可以調(diào)節(jié)腸道微生物群和代謝物相關(guān)受體(如FFAR3和TGR5/FXR)，刺激腸道內(nèi)用于合成去甲腎上腺素的酪氨酸羥化酶(Th)和用于甲狀腺激素代謝的2型脫碘酶(Dio2)的基因表達(dá)，從而激活棕色脂肪組織(BAT)的產(chǎn)熱途徑，減輕與甲狀腺功能減退有關(guān)的系統(tǒng)性炎癥。相比之下，甲狀腺功能減退大鼠的L-甲狀腺素(T4)治療會(huì)刺激胃饑餓素的分泌，激活腸道LPS-TLR4和肽聚糖-Pglyrp2信號(hào)通路，導(dǎo)致體溫過(guò)高、食欲過(guò)盛和高炎癥。 

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