上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院麻醉科

摘要  

實驗?zāi)康模罕狙芯恐荚谔接戨娽樦委熌摱景Y患者的生化和臨床效果。

實驗方法：納入2019年7月至2020年12月在廣東省中醫(yī)院治療的膿毒癥患者。將患者隨機分為常規(guī)西藥治療組(WM組)和西藥加在西藥基礎(chǔ)上電針治療組(EA組)。治療前、治療后3、5天測定免疫功能及臨床療效相關(guān)指標。免疫功能指標包括T淋巴細胞亞群百分比、自然殺傷細胞(NK)和可溶性程序性死亡蛋白1 (sPD-1)水平。臨床療效指標包括全血感染相關(guān)指標;腫瘤壞死因子α(TNF-α)、c反應(yīng)蛋白(CRP)、干擾素γ(INF-γ)水平;并使用急性生理和慢性健康評估II (APACHE-II)和序貫器官衰竭評估(SOFA)評分進行評估。

實驗結(jié)果：WM組(N=30)和EA組(N=30)的基線數(shù)據(jù)無差異。治療后第5天，EA組sPD-1水平低于WM組。EA組CD3+T淋巴細胞比例、CD4+T淋巴細胞比例、NK細胞比例及INF-γ水平均顯著高于WM組。與WM組比較，EA組治療5 d后白細胞計數(shù)(WBC)、中性粒細胞百分比及計數(shù)、中性粒細胞與淋巴細胞比值、CRP、TNF-α水平均顯著降低。EA組治療后5 d APACHE-II評分顯著低于WM組。

結(jié)論：電針可通過PD-1通路調(diào)節(jié)膿毒癥患者的免疫功能，起到抗炎作用從而改善臨床癥狀。

背景

膿毒癥是宿主被細菌或其他病原體感染引起的一系列反應(yīng)，并且發(fā)病迅速、死亡率高。膿毒癥也是人類死亡的主要原因。2017年，全球有4890萬例膿毒癥病例，導(dǎo)致1100萬人死亡，死亡率為22.5%。膿毒癥已成為急危重癥醫(yī)學(xué)科的一大難題。膿毒癥與免疫功能障礙密切相關(guān)，表現(xiàn)為抗炎和促炎反應(yīng)之間的失衡。

過度的炎癥反應(yīng)會激活抗炎機制，產(chǎn)生相應(yīng)的抗炎介質(zhì)和細胞因子來平衡促炎反應(yīng)，引起代償性抗炎反應(yīng)綜合征(簡稱CARS)。CARS是一種淋巴細胞功能和凋亡受到抑制的免疫抑制狀態(tài)。在過去的20年里，研究人員一直在爭論免疫功能障礙中炎癥過程是否更不利于膿毒癥患者的生存。炎癥反應(yīng)被認為是膿毒癥患者早期死亡的主要原因，而CARS與免疫抑制和器官衰竭相關(guān)，被認為是膿毒癥晚期死亡(診斷后幾天到幾周)的主要原因。然而，最近對膿毒癥患者和嚴重創(chuàng)傷患者組織樣本的基因組分析表明，先天免疫和獲得性免疫抑制會導(dǎo)致持續(xù)的炎癥狀態(tài)，導(dǎo)致持續(xù)的器官損傷和死亡。盡管研究人員認為這些研究存在缺陷，但許多人認為先天免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)在膿毒癥的進展中同樣重要。當膿毒癥持續(xù)存在時，免疫系統(tǒng)受到抑制，進入“免疫麻痹”狀態(tài)，最終導(dǎo)致持續(xù)的器官衰竭、繼發(fā)感染和死亡。研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者固有和獲得性免疫系統(tǒng)發(fā)生變化，包括未成熟巨噬細胞、樹突狀細胞(DC)和自然殺傷細胞(NK)凋亡加速，抗原呈遞細胞和巨噬細胞活性降低，CD4 +T淋巴細胞應(yīng)答受損，淋巴細胞凋亡增加。同時，促凋亡蛋白在體內(nèi)的表達增加，消耗T淋巴細胞。因此，免疫治療可能是改善膿毒癥患者預(yù)后的一種潛在治療方法。

電針可雙向調(diào)節(jié)人體免疫功能，增強免疫抑制患者的免疫功能。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，住院重癥監(jiān)護病房(ICU)的膿毒癥患者，電針治療后外周血CD3+T淋巴細胞(CD3 +T)和CD4+T淋巴細胞(CD4+T)亞群明顯升高，器官恢復(fù)較西醫(yī)治療更快。然而，這些結(jié)果的機制尚不清楚。程序性死亡蛋白1 (Programmed death protein 1, PD-1)是一種重要的免疫抑制分子，首次在t細胞淋巴瘤中被發(fā)現(xiàn)。PD-1主要在活化的T細胞中表達，有研究表明NK細胞影響PD-1/程序性死亡配體1 (PD-L1)通路。因此，我們推測電針可能通過調(diào)節(jié)PD-1通路來調(diào)節(jié)膿毒癥患者的免疫系統(tǒng)功能。

方法與受試者

1.患者的納入和排除標準。

本研究是一項隨機對照試驗，納入2019年7月至2020年12月在中國廣州廣東省中醫(yī)院ICU轉(zhuǎn)診的血液透析患者。

患者納入標準:年齡18-85歲，診斷膿毒癥，簽署知情同意書，根據(jù)中醫(yī)辨證分型判斷氣虛證患者。

患者排除標準:(1)懷孕或精神障礙;(2)免疫缺陷或使用免疫抑制劑或免疫增強劑;(3)惡性腫瘤史。

患者退出標準:(1)住院時間< 5天;(2)不愿參與研究或配合治療;(3)不能耐受電針治療的患者;(4)研究過程中出現(xiàn)其他嚴重疾病的患者。

膿毒癥和膿毒癥休克的診斷標準參照國際膿毒癥和膿毒癥休克管理指南(2016)。氣虛證的診斷標準以2002年出版的《中醫(yī)藥新臨床試驗研究指導(dǎo)原則》為依據(jù)。氣虛證的診斷應(yīng)結(jié)合原發(fā)和繼發(fā)癥狀。

2.實驗倫理

本試驗按照《赫爾辛基宣言》和《中華人民共和國臨床良好規(guī)范》及相關(guān)規(guī)定進行，并經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準（No.yf2019145-01）。為保護受試者隱私，數(shù)據(jù)處理采用匿名方式進行，并在臨床試驗開始前獲得每位患者或法定代理人的書面知情同意。本研究在ClinicalTrials.gov和中國臨床試驗注冊中心注冊，注冊號分別為NCT05367986和ChiCTR2200059459。

3.干預(yù)措施

將患者隨機分為西藥組(WM組)和電針組(EA組)，采用限制性隨機分組。進行隨機分組的統(tǒng)計學(xué)人員并不知道病人的分配情況。WM組患者接受西藥常規(guī)治療。根據(jù)國際膿毒癥和膿毒癥休克管理指南(2016)，常規(guī)治療包括抗生素和其他抗感染措施、液體管理、機械通氣和營養(yǎng)支持，但不包括使用免疫抑制劑或免疫增強劑，包括激素、丙種球蛋白和胸腺素。電針組采用西藥配合電針治療。電針足三里穴(ST36)、關(guān)元穴(CV4)、氣海穴(CV6)，每日2次，連續(xù)30分鐘，共5天。

根據(jù)國家標準GB12346-90，國家技術(shù)監(jiān)督局1990年公布的穴位定位包括:(1)足三里(ST36)，位于髕骨韌帶外側(cè)切跡下的小腿前外側(cè)7.5cm(4橫指);(2)關(guān)元(CV4)，位于臍下7.5cm，腹部中線;(3)氣海(CV6)，位于腹部中線關(guān)元(CV4)與臍之間的中點。

針刺和電針方法如下，置針前對穴位消毒。(1)足三里(ST36):患者仰臥位，直徑0.35mm，長度40mm，針插入皮膚90°，深度0.25-0.50cm。由一名資深的針灸科醫(yī)生進行針刺操作，包括提、刺和旋轉(zhuǎn)，以獲得適當?shù)尼槾谈杏X。一旦患者報告有燒灼、麻木、腫脹、疼痛或其他感覺(得氣)，將電針裝置連接到針灸針上，頻率設(shè)置為交替頻率波。頻率設(shè)置為4/20Hz，電流調(diào)節(jié)到患者能忍受的最大強度。(觀察到受刺激的局部肌肉抽搐，患者耐受。)采用G-6805電針裝置(上海華誼醫(yī)療電子儀器廠，中國上海)電刺激30分鐘。(2)關(guān)元(CV4)、氣海(CV6):患者仰臥位，一根直徑0.25mm、長40mm的針90°插入皮膚，深度0.25-0.40cm。電針治療過程與足三里相同。

4.結(jié)局指標

主要觀察指標為免疫功能障礙，包括T淋巴細胞亞群百分比、NK細胞百分比和可溶性程序性死亡蛋白-1水平(sPD-1)。T淋巴細胞亞群包括CD3+T和CD4+ T的百分比。次要觀察指標為臨床效果，包括全血感染相關(guān)指標、腫瘤壞死因子α (TNF-α)、c反應(yīng)蛋白(CRP)、干擾素γ (INF-γ)、急性生理和慢性健康評估II(APACHE-II)和序貫器官衰竭評估(SOFA)評分。全血分析的相關(guān)指標包括白細胞(WBC)計數(shù)、中性粒細胞百分比及計數(shù)、淋巴細胞百分比及計數(shù)、中性粒細胞/淋巴細胞比值(N/L比)。記錄治療前及治療開始后3、5天的預(yù)后指標。

5.隨機化和盲法

采用分組隨機化設(shè)計，將編碼按等比例分配給實驗組和對照組。由計算機生成的隨機數(shù)表保存在一個密封的信封里。由于這項研究是對治療方式的比較評估，所以盲法是不可行的。特別指派的研究人員記錄研究內(nèi)容并填寫病例觀察表。由不同的人員完成數(shù)據(jù)錄入和驗證，確保數(shù)據(jù)的準確性。數(shù)據(jù)收集人員和統(tǒng)計人員對參與者治療的分配和進行評估的治療團隊不知情。

6.樣本量計算

根據(jù)公式N =2× ((μα + μβ)2σ2)/δ2),δ = |μ1 ? μ2|,估計所需樣本量，采用PASS 11.0，α =0:05，β =0:1，雙側(cè)檢驗。由于sPD-1與膿毒癥的臨床干預(yù)很少，所以分析的依據(jù)是既往關(guān)于治療對外周血sPD-1影響的研究。在一項研究中，治療組的sPD-1水平404.27±41.26 pg/mL —517.91±52.55 pg/mL。因此，檢測sPD-1的顯著差異需要樣本量> 20例。但是，由于本研究是關(guān)于中醫(yī)免疫功能對膿毒癥患者免疫功能影響的研究，我們還參考了既往電針改善膿毒癥患者免疫功能的研究。在本研究中，電針與對照組對CD3+T百分比的影響分別為58.4±4.2%和54.4±3.5%。因此，我們計算出每個治療組至少有30例患者，才能檢測免疫功能參數(shù)的顯著差異。本研究患者的退出率約為10%。在這些數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，最終生成了包含70名患者的隨機數(shù)字表。

7.統(tǒng)計分析

所有統(tǒng)計分析均采用SPSS 22.0軟件進行。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD(正態(tài)分布)或中位數(shù)(四分位數(shù)范圍(IQR);p25, p75)(異常分布)。采用Levene檢驗檢驗方差齊性。對均勻方差正態(tài)分布的資料進行獨立樣本t檢驗。非正態(tài)分布或方差不等的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)秩和檢驗進行比較，組間比較采用Mann-Whitney非參數(shù)檢驗。分類變量以計數(shù)、百分比或比率表示，并采用卡方檢驗進行比較。

實驗結(jié)果

1基線特征

共篩選患者78例，其中高齡1例，免疫缺陷或免疫抑制劑6例，不愿接受電針治療7例。共入組64例患者，4例退出，2例失訪，2例出現(xiàn)心肌梗死等其他疾病(圖1)。研究結(jié)束，EA組30例，WM組30例。共有47名男性和13名女性，中位年齡為71.5歲(IQR;63.8, 78.8)。EA組男性25例，女性5例，中位年齡69.5歲(IQR;62.8, 77.0)。WM組男性22例，女性8例，中位年齡74.5歲(IQR;65.5, 79.3)。兩組在性別分布、年齡、疾病特征方面無顯著性差異(表1)。

2.免疫功能

治療前兩組患者CD3 +T、CD4+T、NK細胞比例及sPD1水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為，P >0.5)。治療開始后5 d, EA組sPD-1水平顯著低于WM組(表2)，治療后5 d, EA組CD3+T、CD4 +T、NK細胞比例顯著高于WM組(均P <0.05)(表2)。

3.臨床療效

治療前，兩組白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞計數(shù)、中性粒細胞百分比、淋巴細胞百分比、N/L比值比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.5)。開始治療后5天，與WM組比較，EA組白細胞計數(shù)、中性粒細胞百分比、N/L比值顯著降低(P <0.05;表3)。EA組淋巴細胞百分比顯著高于WM組(P <0.05;治療前，兩組CRP、TNF-α、INF-γ水平比較相似(P >0.5)(表4)。治療開始5 d后，EA組CRP、TNF-α水平較WM組顯著降低，INF-γ水平較WM組顯著升高(P <0.05;治療前，兩組APACHE-II、SOFA評分比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.5)。治療3 d后，EA組SOFA評分下降(P <0.05)。治療5 d后，EA組SOFA、APACHE-II評分較治療前顯著降低(P <0.01),EA組APACHE-II評分顯著低于WM組(P <0.05)(表5)。 

中西合璧述評    

膿毒癥的診斷和治療指南在不斷更新，許多新療法的確切療效是不確定的，特別是抗炎療法。膿毒癥患者經(jīng)常出現(xiàn)免疫功能障礙，這使得免疫治療成為膿毒癥治療的一個活躍的研究領(lǐng)域。膿毒癥包括先天性和后天免疫系統(tǒng)的改變。足三里(ST36)、關(guān)元(CV4)、氣海(CV6)是電針治療免疫功能的重要穴位。針刺這些穴位可顯著提高患者的先天免疫和獲得性免疫功能。CD3+T和CD4+T是獲得性免疫細胞，膿毒癥常伴有CD4+T數(shù)量顯著減少，提示膿毒癥的免疫抑制機制與CD4+T的下降密切相關(guān)。膿毒癥患者CD4+T細胞數(shù)量的大幅下降也與膿毒癥嚴重程度的增加有關(guān)。既往大鼠膿毒癥模型研究提示，電針足三里(ST36)可通過提高CD3+T和CD4+T水平，顯著降低炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫功能障礙。本研究結(jié)果還顯示，開始治療5 d后，EA組CD3+T、CD4+T水平明顯改善。電針組CD3+T、CD4+T水平及淋巴細胞百分率明顯高于WM組。提示電針可提高膿毒癥患者的淋巴細胞水平，調(diào)節(jié)T細胞亞群。  

淋巴細胞百分比是免疫功能的常用指標，淋巴細胞凋亡是膿毒癥“免疫麻痹”的重要步驟。自2001年Zahorec首次提出采用N/L比值評價膿毒癥患者以來，N/L比值已成為評價膿毒癥患者炎癥免疫狀態(tài)的重要指標。研究發(fā)現(xiàn)，電針治療后膿毒癥患者淋巴細胞百分率升高，N/L比值明顯降低。近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)N/L比值與APACHEII和SOFA評分相似，是評估膿毒癥嚴重程度的獨立危險因素。本研究還發(fā)現(xiàn)N/L比值與APACHE-II評分和SOFA評分呈正相關(guān)，EA組的N/L比值和APACHE-II評分低于WM組。因此，電針可以改善膿毒癥患者的臨床癥狀，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)與炎癥之間的平衡。兩組間SOFA評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與SOFA評分反映器官功能衰竭有關(guān)，其對臨床預(yù)后的敏感性低于APACHE-II評分。本研究有幾個局限性。首先，由于倫理問題，電針非經(jīng)絡(luò)和非腧穴沒有對照組。其次，檢測PD-1濃度，但不檢測淋巴細胞或T細胞上PD-1受體的表達。這些局限性可能在未來的研究中得到解決。

電針足三里(ST36)、關(guān)元(CV4)、氣海(CV6)能顯著降低膿毒癥患者的sPD-1水平，增加CD3+ T、CD4+T、NK細胞比例和INF-γ水平。隨著T淋巴細胞和NK細胞活化和功能的改善，APACHE-II評分降低，炎癥指標降低，臨床癥狀改善。總的來說，這些結(jié)局指標表明電針足三里(ST36)、關(guān)元(CV4)、氣海(CV6)可顯著改善膿毒癥患者的免疫功能，其機制可能與PD-1通路調(diào)控有關(guān)。此外，與sPD-1相比，mPD-1必須采用流式細胞術(shù)檢測;因此，sPD-1的檢測更簡單，檢測成本更低。這些結(jié)果提示sPD-1可作為膿毒癥嚴重程度的指標。 

譯稿：鄒穎華 林超

中西合璧述評：宋建鋼

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