Abstract

　　肥胖與腸道菌群失調(diào)和代謝內(nèi)毒素有關(guān)。君山銀針茶提取物（JSTE）可減少肥胖小鼠的脂肪堆積和體質(zhì)量。然而，JSTE在預(yù)防肥胖方面的作用和機(jī)制尚不清楚。因此，使用不同劑量的JSTE（75、150和300 mg/（kg·day））來評(píng)估干預(yù)8周下對(duì)高脂飲食（HFD）誘導(dǎo)的大鼠的影響。結(jié)果表明，JSTE可以顯著減少體質(zhì)量增加，血脂水平和脂肪堆積，改善肝組織的脂肪損傷。此外，JSTE增加了HFD大鼠腸緊密連接蛋白的表達(dá)，緩解了代謝性內(nèi)毒素血癥和慢性低度炎癥。糞便樣本測(cè)序表明，JSTE可有效逆轉(zhuǎn)HFD喂養(yǎng)大鼠的微生物多樣性和厚壁菌門與擬桿菌門的比例達(dá)到正常水平。與肥胖呈正相關(guān)的Desulfovibrioceae和Erysipelotrichaceae通過JSTE干預(yù)減少。而與肥胖呈負(fù)相關(guān)的Bifidobacteriaceae、Bacteroidaceae、Akkermansia和Clostridium則有所增加?？傊@些結(jié)果表明，JSTE可能通過調(diào)節(jié)HFD誘導(dǎo)的大鼠腸道菌群失調(diào)、腸道屏障功能障礙、代謝性內(nèi)毒素血癥和慢性低度炎癥來有效預(yù)防肥胖。

　　Introduction

　　肥胖被定義為可能損害健康的異?；蜻^度脂肪堆積。甘油三酯（TG）形式的長期不平衡能量儲(chǔ)存的攝入和消耗可能會(huì)增加脂肪組織和體質(zhì)量。肥胖已成為一個(gè)嚴(yán)重的全球健康問題，其患病率迅速增加。據(jù)報(bào)道，到2030年，全球超過50%的人口將肥胖。近年來，隨著人們飲食習(xí)慣的改變和生活水平的提高，營養(yǎng)過剩導(dǎo)致的單純性肥胖已成為肥胖的主要類型。肥胖的發(fā)展與代謝性疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如高脂血癥、糖尿病和非酒精性脂肪肝。肥胖一旦形成就很難控制。然而，目前常用的減肥藥和節(jié)食措施對(duì)身體的副作用更大，及早預(yù)防是控制肥胖的關(guān)鍵。

　　越來越多的研究支持這樣一個(gè)事實(shí)，即高脂肪飲食引起的肥胖與代謝性內(nèi)毒素血癥和腸道穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)。慢性低度炎癥是肥胖的關(guān)鍵機(jī)制，通過參與多個(gè)器官生理活動(dòng)的炎癥因子。此外，代謝性內(nèi)毒素血癥被認(rèn)為是慢性低度炎癥的主要原因，其特征是革蘭氏陰性菌衍生的血漿脂多糖（LPS）水平顯著升高。研究表明，肥胖小鼠的糞便移植改變了腸道微生物群的多樣性和類型，增加了腸道通透性和代謝內(nèi)毒素水平，導(dǎo)致慢性低度炎癥和肥胖。一項(xiàng)線性研究表明，移植來自健康供體的腸道微生物群可在6周內(nèi)改善肥胖志愿者的胰島素抵抗和產(chǎn)生丁酸鹽的微生物，這表明腸道微生物群可以被開發(fā)為調(diào)節(jié)人類胰島素敏感性的新候選者。此外，腸道微生物群和腸道之間共同進(jìn)化的腸道屏障形成了有效的防御，防止內(nèi)毒素轉(zhuǎn)移到體循環(huán)中。然而，高脂肪飲食會(huì)促進(jìn)革蘭氏陰性菌的數(shù)量，破壞腸道屏障并導(dǎo)致腸道通透性增加。大量穿透腸道的LPS結(jié)合觸發(fā)代謝性內(nèi)毒素血癥，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子表達(dá)，導(dǎo)致慢性低度炎癥和肥胖。

　　茶（Camellia sinensis）是世界上最受歡迎的三種飲料之一。根據(jù)其制造工藝和發(fā)酵程度可分為6類：未發(fā)酵綠茶、微發(fā)白茶、輕發(fā)酵黃茶、半發(fā)酵烏龍茶、全發(fā)酵紅茶、后發(fā)酵紅茶。許多研究表明，茶對(duì)肥胖的調(diào)節(jié)與腸道微生物群之間存在復(fù)雜的關(guān)系。

　　君山銀針茶是一種輕發(fā)酵茶，主要產(chǎn)于中國湖南省岳陽市。它是中國十大最著名的傳統(tǒng)茶之一。已有研究表明，君山銀針茶提取物（JSTE）可有效調(diào)節(jié)高脂飲食小鼠的血脂和肝脂肪變性。然而，這些研究主要集中在JSTE對(duì)肥胖的治療效果上，目前尚不清楚JSTE預(yù)防肥胖的作用和機(jī)制?？紤]到早期預(yù)防和腸道菌群對(duì)肥胖癥的重要性，建立了肥胖預(yù)防模型，以評(píng)估JSTE在調(diào)節(jié)高脂飲食大鼠中的療效和機(jī)制。

　　Results

　　JSTE對(duì)肥胖特征及食物能量利用的影響

　　干預(yù)8周后，JSTE對(duì)高脂飲食大鼠的影響如圖1所示。與ND組相比，HFD組的體質(zhì)量、Lee指數(shù)、肝臟重量、脂肪組織重量（附睪和腎周脂肪）、脂肪分?jǐn)?shù)和食物能量利用率顯著增加。然而，與HFD組相比，JSTE降低了體質(zhì)量、Lee指數(shù)、肝臟重量和脂肪組織重量、脂肪系數(shù)和食物利用率。特別是，HFD-M組和HFD-H組的肥胖特征幾乎逆轉(zhuǎn)到與ND組相同的水平。

　　圖1  補(bǔ)充JSTE對(duì)HFD誘導(dǎo)大鼠體質(zhì)量增加、食物能量利用和脂肪積累的影響

　　JSTE對(duì)血脂、空腹血糖和活體形態(tài)的影響

　　JSTE對(duì)高脂飲食大鼠脂質(zhì)、空腹血糖和活體形態(tài)的影響如圖2所示。與ND組相比，HFD治療大鼠血清TC、TG、LEP、ADP和空腹血糖水平顯著升高。但JSTE能有效降低高脂飲食大鼠血清TC、TG、LEP、ADP和空腹血糖水平，血清胰島素水平有一定降低但效果無顯著。此外，JSTE減弱了高脂飲食喂養(yǎng)大鼠肝臟中TC和TG的含量，表明JSTE對(duì)肝功能具有良好的保護(hù)作用。此外，H&E和油紅O染色結(jié)果顯示，ND組肝組織中幾乎沒有脂質(zhì)沉積和炎癥，而HFD組則觀察到大量脂質(zhì)和明顯的肝細(xì)胞氣球。有趣的是，JSTE補(bǔ)充劑可以以劑量依賴性方式緩解肝臟脂質(zhì)沉積和炎癥。

　　圖2  補(bǔ)充JSTE對(duì)HFD誘導(dǎo)大鼠脂質(zhì)、空腹血糖和活形態(tài)的影響

　　JSTE對(duì)結(jié)腸形態(tài)和杯狀細(xì)胞的影響

　　腸道完整性對(duì)腸道穩(wěn)態(tài)有重要影響。結(jié)腸的代表性H&E和PAS染色切片如圖3L所示。H&E染色結(jié)果顯示，ND組結(jié)腸病理形態(tài)正常，無炎癥和損傷。HFD組的結(jié)腸在黏膜和黏膜下層顯示出廣泛的炎癥浸潤和水腫。然而，JSTE減輕了HFD誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)損傷。結(jié)腸形態(tài)學(xué)評(píng)分顯示，JSTE可以劑量依賴性地減輕炎癥的嚴(yán)重程度（圖3A）。此外，HFD喂養(yǎng)大鼠結(jié)腸的PAS染色顯示，與ND組相比，杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯減少，而JSTE干預(yù)明顯增加了杯狀細(xì)胞密度（圖3B）。

　　圖3  補(bǔ)充JSTE對(duì)HFD誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸形態(tài)、杯狀細(xì)胞、炎癥和緊密連接蛋白的影響

　　JSTE對(duì)腸道炎癥和內(nèi)毒素的影響

　　JSTE對(duì)腸道炎癥的影響如圖3C和D所示。八周的HFD治療顯著增加了TLR4的水平，降低了IL-10的水平。JSTE顯著降低TLR4水平，增加IL-10水平。此外，還在圖3E中檢測(cè)到血清內(nèi)毒素含量。與ND組相比，HFD干預(yù)顯著提高了血清LPS水平。而JSTE以劑量依賴性方式顯著降低血清LPS水平。

　　JSTE對(duì)腸緊密連接蛋白表達(dá)的影響

　　具有代表性的免疫熒光切片顯示了腸緊密連接蛋白 ZO-1 和閉合蛋白的表達(dá)（圖3M）。與ND組相比，長期高脂飲食導(dǎo)致大鼠ZO-1和閉合素的相對(duì)表達(dá)顯著降低。然而，JSTE劑量依賴性地增加了高脂肪飲食大鼠中ZO-1的相對(duì)表達(dá)。此外，HFD-M和HFD-H的干預(yù)顯著增加了閉塞蛋白的相對(duì)表達(dá)（圖3J和K）。這些結(jié)果表明，JSTE在蛋白表達(dá)水平上促進(jìn)了腸道屏障功能。

　　JSTE對(duì)血清炎性細(xì)胞因子的影響

　　與ND組相比，高脂飲食大鼠促炎因子TNF-α、IL-6和PAI-1的血清濃度顯著升高，抗炎因子IL-10顯著降低（圖3F-I）。然而，JSTE可以有效地逆轉(zhuǎn)高脂飲食誘導(dǎo)的血清TNF-α、IL-6和PAI-1水平升高至ND組的水平。此外，高劑量JSTE干預(yù)顯著增加了高脂肪飲食大鼠抗炎因子IL-10的血清水平。

　　JSTE對(duì)腸道菌群的影響

　　為了研究JSTE對(duì)高脂飲食大鼠腸道菌群的影響，使用16S rRNA基因進(jìn)行測(cè)序分析。各組樣品的稀釋曲線趨于平坦，表明測(cè)序深度基本覆蓋了樣品中所有物種，測(cè)序結(jié)果可用于后續(xù)腸道微生物多樣性分析。使用Shannon和Simpson指數(shù)對(duì)腸道微生物群進(jìn)行α多樣性分析。HFD組的Shannon指數(shù)較ND組顯著下降。雖然辛普森指數(shù)在一定程度上增加，但沒有顯著影響（圖4A）。然而，在JSTE的干預(yù)下，各組的Shannon和Simpson指數(shù)發(fā)生了不同程度的變化。特別是，高劑量JSTE組的Simpson指數(shù)顯著降低。此外，β多樣性的偏最小二乘判別分析（PLS-DA）顯示，ND組的腸道菌群與HFD組的腸道菌群有顯著的分離趨勢(shì)，而JSTE干預(yù)組與HFD組的腸道菌群有顯著的分離趨勢(shì)，并且接近ND組（圖4B）。這些結(jié)果表明，JSTE可以有效改善大鼠高脂肪飲食的腸道微生物多樣性。

　　圖4  補(bǔ)充JSTE調(diào)節(jié)HFD誘導(dǎo)大鼠的腸道菌群多樣性和組成

　　為了進(jìn)一步探討JSTE對(duì)高脂飲食大鼠腸道微生物結(jié)構(gòu)的影響，分析了腸道微生物在門水平上的變化（圖4C）。分類結(jié)果表明，厚壁菌門、擬桿菌門、疣菌門和放線菌門是優(yōu)勢(shì)菌門。與ND組相比，HFD組厚壁菌門的相對(duì)豐度增加，而擬桿菌門的相對(duì)豐度顯著降低（圖4D）。高劑量JSTE干預(yù)顯著降低厚壁菌門的相對(duì)豐度，增加擬桿菌門的相對(duì)豐度。同時(shí)，JSTE補(bǔ)充劑顯著降低了F/B。此外，不同劑量的JSTE不同程度地增加了HFD喂養(yǎng)大鼠放線菌的相對(duì)豐度。

　　在高脂飲食的干預(yù)下，Ruminococcaceae、Clostridiaceae、Verrucomicrobiaceae、Bacteroidaceae、Bifidobacteriaceae和Lactobacillaceae的相對(duì)豐度呈不同程度的下降趨勢(shì)，而Peptostreptococcaceae、Erysipelotrichaceae和Helicobacteraceae的相對(duì)豐度則有所增加。然而，JSTE可顯著降低瘤Ruminococcaceae、Erysipelotrichaceae和Desulfovibrioceae的相對(duì)豐度，顯著增加高脂飲食大鼠Peptostreptococcaceae和Bifidobacteriaceae的相對(duì)豐度。屬水平分類結(jié)果顯示，主要細(xì)菌為Akkermansia、Blautia、Clostridium、Bacteroides、Dorea和Ruminococcus。高脂肪飲食改變了大鼠的腸道微生物組成，JSTE部分恢復(fù)了被HFD破壞的腸道微生物的健康組成（圖4E）。

　　為了進(jìn)一步確定哪些細(xì)菌可能導(dǎo)致肥胖，對(duì)相對(duì)豐度最高的250個(gè)ASV進(jìn)行了LDA，以獲得每組中的主要ASV（圖5A）。熱圖顯示5組68種優(yōu)勢(shì)ASV，表明JSTE可以不同程度地改變高脂飲食大鼠細(xì)菌的相對(duì)豐度。JSTE干預(yù)后，高脂飲食大鼠15個(gè)ASVs幾乎逆轉(zhuǎn)至ND組相同水平，其中7個(gè)ASV屬于Lachnospiraceae（ASV0013、ASV0030、ASV0050、ASV0099、ASV0132、ASV148和ASV176），3個(gè)ASV屬于Ruminococcaceae（ASV0049、ASV0092和ASV0151），2個(gè)ASV屬于Erysipelotrichaceae（ASV0147和ASV0226）。為了探究腸道微生物與身體肥胖指標(biāo)之間的關(guān)系，對(duì)前50個(gè)屬和肥胖指標(biāo)進(jìn)行了Spearman相關(guān)性分析（圖5B）。結(jié)果顯示，19個(gè)細(xì)菌屬與肥胖指標(biāo)呈顯著正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。

　　圖5  （A）根據(jù)LEfSe分析，JSTE干預(yù)改變了腸道菌群組成；（B）屬水平理化指標(biāo)與腸道菌群群落之間的Spearman相關(guān)性

　　為了進(jìn)一步了解不同治療組之間具有顯著差異的功能，本研究基于京都基因和基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫，通過PICRUSt軟件對(duì)腸道微生物功能進(jìn)行了注釋。采用STAMP軟件分析JSTE處理組和HFD組在P＜0.05水平下的預(yù)測(cè)結(jié)果。與HFD組的比較顯示，HFD-L、HFD-M和HFD-H干預(yù)后，21條（12條增加，9條減少）、2條（1條增加，1條減少）和30條（17條增加，13條減少）代謝途徑發(fā)生明顯改變，主要包括LPS生物合成、糖胺聚糖降解、鞘脂代謝和次級(jí)膽汁酸生物合成代謝。因此，補(bǔ)充JSTE可以改變高脂肪飲食大鼠的腸道菌群功能（圖6）。

　　圖6  JSTE對(duì)PICRUSt預(yù)測(cè)的微生物群落功能的影響

　　Conclusion

　　研究表明，JSTE可以顯著降低HFD誘導(dǎo)的大鼠體質(zhì)量增加、血脂水平和脂肪堆積，改善肝組織脂肪損傷，增加腸道緊密連接蛋白的表達(dá)，緩解腸道炎癥和代謝性內(nèi)毒素血癥，抑制慢性低度炎癥。此外，JSTE可以有效調(diào)節(jié)腸道微生物的多樣性和結(jié)構(gòu)組成。某些類型的細(xì)菌，包括Bifidobacteriaceae、Bacteroidaceae、Akkermansia和Clostridium，這些細(xì)菌與肥胖呈負(fù)相關(guān)，在JSTE干預(yù)下有效增加。此外，Desulfovibrioceae和Erysipelotrichaceae與肥胖呈正相關(guān)，JSTE顯著降低。

Junshanyinzhen tea extract prevents obesity by regulating gut microbiota and metabolic endotoxemia in high-fat diet fed rats

　　Jian Ouyang

　　a,b,c

　　, Xiuping Li

　　a,b,c

　　, Changwei Liu

　　a,b,c

　　, Danmin Lu

　　a,b,c

　　, Jie Ouyang

　　a,b,c

　　, Fang Zhou

　　a,b,c

　　, Qi Liu

　　a,b,c

　　, Jianan Huang

　　a,b,c,d,*

　　, Zhonghua Liu

　　a,b,c,d,*

a

Key Laboratory of Tea Science of Ministry of Education, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

b

National Research Center of Engineering Technology for Utilization of Functional Ingredients from Botanicals, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

c

Co-Innovation Center of Education Ministry for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

d

Key Laboratory for Evaluation and Utilization of Gene Resources of Horticultural Crops, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

　　*Corresponding author.

Abstract

　　Obesity is associated with gut dysbiosis and metabolic endotoxin. Junshanyinzhen tea extract (JSTE) reduced fat accumulation and body weight in obese mice. However, the effects and mechanism of JSTE in preventing obesity were unclear. Therefore, we used different doses of JSTE (75, 150 and 300 mg/(kg·day)) to evaluate the effect on high-fat diet (HFD) -induced rats under 8 weeks of intervention. Here, our results showed that JSTE could significantly reduce body weight gain, blood lipid levels and fat accumulation, improve fatty damage in liver tissue (PP P P Akkermansia, andClostridium, which are negatively related to obesity, were increased. Together, these results suggested that JSTE might effectively prevent obesity by modulating gut microbiota dysbiosis, intestinal barrier dysfunction, metabolic endotoxemia and chronic low-grade inflammation in HFD-induced rats.

　　Reference:

　　OUYANG J, LI X P, LIU C W, et al. Junshanyinzhen tea extract prevents obesity by regulating gut microbiota and metabolic endotoxemia in high-fat diet fed rats[J]. Food Science and Human Wellness, 2024, 13(4): 2036-2047. DOI:10.26599/FSHW.2022.9250169.

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