編輯：微科盟小編、江舜堯。

導(dǎo)讀   

目前，炎癥性腸病 （ IBD） 由于發(fā)病率高且治愈率低，現(xiàn)已成為全球公共衛(wèi)生問題。雖然該病的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但腸道微生物群與炎癥信號之間存在的潛在關(guān)聯(lián)已被建立，可以成為研究 和防治 該病的切入點(diǎn)。益生菌，尤其是乳酸桿菌 和 雙歧桿菌，由于其安全有效性且強(qiáng)大的菌群調(diào)控能力，最近成為IBD的治療熱點(diǎn)。但是大多數(shù)研究對于多菌株組合與其代謝產(chǎn)物對IBD作用的評估還很少被報(bào)道。   

2022 年6月2 2 日， 謝黎煒研究員（華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、 廣東省科學(xué)院微生物研究所， 腸道微生態(tài)與健康團(tuán)隊(duì)PI） 及其所帶領(lǐng)的實(shí)驗(yàn)室團(tuán)隊(duì) ，在Microbiology Spectrum期刊上發(fā)表了題為“Probiotic Consortia and Their Metabolites Ameliorate the   Symptoms of Inflammatory Bowel Diseases in a Colitis Mouse   Model”的文章 ， 該研究報(bào)道了實(shí)驗(yàn)室自主分離的本土益生菌菌株參與抑制腸道炎癥和恢復(fù)腸道微環(huán)境的功效 ，其中，與對照組及單菌株處理組相比， 羅伊氏乳桿菌、格氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌和乳雙歧桿菌的 微生態(tài)制劑或其發(fā)酵代謝產(chǎn)物 聯(lián) 用 在抑制 結(jié)腸炎模型的腸道炎 癥和加速 炎癥以及腸道微環(huán)境恢 復(fù)方面具有 獨(dú)特 的效果。 該研究的發(fā)現(xiàn)支持該混合益生菌專利菌株及其代謝物聯(lián)用，輔助治療IBD 的新方法和新策略。  

論文ID

原名：Probiotic Consortia and Their Metabolites Ameliorate the Symptoms of Inflammatory Bowel Diseases in a Colitis Mouse Model

譯名：益生菌組合與其代謝產(chǎn)物改善結(jié)腸炎小鼠模型中炎癥性腸病的癥狀

期刊：Microbiology Spectrum

IF：9.043

發(fā)表時(shí)間：2022.6

通訊作者：謝黎煒

通訊作者單位：華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、廣東省科學(xué)院微生物研究所

DOI號：10.1128/spectrum.00657-22

前言

IBD是發(fā)生在胃腸道內(nèi)的慢性非特異性炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病兩種疾病類型 ，大部分患者的臨床表現(xiàn)為腹痛，腹瀉，血便，肛周病變，伴有體重降低，營養(yǎng)不良等 。IBD易反復(fù)發(fā)作，難以治愈且有很大風(fēng)險(xiǎn)會(huì)發(fā)展為結(jié)直腸癌（Colorectal cancer ,  CRC），雖然通常被認(rèn)為是西方國家常見的腸道炎癥性疾病，但近年來，在發(fā)展中國家，該病的發(fā)病率正在加速上升，嚴(yán)重增加 患者的 疾病負(fù)擔(dān)及損害生活質(zhì)量 。

IBD的確切發(fā)病原因至今仍不明確，但已有較多證據(jù)認(rèn)為，該病是基因，環(huán)境多方面復(fù)雜因素共同作用的結(jié)果，同時(shí)，持續(xù)的腸道感染、腸黏膜免疫調(diào)節(jié)異常和腸道微生物群失調(diào)對IBD的發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān)。

其中，腸道微生物群被報(bào)道出是疾病進(jìn)展的關(guān)鍵因素之一，結(jié)腸炎個(gè)體的腸道菌群組成（類型和數(shù)量）與健康個(gè)體不同，會(huì)激活宿主免疫反應(yīng)，這會(huì)增加腸道的通透性并破壞腸黏膜的屏障結(jié)構(gòu)，進(jìn)而破壞共生微生物并激活嚴(yán)重的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致 疾病 反復(fù)發(fā)作 。 

眾所周知，益生菌是定植于人體腸道以對腸道產(chǎn)生有益影響的活微生物，作為益生菌的兩個(gè)主要屬，雙歧桿菌和乳酸桿菌由于能介導(dǎo)短鏈脂肪酸的形成也被報(bào)道出對IBD和 C RC癥狀的改善具有潛在益處 。

除此之外，乳酸桿菌和雙歧桿菌還能通過增加健康益生菌對腸粘膜的粘附、抑制病原體粘附在粘膜表面、競爭性排除病原微生物、產(chǎn)生抗菌物質(zhì)和調(diào)節(jié)免疫功能來重建腸道共生及保護(hù)腸道粘膜 。而本次研究所用的益生菌 專利菌株 包括羅伊氏乳桿菌，格氏乳桿菌，嗜酸乳桿菌和乳雙歧桿菌 ， 它們分別屬于乳桿菌屬和雙歧桿菌屬，該菌混合制劑配方符合國家食品添加標(biāo)準(zhǔn)。盡管已有研究證明這四種菌在宿主體內(nèi)具有積極作用。然而，該菌及其代謝產(chǎn)物在葡聚糖硫酸鈉（Dextran Sulfate Sodium ,  DSS）誘導(dǎo)結(jié)腸炎中的綜合作用尚未清晰地評估比較，潛在的機(jī)制也仍須進(jìn)一步闡明。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

本研究采用14周齡小鼠建立DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型，實(shí)驗(yàn)周期為14天。根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件將小鼠分為7組：CONTROL, control group; MIX, probiotic consortia; LR1, Lactobacillus reuteri PLBK?1 group; LR2, Lactobacillus reuteri PLBK?2 group; LG, Lactobacillus gasseri PLBK?3 group; LA, Lactobacillus acidophilus PLBK?4 group; BL, Bifidobacterium lactis PLBK?5 group。

其中，6組實(shí)驗(yàn)組的小鼠需要每天灌胃相對應(yīng)的單菌株或者益生菌混合制劑，在整個(gè)益生菌干預(yù)實(shí)驗(yàn)過程中，每天記錄體重、糞便硬度變化、血便情況等實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，另外，在第8天和第14天需要收集糞便進(jìn)行16S rRNA測序，小鼠處死后還需要收集結(jié)腸組織以便進(jìn)行后續(xù)蘇木精和伊紅（Hematoxylin and eosin, H&E）染色和免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry, IHC）實(shí)驗(yàn)（圖1A）。通過分析發(fā)現(xiàn)益生菌制劑減輕了小鼠結(jié)腸炎的病理癥狀。與對照組相比，MIX組能改善DSS引起的結(jié)腸縮短（圖1B）,減輕了體重的變化波動(dòng)（圖1C）并顯著降低了疾病活動(dòng)指數(shù)（Disease Activity Index, DAI）的評分（圖1D），另外，可以觀察出單菌株組對于體重變化和DAI評分的降低效果不如MIX組顯著（圖1）。

  圖1 益生菌制劑可緩解 DSS 誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的病理癥狀。

對結(jié)腸切片進(jìn)行H&E染色以評估結(jié)腸粘膜損傷情況，從對照組的結(jié)腸切片可發(fā)現(xiàn)腸道結(jié)構(gòu)和屏障發(fā)生了破損。相比之下，益生菌制劑的處理對結(jié)腸具有保護(hù)作用，且組織學(xué)評分也顯著較低。另外，盡管在單菌株組中仍可以觀察到炎癥，但是大部分的隱窩結(jié)構(gòu)是正常的，尤其在LA組，表現(xiàn)為較低的結(jié)腸病理學(xué)評分（圖2A）。進(jìn)一步利用免疫組化，以檢測與炎癥有關(guān)的巨噬細(xì)胞標(biāo)志物-F4/80，處理結(jié)果與H&E染色結(jié)果一致，與對照組相比，MIX組的F4/80水平明顯降低（圖2B），表明先天免疫細(xì)胞向結(jié)腸的浸潤減少。

  圖2 益生菌制劑保護(hù)DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型的腸道結(jié)構(gòu)并抑制巨噬細(xì)胞的浸潤。 

將糞便樣本進(jìn)行16S rRNA測序以探究益生菌菌株對結(jié)腸炎腸道菌群的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不同的實(shí)驗(yàn)時(shí)期，7組腸道微生物群的組成在物種水平上存在差異 （圖 3A-B ） ， 且與對照組相比， M IX組在第8天的Simpson指數(shù)顯著不同，而其他單菌株組則無顯著差異 （圖 3C ）， 表明 益生菌制劑干預(yù)能對群落組成和多樣性產(chǎn)生影響，從而進(jìn)一步加速了炎癥的恢復(fù)。此外，無論在第八天還是14天，β多樣性都顯示出，對照組和 M IX 組 的腸道微生物群被明確地分為兩個(gè)集群，而第八天單菌株組的差異則不顯著 （圖 3E-H ） ，這些結(jié)果表明，與單菌株相比， 益生菌制劑 處理對腸道炎癥持續(xù)期和恢復(fù)期的腸道菌群都具有調(diào)節(jié)作用。且對照組和MIX組在兩個(gè)階段也顯示出明顯不同的細(xì)菌成分組成 （圖 3I-J ）。

  圖3 益生菌制劑重構(gòu)腸道微生物群的組成。

除此之外，為了在腸道炎癥期間進(jìn)一步識別起作用的微生物標(biāo)志物，該研究主要對MIX組和對照組分別在第8天和第14天采取隨機(jī)森林結(jié)合5倍交叉驗(yàn)證算法（Random forest analysis and 10 trials of 5-fold cross-validation, RFCV）來進(jìn)一步識別特征細(xì)菌（圖4A, C）。分析后發(fā)現(xiàn)有顯著差異的菌為11株，在8天有7株菌（圖4B），在第14天有4株菌（圖4D），其中，有8株菌株在單菌株組中并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（補(bǔ)充圖），這些數(shù)據(jù)表明，益生菌制劑極有可能通過對腸道微環(huán)境的特異性調(diào)節(jié)而發(fā)揮綜合作用。 為探究對照組和MIX組中菌群與表型之間的相互作用，還分析了共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過RFCV篩選出來的4株關(guān)鍵菌在三個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖中均可發(fā)現(xiàn)，且第8天顯示較為復(fù)雜的互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系（圖4E-G），提示這4株關(guān)鍵菌在益生菌制劑調(diào)控腸道微生態(tài)和疾病表型中的重要性。

圖4 通過隨機(jī)森林鑒別結(jié)腸炎小鼠模型中的標(biāo)志性腸道微生物群。

考慮到益生菌制劑除平衡腸道菌群之外，還能產(chǎn)生大量的代謝物并被腸上皮細(xì)胞吸收，為了進(jìn)一步探究該益生菌制劑的代謝產(chǎn)物對結(jié)腸炎的影響，該研究將未純化的益生菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物應(yīng)用于結(jié)腸炎模型。由于益生菌制劑的效果優(yōu)于單菌株，因此代謝產(chǎn)物干預(yù)僅對照和混合代謝物兩組：對照組和混合代謝產(chǎn)物的MIX組。并在第14天收集小腸（Small intestine, SI）內(nèi)容物（圖5A）。

分析發(fā)現(xiàn)，對照組由于DSS處理，導(dǎo)致了結(jié)腸縮短（圖5B），體重變化較大（圖5C），而混合代謝產(chǎn)物則明顯降低了DAI評分（圖5D），提高了生存率（圖5E）。同時(shí)，在對照組中，H&E染色和IHC的結(jié)果顯示出DSS處理引發(fā)了隱窩損失、粘膜破壞以及F480的表達(dá)增多（圖5F-G），而這些情況在經(jīng)過混合代謝產(chǎn)物的干預(yù)后都得到了明顯的緩解。另外，通過對比益生菌干預(yù)實(shí)驗(yàn)的表性結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)益生菌制劑比混合代謝物更能有效地減輕體重?fù)p失和粘膜損傷。

  圖5 混合代謝物減輕結(jié)腸炎小鼠模型的結(jié)腸損傷。

為探究代謝物處理對微生物群的調(diào)節(jié)作用，該研究還對混合代謝產(chǎn)物干預(yù)中收集的糞便進(jìn)行16S rRNA測序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在第14天，兩組結(jié)腸糞便樣本的多樣性及在益生菌干預(yù)中篩選出的關(guān)鍵菌同樣都沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖6A-D），另外，共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)圖也顯示出關(guān)鍵菌在網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中大多表現(xiàn)為孤立的點(diǎn)（圖6E-G）。提示混合代謝產(chǎn)物對結(jié)腸菌群調(diào)節(jié)的能力較小，同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，近端小腸是微生物代謝物吸收的主要場所[12,13]，因此假設(shè)混合代謝物可能更有效地影響小腸中的細(xì)菌。為了驗(yàn)證此猜想，本研究對小腸內(nèi)容物進(jìn)行了16S rRNA測序，發(fā)現(xiàn)MIX組和對照組的β多樣性存在顯著性差異（圖6H）。對核心菌群的熱圖分析發(fā)現(xiàn)兩組中的菌群存在明顯不同（圖6I）。這些結(jié)果支持該假設(shè)，即混合代謝物顯著改變了小腸的細(xì)菌組成和結(jié)構(gòu)。

  圖6 在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型中，混合代謝物干預(yù)在特異性調(diào)節(jié)腸道微生物方面次于益生菌制劑。 

總體而言， 目前的 研究證明，羅伊氏乳桿菌 PLBK ? 1，羅伊氏乳桿菌 PLBK ? 2,格氏乳桿菌 PLBK ? 3，嗜酸乳桿菌 PLBK ? 4和乳雙歧桿菌 PLBK ? 5的 混合 益生菌制劑 干預(yù) 可減輕結(jié)腸炎腸道炎癥，通過對腸道細(xì)菌水平的調(diào)控使結(jié)腸炎小鼠失調(diào)的微生物群組成和功能得以改善，且證明了腸道菌群和結(jié)腸炎表型之間具有復(fù)雜的相關(guān)性。為益生菌 在 維持腸道健康方面提供新見解，并將促進(jìn)IBD和其他炎癥性疾病的預(yù)防和治療策略的發(fā)展。 五株專利菌株的微生態(tài)制劑產(chǎn)品（白云山和黃藥業(yè)聯(lián)合出品的三高伴侶 ? 微生態(tài)制劑），目前在新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院消化科正在開展IBD和UC患者的微生態(tài)直接臨床干預(yù)研究（倫理編號：[ 2001]倫科快審字 (23)號 ）。  

本研究的主要完成人，第一作者 許莉敏 是 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院的碩士研究生 ；共同第一作者劉秉東是暨南大學(xué)第一附屬醫(yī)院精神醫(yī)學(xué)科潘集陽教授與華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室謝黎煒研究員聯(lián)合培養(yǎng)博士研究生； 黃柳菁是南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院婦產(chǎn)科馬穎教授與 華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室謝黎煒研究員聯(lián)合培養(yǎng) 碩 士研究生 ；李澤 是 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院的在讀碩士研究生 ；本文的通訊作者為 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院特聘教授、碩士生導(dǎo)師， 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科特聘教授 、博士生導(dǎo)師 ，廣東省科學(xué)院微生物研究所、華南應(yīng)用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、腸道微生態(tài)與健康團(tuán)隊(duì)PI謝黎煒研究員。 

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