NOX4 functions as a mitochondrial energetic sensor coupling cancer metabolic reprogramming to drug resistance Nat Commun. 2017 Oct 19;8(1):997. doi: 10.1038/s41467-017-01106-1 IF=12.124

NOX4作為線粒體能量感應(yīng)器，將腫瘤代謝重編程和治療耐藥聯(lián)系起來。cancer metabolic reprogramming腫瘤代謝重編程，是新近關(guān)于腫瘤代謝的新名詞，是指腫瘤細胞糖代謝主要以無氧糖酵解為主，不同于正常細胞有氧氧化磷酸化的產(chǎn)生ATP的高效率（32個ATP），無氧糖酵解只能產(chǎn)生少量的ATP（2個）和產(chǎn)生大量乳酸，消耗大量能量。不明白為什么腫瘤細胞采取效率更低下的無氧糖酵解，只好給它命名warburg效應(yīng)。

沃伯格效應(yīng)(Warburg effect) 是由德國生物化學(xué)家奧托·沃伯格(Otto Warburg,1883～1970）于1930年發(fā)現(xiàn)的。腫瘤細胞產(chǎn)生能量的方式極為特別: 健康細胞依靠線粒體氧化糖類分子釋放出有用的能量, 而大多數(shù)腫瘤細胞則通過通過產(chǎn)能率相對較低糖酵解作用為自身供能。這種作用機制不需要氧氣也不需要線粒體參與。惡性，生長迅速的腫瘤細胞通常的糖酵解率比他們的正常組織高達200倍。這種情況，即使在氧氣充足的條件下也會發(fā)生。奧托華寶推測這種變化的代謝是癌癥的根本原因。

warburg效應(yīng)示意圖：正常組織在有氧條件下都通過線粒體的氧化磷酸化代謝葡萄糖，而腫瘤細胞和增生較快速的組織，即使在有氧的條件下，也通過糖酵解的方式代謝，產(chǎn)生大量乳酸和少量ATP。

NOX4，作為NADPH氧化酶（一種ATP-biding motif） 內(nèi)一個亞基，論文結(jié)果顯示當(dāng)ATP與motif結(jié)合的時候，會影響NOX4的活性。那么NOX4的功能是什么？它是如何影響化療耐藥的呢？

線粒體內(nèi)NOX4可以產(chǎn)生ROS，無氧糖酵解產(chǎn)生大量活性氧自由基（ROS），ROS會影響腫瘤細胞的增生和凋亡。調(diào)節(jié)NOX4上下游的位點需要進一步研究。

細胞模型：renal cell carcinoma腎細胞癌，腎癌多由于von Hippel–Lindau (VHL) 基因的突變?nèi)笔?。腎癌對化療藥物非常不敏感，天然的耐藥細胞模型。

786-O腎癌模型，stably transfected with shVector and shNOX4，利用shNOX敲減細胞模型內(nèi)NOX4的表達水平。

A498腎癌模型，transiently transfected with Scr and siNOX4，瞬時抑制NOX4表達水平。

檢測方法：上述細胞模型給予依托泊苷藥物處理后，檢測細胞凋亡情況，細胞凋亡的檢測Annexin V staning、細胞流式儀、western檢測cleaved PRAP（PARP又是細胞凋亡核心成員胱天蛋白酶(caspase)的切割底物）。

抑制細胞內(nèi)NOX4后，細胞凋亡比率明顯升高，同時裂解的PARP也增多，提示凋亡增多。癌細胞內(nèi)NOX4活性較高，對依托泊苷耐藥。

除此之外，還對下述問題進行簡答：

1、是線粒體內(nèi)的NOX4導(dǎo)致的耐藥嗎？NOX4在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細胞核和細胞膜都有定位，到底是哪兒的NOX4介導(dǎo)的耐藥。

專門針對線粒體NOX4的干擾方法：利用mitotempol藥物處理細胞，專門清除掉線粒體超氧化酶，包括NOX4。然后在檢測依托泊苷處理細胞后凋亡情況。

2、線粒體內(nèi)ATP水平會影響耐藥嗎？因為之前結(jié)果顯示ATP增多會抑制NOX4活性。

調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)ATP的方法：786-O培養(yǎng)液中加入半乳糖會增加線粒體內(nèi)ATP；VHL轉(zhuǎn)染缺失VHL的腎癌細胞會增加其線粒體內(nèi)的ATP水平。

3、NOX4在ATP介導(dǎo)的耐藥過程中是充分必要條件嗎？whether NOX4 is neccesary and sufficient to mediated drug Resistance。

設(shè)計突變的NOX4，使得ATP不能與其結(jié)合，觀察ATP對耐藥的影響。與雙熒光素酶實驗異曲同工。

動物模型：裸鼠移植瘤模型，上述細胞水平的細胞模型，注射與裸鼠皮下，成瘤后，給予依托泊苷化療，觀察瘤體體積的變化。

786-O轉(zhuǎn)染shVector的細胞注射于裸鼠左側(cè)腹部皮下，5周后成瘤，測量體積。

786-O轉(zhuǎn)染shNOX4的細胞注射于裸鼠右側(cè)腹部皮下，……。

檢測方法：成瘤模型成功后，給予依托泊苷化療4天，每天測量瘤體體積共8天。以8天的體積比上化療前體積，作為最后顯示數(shù)值。同時為了驗證主要是因為凋亡增加，而不是增生減弱，還檢測的凋亡指標(biāo)：cleaved PRAP（western）和cleaved caspase-3（免疫組化）。

a圖顯示抑制NOX4后腫瘤體積不再增加，b和C檢測了凋亡相關(guān)指標(biāo)cleaved PRAP和caspase-3。動物實驗水平證實NOX4影響化療耐藥。

取腎癌組織和周圍正常組織，分離線粒體，檢測線粒體內(nèi)NOX4表達水平，腎癌組織與正常組織相比，NOX4表達升高。

共取了4例腎癌和周圍正常組織，檢測其線粒體內(nèi)NOX4，癌組織線粒體中NOX4明顯增高。

細胞模型（ex vivo實驗）：腎癌原代細胞模型，取腎癌組織，分離原代細胞進行培養(yǎng)，然后利用siNOX4瞬時抑制細胞內(nèi)NOX4表達水平。給予多柔比星后，測定細胞凋亡情況。

3例腎癌患者癌細胞原代培養(yǎng)，siRNA干擾NOX4后，給予多柔比星，觀察細胞凋亡。注意分組情況，四組。

PKM2：丙酮酸激酶2，參與糖酵解的最后一步，既往顯示其與腫瘤細胞的生長和凋亡相關(guān)。推測PKM2可能為NOX4調(diào)節(jié)的靶基因。

1、PKM2是否調(diào)節(jié)藥物治療敏感性：siPKM2抑制786-O和A498細胞PKM2，細胞對化療藥物誘導(dǎo)的凋亡增加，assembly shNOX4。

2、PKM2是否被NOX4調(diào)節(jié)：PKM2表達在shNOX4抑制NOX4后，明顯降低。

3、NOX4是否通過抑制PKM2的乙?；?，保護PKM2被降解：背景PKM2常常被乙?；?，然后溶酶體吞噬消化乙?；腜KM2。shNOX4抑制786-O細胞后，檢測PKM2乙酰化狀態(tài)，乙酰化的PKM2明顯增多，乙酰化的PKM2可以通過乙?；贵w檢測。

4、PKM2是否是被溶酶體吞噬消化降解：采用溶酶體降解抑制劑3-M抑制細胞內(nèi)溶酶體降解通路，觀察PKM2被降解減少，殘留PKM2增多。

5、溶酶體降解既然參與PKM2的降解，且PKM2是調(diào)節(jié)化療藥物的敏感性，那么溶酶體通路是否會影響到化療耐藥呢？shNOX4的786-O細胞對依托泊苷藥物敏感，但是如果用3-M抑制溶酶體降解通路后，其對依托泊苷敏感性明顯下降。（因為PKM2滯留）

6、PKM2被乙酰化酶PACF在K350位點乙?；缓蟊蝗苊阁w降解。那么乙酰化酶PACF是否影響腎癌細胞的化療耐藥: a、 siPACF干擾786-O細胞PACF的表達，給予依托泊苷后，檢測細胞凋亡變化，凋亡減少，出現(xiàn)耐藥，且檢測細胞內(nèi)PKM2表達增高。b、突變PACF乙酰化位點K450R（賴氨酸-精氨酸），乙?；窹ACF不能發(fā)揮作用，shNOX4的786-O細胞，對依托泊苷敏感性增強，當(dāng)轉(zhuǎn)染PKM-K350R，對藥物敏感性恢復(fù)耐藥。

我會怎么做：將細胞模型與或不與ATP共培養(yǎng)，觀察線粒體NOX4功能變化，其中線粒體NOX4生物功能為產(chǎn)生ROS，那么檢測加不加ATP后ROS的產(chǎn)生量，即可驗證ATP調(diào)控NOX4。

作者1、明確NOX4定位在線粒體、2、線粒體有脂質(zhì)體雙層膜，NOX4是位于內(nèi)膜還是外模、3、NOX4是否影響ROS的產(chǎn)生、4、最后才是ATP是否影響ROS的產(chǎn)生。

如何將細胞內(nèi)ATP含量、NOX4活性和ROS聯(lián)系起來？癌細胞由于wanburg效應(yīng)，采用細胞漿內(nèi)糖酵解的能量代謝方式，而不是采用在線粒體內(nèi)氧化磷酸化，由于產(chǎn)能較低，細胞內(nèi)ATP水平下降，線粒體內(nèi)NOX4感受不到ATP的刺激，活性增強，ROS產(chǎn)生增多。而NOX4活性增強，會保護PKM2被溶酶體降解，最終PKM2抑制細胞凋亡，導(dǎo)致藥物耐藥。

示意圖最終解釋所有實驗內(nèi)容。

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