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【導讀】胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）和葡萄糖依賴性促胰島素肽（GIP）來源于腸內(nèi)分泌細胞（EEC），是對血糖調(diào)節(jié)至關重要的關鍵腸促胰島素激素。GLP-1類似物和GLP-1受體激活劑的藥物廣泛用于治療2型糖尿病（T2D）和肥胖癥。在本研究中，團隊發(fā)現(xiàn)了KCNH2鉀通道在調(diào)節(jié)腸促胰島素分泌中的關鍵作用，推進了科學界對腸促胰島素調(diào)節(jié)的理解，為潛在的腸促胰島素促分泌素療法治療糖尿病和肥胖癥鋪平了道路。

2024年8月12日，首都醫(yī)科大學附屬同仁醫(yī)院楊金奎團隊在期刊《Signal Transduction and Targeted Therapy》上發(fā)表了題為“Potassium voltage-gated channel subfamily H member 2 (KCNH2) is a promising target for incretin secretagogue therapies”的研究論文。本研究表明了KCNH2通道在調(diào)節(jié)EEC分泌腸促胰島素方面的關鍵作用?？紤]到腸促胰島素在食欲控制和葡萄糖代謝中的關鍵作用，KCNH2成為治療肥胖和糖尿病的一個有前途的新靶點。

https://www.nature.com/articles/s41392-024-01923-z

研究介紹

01

胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）和葡萄糖依賴性促胰島素肽（GIP）分別來源于腸內(nèi)分泌L細胞和K細胞，通過增強胰島β細胞分泌葡萄糖依賴性胰島素，作為腸促胰島素激素發(fā)揮關鍵作用。K細胞位于十二指腸中，而L細胞位于回腸和結(jié)腸中，它們的頂端表面直接暴露在腸腔中，使它們能夠感知管腔營養(yǎng)物質(zhì)，并釋放腸促胰島素。腸促胰島素效應占葡萄糖攝入后正常胰島素釋放的50-70%，強調(diào)了GLP-1和GIP的重要性。在患有2型糖尿?。═2D）和葡萄糖耐受不良的個體中觀察到GLP-1和GIP水平降低，外源性GLP-1補充劑已被證明可有效促進T2D患者的胰島素分泌。GLP-1受體激動劑（GLP-1RA）用于T2D和肥胖癥的開發(fā)，已顯示出心腎益處。進行中的試驗，正在探索它們對代謝性肝病、外周動脈疾病、帕金森氏癥和阿爾茨海默氏癥的療效。基于GLP-1的藥物，成功導致了具有獨特特征的新分子，例如 tirzepatide，一種GIP-GLP-1受體激動劑。maritide等研究藥物可阻斷GIP并激活GLP-1受體，而retatrutide和survodutide則靶向胰高血糖素和GLP-1受體。

為了在治療中利用自然的內(nèi)源性腸促胰島素分泌，了解驅(qū)動腸內(nèi)分泌細胞（EEC）釋放激素的分子機制，對于動員內(nèi)源性腸促胰島素至關重要。盡管驅(qū)動腸內(nèi)分泌細胞分泌腸促胰島素的細胞內(nèi)機制仍然知之甚少，但它們可能與胰腺β細胞中的電活動調(diào)節(jié)機制相似，表明其存在保守的分泌通路。在腸內(nèi)分泌細胞中，由葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白介導的葡萄糖，攝取誘導細胞膜去極化和鈣內(nèi)流，觸發(fā)腸促胰島素釋放。調(diào)節(jié)激素分泌的鉀通道涉及電壓門控鉀離子通道（Kv）家族（復極化），以及ATP敏感的鉀離子通道（KATP酸促成酸酯）去極化。Kv通道對于可興奮組織中的動作電位復極化至關重要，在激活時促進鉀外排，導致膜復極化或超極化。Kv通道的功能障礙或阻塞，可以通過在復極化過程中阻礙鉀離子外排，來延長動作電位持續(xù)時間（APD），從而調(diào)節(jié)激素分泌。

KCNH2，也稱為Kv11.1或hERG1，代表了Kv通道家族的重要成員。KCNH2在包括腸道K細胞和L細胞在內(nèi)的各種組織中表達，作為其阻滯劑的副作用，它與低血糖癥的關聯(lián)，表明在調(diào)節(jié)血糖穩(wěn)態(tài)方面具有潛在作用。

本研究利用體內(nèi)小鼠模型和體外腸內(nèi)分泌細胞系，探討了KCNH2的作用和機制，揭示了小鼠中KCNH2在產(chǎn)生GIP的K細胞和產(chǎn)生GLP-1的L細胞中的表達。本研究提供了一種獨特的機制，可以促進腸內(nèi)分泌細胞分泌腸促胰島素，并為治療糖尿病和肥胖癥等代謝疾病提供增強內(nèi)源性腸促胰島素分泌的新策略。

研究進展

02

KCNH2敲低抑制Kv電流，延長APD，增加Ca2+濃度

為了評估KCNH2通道的敲除是否會影響STC-1細胞的電生理活性，團隊采用siRNA來抑制這些細胞中KCNH2的表達。Kv通道對于可興奮細胞中的動作電位復極化至關重要，它們的阻斷或功能喪失可導致復極化過程中鉀離子流出減少，從而延長APD。由于KCNH2是電壓門控鉀通道家族的成員，因此，團隊記錄了全電池總Kv電流。分析結(jié)果表明，用KCNH2 siRNA處理的STC-1細胞的Kv電流顯著低于對照細胞，在較高電壓下降低更明顯 。

為了確定KCNH2敲低對STC-1細胞中APD的影響，團隊在電流鉗模式下誘導電動作電位。研究結(jié)果表明，與對照細胞相比，KCNH2 siRNA處理的細胞的動作電位復極化延長。然而，兩組間動作電位振幅和靜息膜電位差異無統(tǒng)計學意義。

為了進一步研究KCNH2通道在鈣穩(wěn)態(tài)中的功能，團隊使用siRNA抑制STC-1細胞中KCNH2的表達，并檢測了[Ca2+]i 至高血糖和刺激劑，包括毛喉素加 IBMX。與對照組（siRNA-NC）相比，團隊觀察到刺激后KCNH2 siRNA處理的STC-1細胞中的細胞內(nèi)鈣濃度增加。

為了更好地了解鈣穩(wěn)態(tài)與腸促胰島素釋放之間的關系，團隊使用鈣螯合劑EGTA來檢查STC-1細胞中葡萄糖刺激分泌的腸促胰島素分泌。結(jié)果表明，KCNH2下調(diào)的STC-1在葡萄糖刺激后顯著增加GIP和GLP-1分泌。然而，在KCNH2下調(diào)和對照STC-1細胞中添加EGTA后，GIP和GLP-1的分泌增加減少。這些結(jié)果表明，KCNH2下調(diào)或控制STC-1細胞中葡萄糖刺激的腸促胰島素分泌是鈣依賴性的。

綜上所述，KCNH2通道調(diào)節(jié)反極化Kv電流，其減少導致APD延長并增強[Ca2+]i在葡萄糖刺激的STC-1細胞中。

KCNH2敲低抑制Kv電流，延長APD，增加Ca2+在腸內(nèi)分泌細胞中的濃度。a 用siRNA-NC或siRNA-KCNH2處理的STC-1細胞的代表性Kv電流。將電池在?70 mV的電壓下保持2秒，然后以10 mV的步長去極化至70mV。b–d STC-1細胞中Kv電流（b）和+40 mV（c）和+70 mV（d） 時的平均Kv電流密度的穩(wěn)態(tài)電流-電壓（I-V）曲線摘要（siRNA-NC， n = 19; siRNA-KCNH2， n = 17）。e 用siRNA-NC或siRNA-KCNH2處理的STC-1細胞在電流鉗模式下捕獲的代表性動作電位。f–h STC-1細胞中動作電位持續(xù)時間（f）、振幅（g）和靜息膜電位（h） 的總結(jié)（siRNA-NC，n = 15 ;siRNA-KCNH2，n = 15 ）。i 使用2μM Fluo4-AM檢測細胞內(nèi)鈣濃度?？偣?1分鐘，每5秒獲得一次讀數(shù)，在用10mM 葡萄糖和10μM毛喉素加IBMX刺激前60秒和刺激后30分鐘記錄。用加擾siRNA和KCNH2 siRNA處理的STC-1細胞獲得了熒光變化比 （F/F0）。STC-1細胞曲線下面積（AUC）匯總（siRNA-NC，n = 232 ；siRNA-KCNH2，n = 244 ）。j， k STC-1細胞在Krebs-Ringer碳酸氫鹽緩沖液（KRBB）或補充有10mM EGTA的KRBB中孵育30分鐘，然后將10 mM葡萄糖或10 mM葡萄糖補充有10mM EGTA或0 mM葡萄糖（基礎）KRBB再孵育2小時。siRNA-NC和siRNA-KCNH2 STC-1細胞中的GIP分泌（j）和GLP-1分泌（k）（n= 每組 4 次重復）。

Dofetilide在體內(nèi)和體外EEC中促進小鼠的腸促胰島素分泌

團隊使用KCNH2特異性抑制劑多非利特，來探索其對腸促胰島素分泌的影響。多非利特是一種相對較新的III類抗心律失常藥物，可特異性抑制心臟離子通道中延遲整流鉀電流的快速分量。它在將心房顫動或撲動轉(zhuǎn)化為竇性心律方面，顯示出顯著的功效。結(jié)果顯示，多非利特在葡萄糖刺激后增強了STC-1細胞的細胞內(nèi)鈣水平，表明阻斷KCNH2可提高細胞內(nèi)鈣濃度，從而進一步促進STC-1細胞分泌腸促胰島素。

團隊從小鼠的十二指腸和回腸中提取原代腸上皮細胞，發(fā)現(xiàn)多非利特使十二指腸上皮細胞中的GIP分泌增加了30%，使回腸上皮細胞中的GLP-1分泌增加了20%。然而，多非利特對KCNH2 CKO小鼠的腸上皮細胞沒有顯著影響，既不能促進GIP分泌，也不會促進GLP-1的分泌。

為了更好地研究多非利特對腸促胰島素的促進作用，團隊對高脂飲食（HFD）誘導的高血糖癥的C57BL/6 J小鼠給予多非利特或載體。口服葡萄糖攻擊后，多非利特顯著降低了HFD喂養(yǎng)小鼠的血糖水平，并增加了GLP-1、GIP和胰島素水平。這些結(jié)果表明，多非利特通過阻斷KCNH2增加細胞內(nèi)鈣濃度，從而增加腸促胰島素分泌，并改善葡萄糖穩(wěn)態(tài)。

Dofetilide在體內(nèi)和體外EEC中促進小鼠的腸促胰島素分泌。a STC-1細胞與不同濃度的多非利特孵育2小時的活力（每組n=3次重復）。b， c 用50nM加擾siRNA（siRNA-NC）或抗KCNH2的siRNA（siRNA-KCNH2）轉(zhuǎn)染腸內(nèi)分泌細胞系（STC-1細胞）48小時。將STC-1細胞在Krebs-Ringer碳酸氫鹽緩沖液（KRBB）中孵育30分鐘，然后用10mM 葡萄糖 KRBB加載體或10mM葡萄糖KRBB補充10μM多非利特再孵育2小時。葡萄糖誘導的GIP分泌（b）和GLP-1分泌（c）（n=每組6次重復）。d，e PIEC在KRBB中培養(yǎng)30分鐘，然后10mM葡萄糖KRBB加載體或10mM葡萄糖KRBB補充10μM多非利特處理另外2小時。 葡萄糖誘導的GIP分泌（d）和GLP-1分泌（e）（每組n=6次重復）。f-i HFD喂養(yǎng)（第8周開始，持續(xù)6-8周）C57BL/6J 口服給藥5mg/kg多非利特或載體，然后加入5g/kg葡萄糖用于OGTT。血糖水平和AUC（f）、血清GIP水平和AUC（g）、血清GLP-1水平和AUC（h）以及血清胰島素水平和AUC（i）（載體，n=6；多非利特，n=6）。

研究結(jié)論

03

本研究首次闡明了KCNH2鉀通道在調(diào)節(jié)腸內(nèi)分泌細胞分泌腸促胰島素激素中的作用和機制。KCNH2缺乏會降低Kv電流，延長腸內(nèi)分泌細胞的復極化。這種長時間的復極化會增加Ca2+內(nèi)流，提高細胞內(nèi)鈣2+水平，并觸發(fā)腸促胰島素分泌增加。最后，KCNH2特異性抑制劑dofetilide通過阻斷KCNH2促進腸促胰島素分泌，導致細胞內(nèi)鈣濃度增加，從而進一步增強胰島素分泌。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了KCNH2作為治療肥胖和糖尿病的有前途的新靶點的潛力。

研究表明，除了KATP酸促成酸酯和鈣通道，Kv通道在EECs中腸促胰島素分泌中，起著至關重要的作用。腸內(nèi)分泌細胞中KCNH2缺失，對腸促胰島素分泌的影響，不能歸因于腸促胰島素表達、合成和降解水平的改變，因為GIP和GLP-1的含量，以及PCSK1/PCSK2和DPP-4的表達在CKO和對照小鼠中相似。這些發(fā)現(xiàn)表明，KCNH2在作用電位復極化中發(fā)揮作用，并對EECs中腸促胰島素分泌產(chǎn)生調(diào)節(jié)控制。

本研究強調(diào)了KCNH2對腸促胰島素分泌的獨特調(diào)節(jié)作用，特別是GIP優(yōu)于GLP-1，這在涉及CKO小鼠的體內(nèi)和體外實驗中都很明顯。團隊比較了KCNH2在腸道不同EECs中的表達，發(fā)現(xiàn)KCNH2在K細胞（GIP產(chǎn)生者）中的表達水平高于L細胞（GLP-1產(chǎn)生者），這表明KCNH2在十二指腸K細胞GIP分泌中的作用，可能比在回腸L細胞GLP-1分泌中發(fā)揮更關鍵的作用。

由于KCNH2抑制劑的心臟毒性可能導致長QT綜合征，團隊提出了幾種策略來應對這一挑戰(zhàn)。首先，團隊建議改變已知KCNH2抑制劑的化學結(jié)構(gòu)，使其在循環(huán)中不易吸收。其次，利用冷凍電子顯微鏡等技術，對不同器官（包括心臟、胰島和腸道）KCNH2鉀通道的結(jié)構(gòu)差異，進行全面分析。通過采用這些策略，科學界可以利用KCNH2抑制在代謝疾病管理中的治療潛力，同時減輕相關的安全問題，最終為有效和安全的治療方案提供新的途徑。

參考資料：

1.Baggio, L. L. & Drucker, D. J. Biology of incretins: GLP-1 and GIP. Gastroenterology 132, 2131–2157, (2007).

2.Ezcurra, M., Reimann, F., Gribble, F. M. & Emery, E. Molecular mechanisms of incretin hormone secretion. Curr. Opin. Pharmacol. 13, 922–927, (2013).

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