摘 要 為探究不同區(qū)域醬鹵鴨脖和鴨翅在貯藏過(guò)程中的細(xì)菌群落變化規(guī)律和可能的關(guān)鍵腐敗菌,該研究以散裝市售醬鹵鴨脖和鴨翅為研究對(duì)象,采集南昌市4個(gè)不同區(qū)域樣品,在室溫下(20 ℃)貯藏2～6 d。利用Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù),對(duì)24個(gè)樣品中的細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行測(cè)序,共產(chǎn)生989 839條有效序列,這些序列聚類成458個(gè)操作性分類單元。生物信息學(xué)分析表明:1)所有樣品總體上按地理位置聚集,但不同種類醬鹵鴨肉制品和不同貯藏時(shí)間的樣品相對(duì)分散,說(shuō)明地理位置是影響醬鹵鴨肉制品微生物多樣性的主要因素,種類和貯藏時(shí)間是另外2個(gè)影響因素;2)醬鹵鴨脖和鴨翅中綠色魏斯氏菌(Weissella viridescens)、小牛葡萄球菌(Staphylococcus vitulinus)和熱殺索絲菌(Brochothrix thermosphacta)豐度最高,且是所有樣品中的共有微生物,說(shuō)明它們可能是醬鹵鴨脖和鴨翅貯藏過(guò)程中的主要腐敗微生物。通過(guò)純培養(yǎng)和分子生物學(xué)手段從樣品中分離并鑒定到一株綠色魏斯氏菌6-M,推測(cè)其可能是關(guān)鍵致腐微生物。該研究為了解醬鹵鴨脖和鴨翅的微生物腐敗機(jī)制以及制定有效的防腐策略提供了理論依據(jù)和菌種資源。

鴨肉富含蛋白質(zhì)、維生素、鐵、硒等元素,但脂肪和膽固醇含量低,是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的食物來(lái)源[1]。醬鹵鴨肉是鴨肉經(jīng)預(yù)煮后,用香辛料和調(diào)味料加水煮制而成。醬鹵鴨肉制品極大程度上保留了鴨肉的營(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味,且種類繁多、鮮嫩適中,深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。然而,醬鹵鴨肉制品水分含量高,加工過(guò)程中其中心溫度較低,容易在運(yùn)輸、銷售過(guò)程中受到微生物污染,這不僅會(huì)導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失,也可能會(huì)威脅消費(fèi)者的健康,同時(shí)限制了產(chǎn)品的銷售周期和半徑[2]。散裝醬鹵鴨肉制品從生產(chǎn)企業(yè)運(yùn)輸?shù)介T店,然后貯藏在冷藏柜中,再賣給消費(fèi)者,該過(guò)程大約歷時(shí)3～6 h。由于敞開(kāi)放置,醬鹵鴨肉制品在冷藏柜中貯藏階段是微生物定植和繁殖的最佳時(shí)期,所以冷藏柜中及周圍環(huán)境的衛(wèi)生狀況顯著影響著散裝醬鹵鴨肉制品的貨架期。消費(fèi)者在購(gòu)買醬鹵鴨肉制品后未立即食用,后續(xù)的貯藏也會(huì)影響醬鹵鴨肉制品的品質(zhì)。因此研究醬鹵鴨肉制品貯藏過(guò)程中的微生物多樣性及其變化規(guī)律,對(duì)于指導(dǎo)醬鹵鴨肉制品的貯藏以及后續(xù)采取的防腐策略具有重要指導(dǎo)意義。

免培養(yǎng)法和純培養(yǎng)法是研究微生物多樣性的2種主要方法?；诟咄繙y(cè)序的免培養(yǎng)法具有數(shù)據(jù)量大、精確性高、速度快等優(yōu)點(diǎn)[3],但不能獲得純培養(yǎng)物,無(wú)法驗(yàn)證基于大數(shù)據(jù)分析獲得的推論。純培養(yǎng)法指從一個(gè)細(xì)胞或一群相同的細(xì)胞經(jīng)過(guò)培養(yǎng)繁殖得到純培養(yǎng)物的方法。然而,現(xiàn)階段大量微生物無(wú)法利用純培養(yǎng)手段在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行培養(yǎng),使純培養(yǎng)法無(wú)法真實(shí)反映樣品的微生物多樣性[4]。目前,已經(jīng)有一些關(guān)于醬鹵肉制品微生物多樣性的研究報(bào)道。謝萍等[5]采用高通量測(cè)序技術(shù)分析了散裝醬鹵鴨肉在25 ℃貯藏過(guò)程中微生物群落多樣性,發(fā)現(xiàn)魏斯氏菌屬(Weissella spp.)、葡萄球菌屬(Staphylococcus spp.)是貯藏后期的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。李德紅[6]利用平板培養(yǎng)法分離氣調(diào)包裝醬鴨食管中的腐敗微生物,獲得了特基拉芽孢桿菌(Bacillus tequilensis)、香坊腸桿菌(Enterobacter xiangfangensis)和肉芽腫克雷伯氏菌(Klebsiella granulomatis)等6株可能優(yōu)勢(shì)腐敗細(xì)菌。王志琦[7]綜合了上述2種方法,首先利用高通量測(cè)序技術(shù)解析了闞疃板雞在貯藏期間的微生物群落特征,推測(cè)熱殺索絲菌(Brochothrix thermasphacta)是闞疃板雞在25 ℃貯藏下的主要腐敗菌之一,并且通過(guò)純培養(yǎng)手段分離獲得了1株B. thermasphacta。因此,以免培養(yǎng)獲得的數(shù)據(jù)為指導(dǎo),設(shè)計(jì)合適的純培養(yǎng)方法,是一種很有潛力的研究微生物多樣性和獲得腐敗微生物菌種資源的方法。

本研究以不同區(qū)域醬鹵鴨脖和鴨翅為研究對(duì)象,采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)其貯藏期間的微生物群落變化進(jìn)行全面解析,并利用純培養(yǎng)和分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)醬鹵鴨肉中可能致腐的微生物進(jìn)行分離與鑒定,以期闡明空間(貯藏位置)和時(shí)間(貯藏時(shí)間)對(duì)食品中微生物多樣性的影響以及獲得可能的關(guān)鍵致腐微生物,為了解醬鹵肉食品的腐敗機(jī)制以及后續(xù)抑制細(xì)菌生長(zhǎng),有效控制醬鹵肉制品的腐敗提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和培養(yǎng)基

散裝醬鹵鴨脖和鴨翅(500 g/樣)購(gòu)自江西省南昌市4個(gè)不同的醬鹵肉制品專賣門店。

細(xì)菌DNA提取試劑盒,北京天根生化科技有限公司;AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒,美國(guó)AXYGEN公司;Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase,南京諾唯贊生物科技有限公司;瓊脂糖,西班牙biowest公司。

MRS肉湯培養(yǎng)基、瓊脂粉,北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ系列凈化工作臺(tái),上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;隔水式培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;DYY-6C電泳儀,北京六一生物科技有限公司;NanoDrop2000超微量分光光度計(jì),美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;GeneAmp? 9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀,美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.3 樣品采集與保存

國(guó)內(nèi)某知名食品公司生產(chǎn)的醬鹵鴨脖和鴨翅于上午10點(diǎn)左右運(yùn)抵至各專賣店,散裝貯藏在4 ℃冷藏柜中。當(dāng)天下午14點(diǎn)左右,購(gòu)買醬鹵鴨脖和鴨翅,用滅菌錫箔紙包好,1 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,打開(kāi)錫箔紙,貯藏于江西師范大學(xué)國(guó)家淡水魚(yú)加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心產(chǎn)品間(圖1中Locus_S),調(diào)節(jié)房間溫度為20 ℃。購(gòu)買地點(diǎn)和貯藏地點(diǎn)示意圖見(jiàn)圖1。分別貯藏2、4、6 d后進(jìn)行取樣,依次編號(hào)為:樣品采集點(diǎn)A的鴨脖樣品(Locus_A中的AN_2,AN_4,AN_6);樣品采集點(diǎn)A的鴨翅樣品(Locus_A中的AW_2,AW_4,AW_6);樣品采集點(diǎn)B的鴨脖樣品(Locus_B中的BN_2,BN_4,BN_6);樣品采集點(diǎn)B的鴨翅樣品(Locus_B中的BW_2,BW_4,BW_6);樣品采集點(diǎn)C的鴨脖樣品(Locus_C中的CN_2,CN_4,CN_6);樣品采集點(diǎn)C的鴨翅樣品(Locus_C中的CW_2,CW_4,CW_6);樣品采集點(diǎn)D的鴨脖樣品(Locus_D中的DN_2,DN_4,DN_6);樣品采集點(diǎn)D的鴨翅樣品(Locus_D中的DW_2,DW_4,DW_6)。

圖1 樣品采集點(diǎn)和貯藏點(diǎn)相對(duì)位置示意圖
Fig.1 Schematic diagram of samples collection and storage locations

注:Locus_A～Locus_D為樣品采集點(diǎn),Locus_S為樣品貯藏點(diǎn)。

1.4 細(xì)菌基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增

在超凈工作臺(tái)中,用無(wú)菌鑷子從醬鹵鴨脖的上中下3個(gè)不同位置分別取1 g鴨肉,置于1.5 mL滅菌離心管中,振蕩混勻。按相同的方法收集醬鹵鴨翅樣品。根據(jù)天根生化細(xì)菌DNA試劑盒(DP302)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行微生物群落總基因組DNA抽提。提取的基因組DNA使用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量,并使用NanoDrop 2000測(cè)定DNA濃度。以提取的DNA為模板,采用通用引物338F(5′-GTACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和引物806R(5′-GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)PCR擴(kuò)增細(xì)菌菌群的16S rDNA V3～V4區(qū)基因序列。PCR擴(kuò)增體系為:10×PCR緩沖液5 μL,dNTP(10 mmol/L)0.5 μL,DNA 10 ng,上下游引物(50 μmol/L)各0.5 μL,高保真Taq酶(5 U/μL)0.5 μL,加超純水到50 μL。PCR擴(kuò)增參數(shù):95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性45 s,55 ℃退火50 s,72 ℃延伸45 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒純化回收。

1.5 高通量測(cè)序與數(shù)據(jù)分析

純化回收且質(zhì)量合格的PCR產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測(cè)序。使用Fastp軟件對(duì)測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾,使用Flash軟件對(duì)Illumina測(cè)序得到的PE reads進(jìn)行拼接,最終得到有效序列[8]。通過(guò)Uparse軟件將序列按照相似性≥97%閾值進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)聚類[9],并進(jìn)行嵌合體檢查。采用主坐標(biāo)分析法(principal co-ordinates analysis,PCoA)分析樣品間細(xì)菌群落的β-多樣性;利用Mothur軟件進(jìn)行樣品內(nèi)細(xì)菌群落α-多樣性分析。采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析[10],基于138版本Silva(http://www.arb-silva.de)和13.5版本Greengenes(http://greengenes.secondgenome.com)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)細(xì)菌群落進(jìn)行物種注釋,并分別在屬和種水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落物種組成。

1.6 微生物分離、純化與鑒定

為了分離出共有的微生物,以貯藏了4 d的所有醬鹵鴨脖和鴨翅為分菌材料,在超凈工作臺(tái)中,用無(wú)菌鑷子分別取0.5 g樣品,置于1.5 mL滅菌離心管中。加500 μL滅菌生理鹽水,漩渦振蕩后,上清液用生理鹽水稀釋至10-4、10-5、10-6。取100 μL稀釋液涂布于MRS固體平板,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。隨機(jī)選取10個(gè)單菌落,在MRS液體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)12 h,-80 ℃保存甘油菌。用接種環(huán)蘸取少許保存的甘油菌,在MRS固體培養(yǎng)基中劃線分離,37 ℃培養(yǎng)48 h。選取2株長(zhǎng)勢(shì)最好菌株,接種于MRS液體培養(yǎng)基,37 ℃靜置培養(yǎng)48 h后,用普通光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。將MRS液體培養(yǎng)基的菌液以8 000 r/min離心10 min后棄去培養(yǎng)基,根據(jù)DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)菌總基因組DNA提取。使用細(xì)菌通用引物27F (5′-AACTGAGTTTGATCCTGGCTC-3′)和1492R (5′-TACGGTTACCTTGTTACGAC-TT-3′)擴(kuò)增16S rDNA基因,凝膠電泳分析其PCR產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增條件為:95 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,在55 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后,送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列拼接校準(zhǔn)后與NCBI上GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析。參考曾金秀等[11]的方法,下載同源性較高的16S rDNA的基因序列作為參比對(duì)象,使用MEGA 7.0軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。最后,結(jié)合菌落和細(xì)胞形態(tài)以及分子生物學(xué)分析結(jié)果,確定菌株信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

高通量測(cè)序獲得醬鹵鴨脖和鴨翅樣品不同貯藏時(shí)間的原始序列,經(jīng)拼接、過(guò)濾后,測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表1。24個(gè)樣品共有989 839條有效序列,不同貯藏時(shí)間樣品有效序列數(shù)均超過(guò)30 000,平均長(zhǎng)度為428 bp。稀釋曲線是以樣本中隨機(jī)抽取的序列數(shù)為橫坐標(biāo),以對(duì)應(yīng)的OTU數(shù)量為縱坐標(biāo),常用來(lái)反映測(cè)序數(shù)據(jù)是否科學(xué)[12]。醬鹵鴨脖和鴨翅樣品測(cè)序數(shù)據(jù)的稀釋曲線表明,當(dāng)測(cè)序量超過(guò)10 000 bp時(shí),稀釋曲線上升緩慢,達(dá)到30 000 bp時(shí),曲線已經(jīng)趨于平緩(圖2),表明本次測(cè)序的深度已足夠,說(shuō)明取樣合理,測(cè)序深度已基本覆蓋樣品中所有微生物,可以反映樣品細(xì)菌多樣性。

表1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
Table 1 Statistics of the sequencing data

樣品名堿基數(shù)序列數(shù)OTU數(shù)量樣品名堿基數(shù)序列數(shù)OTU數(shù)量AN_215 460 42936 0398AW_218 678 27343 54010AN_415 030 06735 03612AW_425 197 44758 74620AN_616 178 75537 71412AW_618 889 58444 03411BN_217 194 42440 45119BW_215 037 71535 30921BN_415 588 67136 58826BW_417 187 92740 28123BN_616 994 84039 65324BW_617 762 74741 89321CN_216 860 94139 30417CW_234 376 27880 13315CN_416 343 57538 09917CW_417 232 18940 17016CN_618 897 83944 05320CW_614 363 69633 48314DN_220 901 56848 72518DW_213 985 02532 60331DN_416 148 87537 64418DW_414 670 45234 20232DN_614 932 66434 80919DW_616 007 79237 33034

圖2 醬鹵鴨脖和鴨翅樣品稀釋曲線
Fig.2 Rarefaction curves of sauced duck neck and wing samples

2.2 β-多樣性分析

β-多樣性分析通過(guò)對(duì)不同微生物群落間的物種多樣性進(jìn)行組間比較分析,探索不同分組樣本間群落組成的相似性或差異性[13];樣品在PCoA圖中距離越近,說(shuō)明樣品間的細(xì)菌群落組成越相似[14]。如圖3所示,第1主成分和第2主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為74.18%,說(shuō)明兩個(gè)主成分可以疊加解釋74.18%。整體來(lái)看,所有樣品按地理位置聚集,其中Locus_B和Locus_C的樣品分別聚類在不同的區(qū)域;盡管Locus_A和Locus_D的樣品聚類在一個(gè)大的區(qū)域,但Locus_D樣品聚集得更緊密,能和Locus_A樣品分開(kāi),這些結(jié)果說(shuō)明來(lái)源于不同的地理位置對(duì)樣本的聚類具有決定性的影響。Locus_A和Locus_D樣品聚集在一起的原因可做如下推測(cè):在采集點(diǎn)貯藏的4 h中,Locus_A和Locus_D樣品中的微生物多樣性和物種豐度均較低,未形成穩(wěn)定的群落結(jié)構(gòu),易受外界環(huán)境影響,當(dāng)樣品轉(zhuǎn)移至Locus_S,新環(huán)境中的微生物逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì),造成Locus_A和Locus_D樣品中群落結(jié)構(gòu)具有相似性。另外,對(duì)Locus_A樣品來(lái)說(shuō),來(lái)源于醬鹵鴨脖的樣本(n=3)和醬鹵鴨翅的樣本(n=3)各有小范圍的聚集,這說(shuō)明醬鹵肉制品的種類是影響聚類的第2個(gè)因素,這個(gè)現(xiàn)象在Locus_B、Locus_C和Locus_D中也可以體現(xiàn)。此外,對(duì)于同一采樣點(diǎn)同一種醬鹵肉制品的不同貯藏時(shí)間樣品在圖中有一定的差距,該現(xiàn)象以Locus_A和Locus_C來(lái)源的樣品最明顯,說(shuō)明貯藏時(shí)間也是影響聚類的一種因素。綜上所述,地理位置是影響醬鹵鴨脖和鴨翅中腐敗微生物聚類的主要因素,醬鹵肉制品的種類和貯藏時(shí)間也是影響聚類的因素。黃鄭朝[15]通過(guò)對(duì)不同區(qū)域傳統(tǒng)發(fā)酵香腸細(xì)菌多樣性研究發(fā)現(xiàn),不同地理位置發(fā)酵香腸細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)之間具有明顯的差異性,這種結(jié)果的原因可能是地理位置上的差異。這和我們的研究結(jié)果相似,說(shuō)明地理位置會(huì)顯著影響微生物的群落結(jié)構(gòu)。

圖3 醬鹵鴨脖和鴨翅樣本間PcoA結(jié)果
Fig.3 PCoA results in sauced duck neck and duck wing samples

2.3 α-多樣性分析

α-多樣性分析主要用于反映物種豐富度、均勻度以及多樣性[16]。基于97%相似性水平下的OTU信息,利用Chao指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)及Invsimpson指數(shù)對(duì)樣品的微生物豐富度和多樣性進(jìn)行評(píng)估。Chao指數(shù)、Ace指數(shù)越大,表明群落的物種豐富度越高;Shannon指數(shù)、Invsimpson指數(shù)越大,表明群落中物種多樣性越高。從地理位置來(lái)看,Chao指數(shù)和Ace指數(shù)從大到小依次為L(zhǎng)ocus_D、Locus_B、Locus_C和Locus_A(圖4-a、圖4-b);Shannon指數(shù)和Invsimpson指數(shù)中Locus_B、Locus_C最大,Locus_D最小(圖4-c、圖4-d)。從醬鹵肉制種類類來(lái)看,Locus_D中的鴨脖樣品和鴨翅樣品豐富度差異最明顯(圖4-a、圖4-b);Locus_C中鴨脖樣品多樣性高于鴨翅樣品,而其他3個(gè)點(diǎn)樣品的情況剛好相反(圖4-c、圖4-d)。從取樣時(shí)間上看,第2天的豐富度最低,第4天或第6天豐富度最高(圖4-a、圖4-b);大部分樣品第6天的多樣性最高,少數(shù)樣品如BN第2天多樣性最高(圖4-c、圖4-d)。這些結(jié)果再次說(shuō)明地理位置、醬鹵肉制種類和貯藏時(shí)間等因素同時(shí)影響著醬鹵鴨脖和鴨翅的微生物多樣性。

a-Chao指數(shù);b-Ace指數(shù);c-Shannon指數(shù);d-Invsimpson指數(shù)

圖4 醬鹵鴨脖和鴨翅樣品的α-多樣性指數(shù)
Fig.4 α- Diversity indexes of sauced duck neck and duck wing samples

a-屬水平;b-種水平

圖5 醬鹵鴨脖和鴨翅細(xì)菌屬水平和種水平相對(duì)豐度
Fig.5 Relative abundance of genus levels and species levels in sauced duck neck and duck wing samples

2.4 細(xì)菌菌群組成分析

為進(jìn)一步研究醬鹵鴨脖和鴨翅貯藏過(guò)程中微生物多樣性和動(dòng)態(tài)演替過(guò)程,在屬水平和種水平進(jìn)行細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和差異分析。醬鹵鴨脖和鴨翅在貯藏2 d后未發(fā)生明顯變化,顏色鮮亮;貯藏4 d后樣品有輕微的腐敗,顏色變暗;樣品貯藏6 d后樣品有明顯的腐敗,顏色進(jìn)一步變暗。如圖5所示,Locus_A樣品中,豐度排名第一的是Weissella spp.,其次為葡萄球菌屬Staphylococcus spp.和索絲菌屬(Brochothrix spp.),其總?cè)郝湔加新史謩e為35.36%～81.29%,10.53%～29.84%和0.55%～34.73%,對(duì)應(yīng)的優(yōu)勢(shì)菌種分別為綠色魏斯氏菌(Weissella viridescens)、小牛葡萄球菌(Staphylococcus vitulinus)和B.thermosphacta。與Locus_A類似,Locus_D樣品中,魏斯氏菌屬占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)(57.96%～97.98%),但其優(yōu)勢(shì)物種的多樣性比Locus_A樣品高,除W. viridescens,S. vitulinus和B. thermosphacta外,馬胃葡萄球菌(Staphylococcus equorum)、消化嗜冷桿菌(Psychrobacter alimentarius)、Carnimonas_nigrificans也被檢測(cè)到。如前所述,Locus_A和Locus_D樣品聚集在一起(圖3),這可能歸因于Locus_A和Locus_D相似的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu),且這些優(yōu)勢(shì)微生物可能主要來(lái)源于貯藏點(diǎn)S。李海燕等[17]通過(guò)研究不同生境甘草微生物群落特征發(fā)現(xiàn),聚類在一起的甘草樣品在屬水平上主要的微生物相同,即主要微生物群落導(dǎo)致不同生境的甘草樣品聚類在一起。這和我們的研究結(jié)果一致,因此我們推斷造成Locus_A和Locus_D聚類在一起的原因是相似的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。對(duì)于Locus_B和Locus_C的醬鹵鴨脖和鴨翅樣品來(lái)說(shuō),貯藏不同時(shí)期具有更多的微生物多樣性,其中Locus_B樣品豐度最高的屬是Brochothrix spp.,對(duì)應(yīng)的物種是B. thermosphacta;Locus_C樣品豐度最高的屬是Weissella spp.、Psychrobacter spp.和Staphylococcus spp.,對(duì)應(yīng)的物種是W. viridescens、P. alimentarius和S. vitulinus;另外,Corynebacterium variabile、unclassified_g_Psychromona、Cobetia marina、Leuconostoc carnosum等也是豐度較高的微生物,且C.variabile和unclassified_g_Psychromona分別主要存在于Locus_B和Locus_C樣品中。從貯藏時(shí)間來(lái)看,主要優(yōu)勢(shì)微生物的豐度變化沒(méi)有固定規(guī)律。例如,隨貯藏時(shí)間增加,W. viridescens在AN樣品中先增加后減少,而在AW樣品中一直減少;B. thermosphacta在AW樣品中一直增加,而在BW樣品中一直減少。總體看來(lái),醬鹵鴨脖和鴨翅在貯藏過(guò)程中菌群變化較為復(fù)雜,主要的影響因素為樣品貯藏的地理位置,這與王瑾瑜[18]報(bào)道的不同地區(qū)的酸面團(tuán)微生物群落組成存在明顯差異的結(jié)果類似。因此,需要對(duì)貯藏環(huán)境等嚴(yán)格把關(guān),最大程度避免微生物污染。

2.5 共有和特有物種分析

為了探究不同貯藏期間醬鹵鴨脖和鴨翅中的核心微生物,對(duì)所有樣品的共有物種和特有物種進(jìn)行分析。如圖6所示,Locus_A、Locus_B、Locus_C和Locus_D有14個(gè)共有物種,分別有1、6、0、14個(gè)特有物種。共有物種可能是導(dǎo)致醬鹵鴨脖和鴨翅腐敗的關(guān)鍵物種,包括W. viridescens、S. vitulinus、B. thermosphacta、W.paramesenteroides、S.equorum、C.marina、P.alimentarius、P.cibarius、C.variabile、Pseudomonas psychrophila、unclassified_g_Psychrobacter、Rhodococcus erythropolis、unclassified_g_Psychromonas、unclassified_g_Weissella。丁珊珊等[19]研究發(fā)現(xiàn)W. viridescens能使真空包裝低溫火腿發(fā)生快速腐敗;ILLIKOUD等[20]研究證明B. thermosphacta是導(dǎo)致肉類變質(zhì)腐敗的主要細(xì)菌之一;滕安國(guó)等[21]發(fā)現(xiàn)S. vitulinus存在于香腸的不同儲(chǔ)藏時(shí)期。以上研究結(jié)果表明W. viridescens、S. vitulinus和B. thermosphacta是導(dǎo)致肉制品腐敗的關(guān)鍵微生物。本次實(shí)驗(yàn)在室溫(20 ℃)下貯藏,腐敗后產(chǎn)品出現(xiàn)表面發(fā)黏、顏色變暗的現(xiàn)象,結(jié)合我們的發(fā)現(xiàn)和前人的研究,因此我們推測(cè)這些微生物也是醬鹵鴨脖和鴨翅腐敗的關(guān)鍵微生物。

圖6 醬鹵鴨脖和鴨翅樣本OTU數(shù)目Venn圖
Fig.6 Venn plot of the number of OTU of sauced duck neck and wing samples

2.6 可能致腐微生物分離與鑒定

如前所述,W. viridescens、S. vitulinus和B. thermosphacta等可能是肉制品的關(guān)鍵致腐微生物。為了后續(xù)證實(shí)該推測(cè)以及闡明這些微生物的致腐機(jī)制,我們進(jìn)行了微生物分離與鑒定研究。如圖7-a所示,MRS固體平板上有圓形,淡黃色,表面光滑,邊緣整齊,無(wú)褶皺的直徑大約在1 mm左右的菌落。挑選2個(gè)長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株,命名為6-M和6-N。革蘭氏染色結(jié)合顯微觀察表明,6-M和6-N為革蘭氏陽(yáng)性菌,細(xì)胞呈不規(guī)則的短桿狀,兩端呈圓形或稍細(xì),成對(duì)或短鏈排列(圖7-b)。分子生物學(xué)鑒定分析顯示,6-M和6-N的16S RNA序列同源性為100%,其與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的W. viridescens均具有>99%的同源性,說(shuō)明6-M和6-N是同一個(gè)菌株,統(tǒng)一命名為6-M。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析表明,6-M與W.viridescens聚在一起,形成一個(gè)亞分支(圖7-c)。綜合6-M的菌落和細(xì)胞形態(tài)、分子生物學(xué)分析以及上述微生物多樣性分析揭示的結(jié)果,證明6-M為W. viridescens,可用于后續(xù)致腐實(shí)驗(yàn)。小牛葡萄球菌和熱殺索絲等微生物未分離成功,可能是MRS培養(yǎng)基不合適,后續(xù)可改變培養(yǎng)基配方進(jìn)行分離。

a-菌落形態(tài);b-細(xì)胞形態(tài);c-系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖7 菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
Fig.7 The colonial morphology, cell morphology, and phylogenetic tree

3 結(jié)論

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)研究了散裝醬鹵鴨脖和鴨翅在貯藏過(guò)程中的微生物多樣性變化規(guī)律,結(jié)果發(fā)現(xiàn)地理位置、醬鹵肉制品種類和貯藏時(shí)間共同影響微生物的群落結(jié)構(gòu),其中地理位置是第一影響因素;W. viridescens、S. vitulinus和B. thermosphacta可能是醬鹵鴨脖和鴨翅的關(guān)鍵致腐微生物。然后,通過(guò)純培養(yǎng)和分子生物學(xué)手段從腐敗醬鹵鴨脖和鴨翅中分離并鑒定到1株W. viridescens 6-M,進(jìn)一步證明了W. viridescens是能被分離,可被用于后續(xù)醬鹵鴨脖和鴨翅等肉制品腐敗研究的關(guān)鍵菌株。本研究為闡明醬鹵鴨脖和鴨翅等肉制品的腐敗機(jī)制提供了理論依據(jù)以及關(guān)鍵菌株資源。同時(shí)從空間(地理位置)和時(shí)間(貯藏時(shí)間)兩個(gè)維度研究食品中的微生物多樣性以及基于免培養(yǎng)指導(dǎo)微生物分離純化的研究思路可擴(kuò)展至食品與微生物交叉學(xué)科領(lǐng)域。因此,本研究具有一定學(xué)術(shù)理論價(jià)值。

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網(wǎng)址: 醬鹵鴨脖和鴨翅貯藏過(guò)程中細(xì)菌多樣性及關(guān)鍵腐敗菌分離研究 http://m.u1s5d6.cn/newsview1332012.html