專利名稱：一種轉(zhuǎn)糖基β－半乳糖苷酶產(chǎn)生菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腸桿菌，尤其涉及一種可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)糖基β-半乳糖苷酶的陰溝腸桿菌。
背景技術(shù)：
低聚半乳糖是母乳中的天然組分之一，其最重要最根本的生理功能源于它對雙歧桿菌的增殖作用。由于低聚半乳糖具有很好的熱穩(wěn)定性和耐酸性，其保健作用引起了人們的極大關(guān)注。目前，低聚半乳糖的生產(chǎn)主要通過微生物酶法合成，即通過β-半乳糖苷酶或乳糖酶以乳糖為底物轉(zhuǎn)糖基合成。我國低聚半乳糖的開發(fā)研究還處于起始階段，自主的微生物酶法工業(yè)生產(chǎn)尚屬空白，乳品工業(yè)中使用的乳糖酶全部依賴進(jìn)口。因此，尋求可以產(chǎn)生較強(qiáng)轉(zhuǎn)糖基活性β-半乳糖苷酶的微生物，對于填補(bǔ)國內(nèi)自主的微生物酶法生產(chǎn)低聚半乳糖的空白有著重要意義。
經(jīng)檢索，目前國際上沒有陰溝腸桿菌β-半乳糖苷酶以乳糖為底物催化生產(chǎn)低聚半乳糖的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有微生物酶法工業(yè)生產(chǎn)中，轉(zhuǎn)糖基β-半乳糖苷酶的微生物種類有限，特別是能夠產(chǎn)生較強(qiáng)轉(zhuǎn)糖基活性β-半乳糖苷酶的微生物的不足，本發(fā)明的目的是提供一株新分離的可產(chǎn)生較強(qiáng)轉(zhuǎn)糖基活性β-半乳糖苷酶的陰溝腸桿菌，此菌產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶以乳糖為底物可以催化生產(chǎn)低聚半乳糖。
本發(fā)明提供的可產(chǎn)生較強(qiáng)轉(zhuǎn)糖基活性β-半乳糖苷酶的菌株，名為陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)B5，已于2005年6月30日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏編號為CGMCC No.1401。
本發(fā)明涉及的轉(zhuǎn)糖基β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌——陰溝腸桿菌是從土壤中分離獲得。土壤樣品微生物經(jīng)乳糖富集選擇培養(yǎng)后通過兩次活性篩選得到，即先以乳糖為唯一碳源將樣品微生物富集培養(yǎng)后進(jìn)行平板選擇分離，然后再篩選β-半乳糖苷酶水解活性和轉(zhuǎn)半乳糖基活性而得到。
本發(fā)明涉及的可產(chǎn)生較強(qiáng)轉(zhuǎn)糖基活性β-半乳糖苷酶的陰溝腸桿菌，具有如下生物學(xué)特征形態(tài)學(xué)特征是革蘭氏陰性桿菌；在LB培養(yǎng)基上，菌體形態(tài)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長發(fā)生變化，從長桿狀到短桿狀、橢球形、最后縮至球形，染色的大小為0.5-1.5×0.7-9.0微米；單個(gè)、成對或短鏈狀排列；以周生鞭毛運(yùn)動；不形成芽孢。
生理生化特征是能利用檸檬酸鹽或醋酸鹽為唯一碳源；37℃發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣；甘油發(fā)酵不產(chǎn)氣；不水解七葉靈；不產(chǎn)生吲哚；V.P.測定陽性；甲基紅測定陰性；還原硝酸鹽；賴氨酸不脫羧，有鳥氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、脲酶；其它特征詳見表1。
表1陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)B5 CGMCC No.1401生理生化特征

注+.陽性；-.陰性本發(fā)明涉及的陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)B5CGMCC No.1401在乳糖斜面培養(yǎng)基中傳代穩(wěn)定；在LB液體培養(yǎng)基中生長良好；在產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中生長良好，并且產(chǎn)生轉(zhuǎn)糖基β-半乳糖苷酶；培養(yǎng)溫度為35～40℃；培養(yǎng)時(shí)間為15～24小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分。
上述LB培養(yǎng)基配方蛋白胨10±1g/L，酵母粉5±1g/L，氯化鈉7±1g/L，pH7.0～7.5，121℃滅菌20分鐘；篩選上述陰溝腸桿菌所用的選擇培養(yǎng)基或斜面培養(yǎng)基配方是乳糖10±2g/L，蛋白胨5±2g/L，酵母粉10±2g/L，氯化鈉3±2g/L，pH7.0～7.5，固體培養(yǎng)基加瓊脂20±2g/L；112℃滅菌30分鐘。
上述產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基配方是乳糖10±2g/L，蛋白胨5±2g/L，酵母粉10±2g/L，氯化鈉3±2g/L，pH7.0～7.5，112℃滅菌30分鐘。
其中，上述培養(yǎng)溫度優(yōu)選為37℃。
其中，上述培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為16～18小時(shí)。
其中，篩選上述陰溝腸桿菌所用的選擇培養(yǎng)基或斜面培養(yǎng)基配方優(yōu)選是乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，氯化鈉3g/L，pH 7.5，固體培養(yǎng)基加瓊脂20g/L。
其中，上述產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)選是乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，氯化鈉3ga，pH7.5。
本發(fā)明涉及的菌株陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)B5CGMCC No.1401的16SrDNA核苷酸序列長度為1534堿基，如序列表中SEQ ID No.1所示。
通過在美國生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的網(wǎng)上分析，將本發(fā)明菌株陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)B5的16S rDNA序列與GenBank中已登錄的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明，菌株B5的16SrDNA基因序列與腸桿菌屬幾株菌的16S rDNA序列相似性很高，但卻不完全相同，說明本發(fā)明的菌株是首次分離鑒定。結(jié)合菌株B5形態(tài)學(xué)及生理生化特征，根據(jù)伯杰細(xì)菌鑒定手冊(第九版)，將本發(fā)明菌株B5菌鑒定為陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)。并于2005年6月30日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏編號為CGMCC No.1401。
本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)糖基β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌在制備轉(zhuǎn)糖基β-半乳糖苷酶的生產(chǎn)中的應(yīng)用本發(fā)明的轉(zhuǎn)糖基β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌可以在產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)液中培養(yǎng)產(chǎn)生轉(zhuǎn)糖基β-半乳糖苷酶，在生產(chǎn)低聚半乳糖的過程中，經(jīng)產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)液培養(yǎng)獲得菌細(xì)胞，經(jīng)凍融后，即為β-半乳糖苷酶粗酶液。
本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)糖基β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌在制備低聚半乳糖的生產(chǎn)中的應(yīng)用在制備低聚半乳糖的生產(chǎn)中，本發(fā)明是先將陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)B5CGMCCNo 1401經(jīng)產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)液培養(yǎng)后，制成β-半乳糖苷酶粗酶液，所述β-半乳糖苷酶以乳糖為底物催化生產(chǎn)低聚半乳糖。
經(jīng)檢索，目前國內(nèi)外沒有陰溝腸桿菌β-半乳糖苷酶以乳糖為底物催化生產(chǎn)低聚半乳糖的報(bào)道。而利用本發(fā)明菌株陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)B5CGMCC No.1401進(jìn)行的試驗(yàn)表明本發(fā)明的菌株涉及的陰溝腸桿菌β-半乳糖苷酶能以乳糖為底物反應(yīng)生成低聚半乳糖，并且得率較高，約為54.5％。該菌生長快，培養(yǎng)簡單，遺傳性質(zhì)穩(wěn)定，轉(zhuǎn)糖基效率高，具有很強(qiáng)的工業(yè)化生產(chǎn)優(yōu)勢，可用于工業(yè)生產(chǎn)低聚半乳糖，以填補(bǔ)國內(nèi)自主的微生物酶法生產(chǎn)低聚半乳糖的空白。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1菌種篩選1.能利用乳糖為唯一碳源生長菌株的分離純化將10g土樣加入100mL以乳糖為唯一碳源的培養(yǎng)液中富集培養(yǎng)，將培養(yǎng)液用無菌水稀釋成10-1、10-3、10-5、10-7梯度，各取200μL均勻涂布于乳糖選擇平板上。細(xì)菌篩選平板于37℃培養(yǎng)24小時(shí)，真菌篩選平板于28℃培養(yǎng)48～60小時(shí)。10-5梯度平板長出的菌落種類多，并且便于純化。分別挑取形態(tài)不同的菌落，通過平板劃線進(jìn)行分離純化，重復(fù)3次。對分離菌株進(jìn)行鏡檢，確定純度細(xì)菌以金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大腸桿菌(Escherichia coli)作對照，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢可區(qū)分革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌；真菌制成水浸片，鏡檢可觀察菌絲特征及孢子產(chǎn)生方式，初步鑒定到屬。最后將鏡檢得到的純化菌株分別保存到試管斜面上，4℃儲藏。
上述分離純化過程共獲得15株菌能以乳糖為唯一碳源生長，其中細(xì)菌9株、真菌6株。將15株菌分別進(jìn)行編號，細(xì)菌為B1、……、B9；真菌為F1、……、F6。
上述細(xì)菌篩選用細(xì)菌富集選擇培養(yǎng)基(也作為斜面培養(yǎng)基)，其配方是乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，氯化鈉3g/L，pH7.0～7.5，固體培養(yǎng)基加瓊脂20g/L。
上述真菌篩選用真菌富集選擇培養(yǎng)基(也作為斜面培養(yǎng)基)，其配方是土豆汁(土豆200g/L)，乳糖10g/L，瓊脂20g/L，自然pH。
2.產(chǎn)β-半乳糖苷酶菌株的篩選將上述分離得到的15株菌分別接種至30mL產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)液中，細(xì)菌于37℃搖床培養(yǎng)18小時(shí)，真菌于28℃搖床培養(yǎng)40小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速均為180轉(zhuǎn)/分。細(xì)菌和酵母培養(yǎng)液于12,000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘獲得菌細(xì)胞；霉菌用濾紙(雙圈牌101快速定性濾紙)抽濾獲得菌細(xì)胞。然后測定菌細(xì)胞β-半乳糖苷酶水解活性將菌細(xì)胞與β-半乳糖苷酶水解底物——鄰硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG)混合進(jìn)行反應(yīng)，如果ONPG被水解，即認(rèn)為該菌產(chǎn)β-半乳糖苷酶。
取菌細(xì)胞50mg，加2mmol/L的ONPG(無色)溶液450μL，40℃反應(yīng)10分鐘，加1mL0.5mol/L的Na2C03溶液終止反應(yīng)，12,000轉(zhuǎn)/分離心2分鐘。如果上清液呈黃色，說明原無色的ONPG被β-半乳糖苷酶水解成了黃色的鄰硝基苯酚，菌細(xì)胞有β-半乳糖苷酶的存在。如果對上清液測OD400，可以對水解酶活定量。酶的活力單位規(guī)定以1分鐘水解ONPG釋放1μmol鄰硝基苯酚的酶量為一個(gè)酶活力單位。
上述篩選過程共獲得9株β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌，其中5株細(xì)菌、4株真菌，分別為B1、B2、B4、B5、B9、F1、F2、F3、F4。
上述產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基配方是乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，CaCl20.11g/L，MnSO40.001g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，KH2PO40.05g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03g/L，pH 7.0～7.5(細(xì)菌)或pH 6.0～6.5(真菌)。
3.產(chǎn)轉(zhuǎn)糖基β-半乳糖苷酶菌株的篩選將上述9種β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌的菌細(xì)胞制成粗酶液，進(jìn)行轉(zhuǎn)半乳糖基活性的篩選。
取50mg菌細(xì)胞，懸浮于50μL pH7.0、50mmol/L的磷酸鉀緩沖液中，于-20℃以下溫度完全冷凍后，置室溫解凍，再重復(fù)凍融2次，所得懸液即為β-半乳糖苷酶粗酶液。取100μL粗酶液，加入300μL pH7.0磷酸鉀緩沖液配制的30％(w/v)乳糖溶液，分成2等份分別于40℃、50℃進(jìn)行反應(yīng)，細(xì)菌反應(yīng)4小時(shí)，真菌反應(yīng)8小時(shí)，12,000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，上清液即含反應(yīng)產(chǎn)物——低聚半乳糖。
將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行薄層層析(Thin-Layer Chromatography，TLC)分析，確定轉(zhuǎn)糖基活性。TLC薄板(Silica ge160，No.553，Merck)點(diǎn)樣后，在展層劑(正丁醇∶乙醇∶水＝5∶3∶2)中展層，霧噴顯色劑(20％硫酸溶液+0.5％的3，5-二羥基甲苯)，于120℃烘烤10分鐘，糖斑點(diǎn)的顯色根據(jù)其種類從棕黃色至深紫色。如果乳糖斑點(diǎn)附近生成了新的寡糖斑點(diǎn)，則產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶有轉(zhuǎn)糖基活性；反之則不存在轉(zhuǎn)糖基活性。寡糖斑點(diǎn)越大、越多，說明酶的轉(zhuǎn)糖基活性越強(qiáng)。
結(jié)果確定2株細(xì)菌(B1、B5)和1株真菌(F3)具有較好的轉(zhuǎn)糖基活性。
將菌株B1、B5和F3的轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物進(jìn)行高效液相色譜(High Performance LiquidChromatography，HPLC)分析和薄層掃描分析，結(jié)果B5的低聚糖得率最高，約為54.5％。
B5菌由16S rDNA同源序列比較和生理生化特性鑒定為陰溝腸桿菌，菌種鑒定詳見實(shí)施例2。經(jīng)檢索，目前國際上沒有本發(fā)明所涉及的陰溝腸桿菌β-半乳糖苷酶以乳糖為底物催化生產(chǎn)低聚半乳糖的報(bào)道。
上述HPLC分析所用設(shè)備及條件島津(SHIMADZU)高效液相色譜儀；島津RID-10A示差檢測器；BIO-RAD Aminex HPX-42C柱(300mm×7.8mm)；流動相為三蒸水，流速為0.2mL/min，柱溫80℃；結(jié)果分析軟件為Class-VP6.0。轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物用0.2μm濾膜過濾后，稀釋成5％(w/v)的糖溶液，進(jìn)樣分析。
上述薄層掃描分析所用設(shè)備及條件島津(SHIMADZU)CS-9301雙波長飛點(diǎn)薄層掃描儀，檢測波長為550nm。對上述薄層層析板進(jìn)行掃描分析。
實(shí)施例2菌種鑒定1.形態(tài)學(xué)及生理生化特征本發(fā)明分離篩選出的菌株陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)B5CGMCC No.1401，形態(tài)學(xué)特征是革蘭氏陰性桿菌；在LB培養(yǎng)基上，菌體形態(tài)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長發(fā)生變化，從長桿狀到短桿狀、橢球形、最后縮至球形，染色的大小為0.5-1.5×0.7-9.0微米；單個(gè)、成對或短鏈狀排列；以周生鞭毛運(yùn)動；不形成芽孢；生理生化特征是能利用檸檬酸鹽或醋酸鹽為唯一碳源；37℃發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣；甘油發(fā)酵不產(chǎn)氣；不水解七葉靈；不產(chǎn)生吲哚；V.P.測定陽性；甲基紅測定陰性；還原硝酸鹽；賴氨酸不脫羧，有鳥氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、脲酶；其它特征詳見表1。
2.16S rDNA PCR擴(kuò)增及同源性分析將本發(fā)明分離篩選出的陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)B5 CGMCC No.1401，接種于5mLLB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)16小時(shí)，取1.5ml培養(yǎng)物，12,000轉(zhuǎn)/分離心2分鐘，所得沉淀懸于565μL的TE緩沖液中；加入30μL質(zhì)量體積比為10％的十二烷基磺酸鈉(SDS)和5μL20mg/mL的蛋白酶K，混勻，于37℃溫育1小時(shí)；加入100μL5mol/LNaCl充分混勻，再加入80μL CTAB/NaCl溶液，混勻，于65℃溫育20分鐘；然后冰浴30分鐘；加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻；12,000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)入一個(gè)新管中，再加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，混勻；12,000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，將上清轉(zhuǎn)入一支新管中，加入2倍體積無水乙醇，輕輕混勻直到DNA沉淀下來；12,000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，DNA沉淀用70％乙醇中洗滌2次；真空干燥10分鐘，重溶于50μL的TE緩沖液。
TE緩沖液配方如下10mmol/L的三羥甲基氨基甲烷(Tris)，1mmol/L的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，調(diào)pH為8.0。
CTAB/NaCl溶液配方如下10％(w/v)的十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)溶解于0.7mol/L的NaCl中。
以提取的陰溝腸桿菌基因組DNA為模板，采用細(xì)菌16S rDNA序列通用引物F27(5’-AGAGTTTCMTGGCTCAG-3’)和R1541(5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系總體積為50μL，含超純水35μL，10×PCR buffer 5μL，dNTP2.4mmol/L，引物各1μmol/L，MgCl21.5mmol/L，模板DNA100ng，Taq酶2.5U。PCR擴(kuò)增條件95℃預(yù)變性5分鐘；反應(yīng)28個(gè)循環(huán)(95℃變性1分鐘，52℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘)；28個(gè)循環(huán)結(jié)束后72℃延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物約為1.5kb左右，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外分析儀檢測，然后回收，連接到質(zhì)粒pUCm-T載體上，轉(zhuǎn)化E.coli Top10感受態(tài)細(xì)胞，涂布氨芐青霉素平板，提取質(zhì)粒DNA檢測，Pst I酶切驗(yàn)證。將帶有16S rDNA的正確質(zhì)粒進(jìn)行測序。
陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)B5CGMCC No.1401菌株16S rDNA序列長度為1534堿基，核苷酸序列如下agagtttgat catggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgaac60ggtagcacag agagcttgct ctcgggtgac gagtggcgga cgggtgagta atgtctggga120aactgcctga tggaggggga taactactgg aagcggtagc taataccgca taacgtcgca180agaccaaaga gggggacctt cgggcctctt gccatcagat gtgcccagat gggattagct240agtaggtggg gtaacggctc acctaggcga cgatccctag ctggtctgag aggatgacca300gccacactgg aactgagaca cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg360cacaatgggc gcaagcctga tgcagccatg ccgcgtgtat gaagaaggcc ttcgggttgt420aaagtacttt cagcggggag gaaggtgttg aggttaataa cctcagcaat tgacgttacc480cgcagaagaa gcaccggcta actccgtgcc agcagccgcg gtaatacgga agggtgcaag540cgttaatcgg aattactggg gcgtaaagcg cacgcaggcg gtctgtcaag tcggatgtga600aatccccggg ctcaacctgg gaactgcatt cgaaactggc aggctagagt cttgtagagg660ggggtagaat tccaggtgta gcggtgaaat gcgtagagat ctggaggaat accggtggcg720aaggcggccc cctggacaaa gactgacgct caggtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga780ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgtcgact tggaggttgt gcccttgagg840cgtggcttcc ggagctaacg cgttaagtcg accgcctggg gagtacggcc gcaaggttaa900
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實(shí)施例3利用陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)B5CGMCC No.1401生產(chǎn)低聚半乳糖1.菌種培養(yǎng)選擇本發(fā)明分離篩選出的菌株陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)B5CGMCCNo.1401，以常規(guī)方法活化、再轉(zhuǎn)接入產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)液培養(yǎng)。
上述產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基配方是乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，CaCl20.11g/L，MnSO40.001g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，KH2PO40.05g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03g/L，pH7.0～7.5(細(xì)菌)或pH6.0～6.5(真菌)。
經(jīng)過系列實(shí)驗(yàn)摸索優(yōu)化產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)液，最終陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)B5 CGMCC No.1401的產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基配方簡化為乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，氯化鈉3g/L，pH7.5。
將陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)B5 CGMCC No.1401接種至新鮮斜面培養(yǎng)基活化后，接一環(huán)到50mL上述產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)液，于37℃搖床培養(yǎng)16小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分，或培養(yǎng)后再轉(zhuǎn)接入500mL相同產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)液擴(kuò)大培養(yǎng)，陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)B5 CGMCC No.1401在上述培養(yǎng)基中生長產(chǎn)酶良好；培養(yǎng)結(jié)束后，12,000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，收獲陰溝腸桿菌細(xì)胞。
穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，該菌株具有非常高的穩(wěn)定性，數(shù)代后產(chǎn)酶能力沒有降低。
上述斜面培養(yǎng)基配方為乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，氯化鈉3g/L，瓊脂20g/L，pH7.5。
2.轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)取上述50mg制備的陰溝腸桿菌細(xì)胞，加250μL、pH 7.0的50mmol/L磷酸鉀緩沖液洗滌一次，陰溝腸桿菌細(xì)胞再重懸浮于50μL相同的緩沖液，-20℃以下完全冷凍后，置室溫解凍，再重復(fù)凍融2次，所得懸液即為β-半乳糖苷酶粗酶液。
取100μL上述粗酶液，加入300μL、pH 7.0磷酸鉀緩沖液配制的30％(w/v)乳糖溶液，于50℃水浴搖床反應(yīng)4小時(shí)，12,000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，上清即為轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物。
對上述轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物進(jìn)行高效液相色譜分析和薄層掃描分析，低聚半乳糖得率約為54.5％。
上述HPLC分析所用設(shè)備及條件島津(SHIMADZU)高效液相色譜儀；島津RID-10A示差檢測器；BIO-RAD Aminex HPX-42C柱(300mm×7.8mm)；流動相為三蒸水，流速為0.2mL/min，柱溫80℃；結(jié)果分析軟件為Class-VP6.0。轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物用0.2μm濾膜過濾后，稀釋成5％(w/v)的糖溶液，進(jìn)樣分析。
上述薄層掃描分析所用設(shè)備及條件島津(SHIMADZU)CS-9301雙波長飛點(diǎn)薄層掃描儀；檢測波長為550nm。取0.5uL轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物在TLC薄板上點(diǎn)樣后，在展層劑(正丁醇∶乙醇∶水＝5∶3∶2)中展開，霧噴顯色劑(20％硫酸溶液+0.5％的3，5-二羥基甲苯)，于120℃烘烤10分鐘，糖斑點(diǎn)顯色后，進(jìn)行掃描分析。
序列表SEQ ID No.1<110>山東大學(xué)<120>一種轉(zhuǎn)糖基β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌<141>2005-6-16<211>1534<212>DNA<213>陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)<221>陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)B5 CGMCC No.1401 16S rDNA<222>(1)…(1534)<400>
agagtttgat catggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgaac60ggtagcacag agagcttgct ctcgggtgac gagtggcgga cgggtgagta atgtctggga120aactgcctga tggaggggga taactactgg aagcggtagc taataccgca taacgtcgca180agaccaaaga gggggacctt cgggcctctt gccatcagat gtgcccagat gggattagct240agtaggtggg gtaacggctc acctaggcga cgatccctag ctggtctgag aggatgacca300gccacactgg aactgagaca cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg360cacaatgggc gcaagcctga tgcagccatg ccgcgtgtat gaagaaggcc ttcgggttgt420aaagtacttt cagcggggag gaaggtgttg aggttaataa cctcagcaat tgacgttacc480cgcagaagaa gcaccggcta actccgtgcc agcagccgcg gtaatacgga agggtgcaag540cgttaatcgg aattactggg gcgtaaagcg cacgcaggcg gtctgtcaag tcggatgtga600aatccccggg ctcaacctgg gaactgcatt cgaaactggc aggctagagt cttgtagagg660ggggtagaat tccaggtgta gcggtgaaat gcgtagagat ctggaggaat accggtggcg720aaggcggccc cctggacaaa gactgacgct caggtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga780ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgtcgact tggaggttgt gcccttgagg840cgtggcttcc ggagctaacg cgttaagtcg accgcctggg gagtacggcc gcaaggttaa900aactcaaatg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgatgc960aacgcgaaga accttaccta ctcttgacat ccagagaact tagcagagat gctttggtgc1020cttcgggaac tctgagacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgttg tgaaatgttg1080ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta tcctttgttg ccagcggtcc ggccgggaac1140tcaaaggaga ctgccagtga taaactggag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcatcatgg1200cccttacgag tagggctaca cacgtgctac aatggcgcat acaaagagaa gcgacctcgc1260gagagcaagc ggacctcata aagtgcgtcg tagtccggat tggagtctgc aactcgactc1320catgaagtcg gaatcgctag taatcgtgga tcagaatgcc acggtgaata cgttcccggg1380ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg agtgggttgc aaaagaagta ggtagcttaa1440ccttcgggag ggcgcttacc actttgtgat tcatgactgg ggtgaagtcg taacaaggta1500accgtagggg aacctgcggc tggatcacct cctt153權(quán)利要求
1.一株轉(zhuǎn)糖基β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌，其特征在于該菌名為陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)B5，已于2005年6月30日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.1401。
2.如權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)糖基β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌，具有如下生物學(xué)特征形態(tài)學(xué)特征是革蘭氏陰性桿菌；在LB培養(yǎng)基上，菌體形態(tài)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長發(fā)生變化，從長桿狀到短桿狀、橢球形、最后縮至球形，染色的大小為0.5-1.5×0.7-9.0微米；單個(gè)、成對或短鏈狀排列；以周生鞭毛運(yùn)動；不形成芽孢；生理生化特征是能利用檸檬酸鹽或醋酸鹽為唯一碳源；37℃發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣；甘油發(fā)酵不產(chǎn)氣；不水解七葉靈；不產(chǎn)生吲哚；V.P.測定陽性；甲基紅測定陰性；還原硝酸鹽；賴氨酸不脫羧，有鳥氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、脲酶；該菌的16S rDNA核苷酸序列長度為1534堿基，具有如SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求1或2所述轉(zhuǎn)糖基β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌，其特征是，所述陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)B5 CGMCC No.1401在乳糖斜面培養(yǎng)基中傳代穩(wěn)定；在LB液體培養(yǎng)基中生長良好；在產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中生長良好，并且產(chǎn)生轉(zhuǎn)糖基β-半乳糖苷酶；培養(yǎng)溫度為35～40℃；培養(yǎng)時(shí)間為15～24小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/分；上述LB培養(yǎng)基配方蛋白胨10±1g/L，酵母粉5±1g/L，氯化鈉7±1g/L，pH7.0～7 5，121℃滅菌20分鐘；篩選上述陰溝腸桿菌所用的選擇培養(yǎng)基或斜面培養(yǎng)基配方是乳糖10±2g/L，蛋白胨5±2g/L，酵母粉10±2g/L，氯化鈉3±2g/L，pH7.0～7.5，固體培養(yǎng)基加瓊脂20±2g/L，112℃滅菌30分鐘；上述產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基配方是乳糖10±2g/L，蛋白胨5±2g/L，酵母粉10±2g/L，氯化鈉3±2g/L，pH7.0～7.5，112℃滅菌30分鐘。
4.如權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)糖基β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌，其特征是，所述培養(yǎng)溫度為37℃。
5.如權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)糖基β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌，其特征是，所述培養(yǎng)時(shí)間為16～18小時(shí)。
6.如權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)糖基β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌，其特征是，所述陰溝腸桿菌的選擇培養(yǎng)基或斜面培養(yǎng)基配方是乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，氯化鈉3g/L，pH7.5，固體培養(yǎng)基加瓊脂20g/L。
7.如權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)糖基β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌，其特征是，所述產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基配方是乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，氯化鈉3g/L，pH7.5。
8.權(quán)利要求1或2所述的轉(zhuǎn)糖基β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌在制備轉(zhuǎn)糖基β-半乳糖苷酶的生產(chǎn)中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1或2所述的轉(zhuǎn)糖基β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌在制備低聚半乳糖的生產(chǎn)中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)糖基β-半乳糖苷酶產(chǎn)生菌在制備低聚半乳糖的生產(chǎn)中的應(yīng)用，其特征是，所述陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)B5 CGMCC No.1401產(chǎn)生的轉(zhuǎn)糖基β-半乳糖苷酶以乳糖為底物催化生產(chǎn)低聚半乳糖。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株轉(zhuǎn)糖基β－半乳糖苷酶產(chǎn)生菌，該菌名為陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)B5，保藏編號為CGMCC No.1401。該菌為革蘭氏陰性桿菌；在LB培養(yǎng)基上，菌體形態(tài)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長發(fā)生變化，從長桿狀到短桿狀、橢球形、最后縮至球形，染色的大小為0.5－1.5×0.7－9.0微米；單個(gè)、成對或短鏈狀排列；以周生鞭毛運(yùn)動；不形成芽孢；能利用檸檬酸鹽或醋酸鹽為唯一碳源；37℃發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣；甘油發(fā)酵不產(chǎn)氣；不水解七葉靈；不產(chǎn)生吲哚；V.P.測定陽性；甲基紅測定陰性；還原硝酸鹽；賴氨酸不脫羧，有鳥氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、脲酶；該菌的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。該菌產(chǎn)生的β－半乳糖苷酶能以乳糖為底物催化生產(chǎn)低聚半乳糖。
文檔編號C12P19/00GK1837355SQ20051004409
公開日2006年9月27日 申請日期2005年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月21日
發(fā)明者肖敏, 盧麗麗 申請人:山東大學(xué)

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