本發(fā)明涉及分析檢測，尤其是涉及一種低聚半乳糖的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、低聚半乳糖（galactooligosaccharides, gos）是一種具有天然屬性的功能性低聚糖，主要存在于動物乳汁和母乳中，已被允許作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑添加到嬰幼兒配方奶粉等食品中，同時在醫(yī)藥和飼料等行業(yè)也受到廣泛關(guān)注。gos的分子結(jié)構(gòu)是在半乳糖或葡萄糖一端通過不同糖苷鍵（有α/β構(gòu)型和不同的連接位置（(1→6)，(1→4)，(1→3)或(1→2)））連接1~7個半乳糖基，即(gal)n-gal/glc（n=1～7）（gal, galactose, 半乳糖；glc, glucose,葡萄糖）。gos目前主要采用半乳糖苷酶催化乳糖制備，受酶來源和反應(yīng)條件的影響，不同企業(yè)生產(chǎn)的gos在化學(xué)組成上存在較大差異。構(gòu)效關(guān)系研究顯示gos的功能與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，含不同糖苷鍵的異構(gòu)體或由不同單糖組成的異構(gòu)體往往具有不同的生物活性。近年來，隨著理論上定向改造半乳糖苷酶以用于定向合成具有特定功能活性的特定gos組分成為可能，對特定構(gòu)型gos組分的分析也提出了要求。因此，開發(fā)gos中不同異構(gòu)體組分的定性分析方法，對建立完整的gos異構(gòu)體營養(yǎng)價值判定體系，引導(dǎo)工業(yè)生產(chǎn)出高活性、高穩(wěn)定性和高附加值的gos產(chǎn)品具有重要意義，有助于增強(qiáng)我國乳制品與微生態(tài)營養(yǎng)健康科技的應(yīng)用發(fā)展及國發(fā)健康。

2、由于聚合度、單糖組成和糖苷鍵的不同，gos的組成復(fù)雜且存在多種異構(gòu)體，這對gos各組分的定性分析提出了挑戰(zhàn)。液相色譜技術(shù)是目前gos分析檢測的主要方法，具體包括：高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，hplc）和離子色譜法中的高效陰離子交換色譜法（high performance anion exchange chromatography，hpaec）。然而這些方法存在分析周期較長、樣品前處理步驟復(fù)雜、多種異構(gòu)體的分離鑒定難度大等問題。核磁共振譜（nuclear magnetic resonance，nmr）可以區(qū)分異構(gòu)體，但該法需要預(yù)先獲得高純度組分，而純化獲得高純度組分需要較長周期且步驟繁瑣。質(zhì)譜（massspectrometry，ms）是眾多分析技術(shù)中同時具備靈敏度高、特異性好、響應(yīng)速度快的分析技術(shù)，尤其是高分辨質(zhì)譜，其針對基質(zhì)復(fù)雜的樣品在靈敏度和抗干擾能力方面表現(xiàn)出絕對優(yōu)勢，正成為糖類檢測方法的重要發(fā)展趨勢。然而，僅僅通過高分辨質(zhì)譜的m/z值無法區(qū)分具有相同m/z值的異構(gòu)體。

3、因此，有必要開發(fā)一種能夠快速鑒定gos糖苷鍵的α/β構(gòu)型和糖苷鍵的連接位置的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明第一方面提出一種低聚半乳糖的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法，能夠有效快速鑒定低聚半乳糖糖苷鍵的α/β構(gòu)型和/或糖苷鍵的連接位置。

2、本發(fā)明第二方面還提供一種應(yīng)用。

3、根據(jù)本發(fā)明的第一方面實(shí)施例提供的一種低聚半乳糖的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法，包括如下步驟：

4、s1、標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制：將不同的糖標(biāo)準(zhǔn)品配制成糖標(biāo)準(zhǔn)品儲備液；

5、s2、將實(shí)際樣品進(jìn)行前處理得到待測液；

6、s3、液相色譜質(zhì)譜檢測：將s1的糖標(biāo)準(zhǔn)品儲備液和s2的待測液通過液相色譜質(zhì)譜進(jìn)行分離測定；

7、s4、色譜質(zhì)譜圖分析：記錄標(biāo)準(zhǔn)品和待測液中各色譜峰的保留時間，以及標(biāo)準(zhǔn)品和待測液中各色譜峰在串聯(lián)質(zhì)譜圖上的特征子離子和母離子強(qiáng)度；計算特征子離子/母離子強(qiáng)度的比值；通過保留時間和色譜峰在串聯(lián)質(zhì)譜圖上的子離子與母離子強(qiáng)度比值來鑒定低聚半乳糖中二糖、三糖和四糖糖苷鍵的α/β構(gòu)型和/或糖苷鍵的連接位置。

8、根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的檢測方法，至少具有如下有益效果：

9、本發(fā)明基于液相色譜質(zhì)譜分析提出了一種利用低聚半乳糖中二糖、三糖和四糖各異構(gòu)體在親水柱上的保留時間，以及低聚半乳糖中二糖、三糖和四糖在親水柱上分離的各異構(gòu)體在串聯(lián)質(zhì)譜圖上的子離子與母離子強(qiáng)度比值，來鑒定低聚半乳糖中二糖、三糖和四糖糖苷鍵的α/β構(gòu)型和/或糖苷鍵的連接位置的方法。本發(fā)明操作簡便、可直觀快速鑒定低聚半乳糖的結(jié)構(gòu)，可廣泛應(yīng)用于各種低聚半乳糖產(chǎn)品及含低聚半乳糖食品中低聚半乳糖的結(jié)構(gòu)分析，為低聚半乳糖的構(gòu)效關(guān)系研究提供了可靠的方法，有利于高活性低聚半乳糖產(chǎn)品的開發(fā)和質(zhì)量控制。

10、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述標(biāo)準(zhǔn)品儲備液的濃度為0.001~0.1 mg/ml。

11、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述標(biāo)準(zhǔn)品包括曲二糖(α-glc-[1→2]-glc)、異麥芽糖(α-glc-[1→6]-glc)、黑曲霉二糖(α-glc-[1→3]-glc)、蜜二糖(α-gal-[1→6]-glc)、麥芽糖(α-glc-[1→4]-glc)、1,4-半乳二糖(β-gal-[1→4]-gal)、1,6-半乳二糖(β-gal-[1→6]-gal)、乳糖(β-gal-[1→4]-glc)、纖維二糖(β-glc-[1→4]-glc)、槐糖(β-glc-[1→2]-glc)、昆布二糖(β-glc-[1→3]-glc)、龍膽二糖(β-glc-[1→6]-glc)、麥芽三糖(α-glc-[1→4]-α-glc-[1→4]-glc)、纖維三糖(β-glc-[1→4]-β-glc-[1→4]-glc)、異麥芽三糖(α-glc-[1→6]-α-glc-[1→6]-glc)、黑曲霉三糖(α-glc-[1→3]-α-glc-[1→3]-glc)、昆布三糖(β-glc-[1→3]-β-glc-[1→3]-glc)、麥芽四糖(α-glc-[1→4]-α-glc-[1→4]-α-glc-[1→4]-glc)、纖維四糖(β-glc-[1→4]-β-glc-[1→4]-β-glc-[1→4]-glc)、異麥芽四糖(α-glc-[1→6]-α-glc-[1→6]-α-glc-[1→6]-glc)、黑曲霉四糖(α-glc-[1→3]-α-glc-[1→3]-α-glc-[1→3]-glc)、昆布四糖(β-glc-[1→3]-β-glc-[1→3]-β-glc-[1→3]-glc)中的至少一種。

12、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述液相色譜的條件為：

13、色譜柱：infinity lab poroshell 120 hilic（3.0 mm×100 mm, 2.7 μm）；柱溫：30~40 ℃；進(jìn)樣量：0.5~2 μl；流速：0.4~0.7 ml/min；

14、流動相：水（a）-乙腈（b）；梯度洗脫：0~10 min，90%~75% b；10~10.5 min，75%~90%b；10.5~15.5 min，90% b。

15、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述質(zhì)譜條件為：電噴霧離子源：正離子，質(zhì)譜掃描范圍：m/z 50~1000 ；全掃描模式和母離子（m/z）：[c12h22o11+na]+（m/z 365.1054）、[c18h32o16+na]+（m/z 527.1583）、[c24h42o21+na]+（m/z 689.2111）的串聯(lián)質(zhì)譜掃描。

16、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，步驟s4中，所述色譜質(zhì)譜圖分析包括，記錄標(biāo)準(zhǔn)品和待測液中各色譜峰的保留時間，以及標(biāo)準(zhǔn)品和待測液中各色譜峰在串聯(lián)質(zhì)譜圖上的特征子離子和母離子強(qiáng)度；計算特征子離子/母離子強(qiáng)度的比值；以保留時間為橫坐標(biāo)，特征子離子/母離子強(qiáng)度的比值為縱坐標(biāo)對標(biāo)準(zhǔn)品和待測液作圖；以不同結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)品和/或不同樣品為橫坐標(biāo)，特征子離子/母離子強(qiáng)度的比值為縱坐標(biāo)作圖。

17、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，步驟s4中，所述色譜質(zhì)譜圖分析包括，通過對全掃描模式色譜圖提取離子m/z 365.1054、m/z 527.1583和m/z 689.2111以獲取提取離子色譜圖，根據(jù)m/z 365.1054的提取離子色譜圖記錄標(biāo)準(zhǔn)品和待測液中二糖各異構(gòu)體色譜峰的保留時間，根據(jù)m/z 527.1583的提取離子色譜圖記錄標(biāo)準(zhǔn)品和待測液中三糖各異構(gòu)體色譜峰的保留時間，根據(jù)m/z 689.2111的提取離子色譜圖記錄標(biāo)準(zhǔn)品和待測液中四糖各異構(gòu)體色譜峰的保留時間；基于母離子[c12h22o11+na]+（m/z 365.1054）的串聯(lián)質(zhì)譜掃描獲取二糖各異構(gòu)體色譜峰的串聯(lián)質(zhì)譜圖，基于母離子[c18h32o16+na]+（m/z 527.1583）的串聯(lián)質(zhì)譜掃描獲取三糖各異構(gòu)體色譜峰的串聯(lián)質(zhì)譜圖，基于母離子[c24h42o21+na]+（m/z 689.2111）的串聯(lián)質(zhì)譜掃描獲取四糖各異構(gòu)體色譜峰的串聯(lián)質(zhì)譜圖，根據(jù)二糖、三糖和四糖各異構(gòu)體色譜峰的串聯(lián)質(zhì)譜圖記錄標(biāo)準(zhǔn)品和待測液中二糖、三糖和四糖各異構(gòu)體色譜峰在串聯(lián)質(zhì)譜圖上的特征子離子和母離子強(qiáng)度；所述特征子離子為[m+na-18]+、[m+na-60]+、[m+na-120]+、[m+na-162]+（對于二糖，m代表c12h22o11，對于三糖，m代表c18h32o16，對于四糖，m代表c24h42o21）；計算子離子/母離子強(qiáng)度的比值：[m+na-162]+/[m+na]+、[m+na-18]+/[m+na]+、[m+na-60]+/[m+na]+、[m+na-120]+/[m+na]+；以保留時間為橫坐標(biāo)，[m+na-162]+/[m+na]+為縱坐標(biāo)對標(biāo)準(zhǔn)品和待測液作圖，以及以不同結(jié)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)品和/或不同樣品為橫坐標(biāo)，[m+na-18]+/[m+na]+、[m+na-60]+/[m+na]+、[m+na-120]+/[m+na]+為縱坐標(biāo)作圖。

18、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述前處理包括將低聚半乳糖樣品溶于水，過濾即得待測液；或?qū)械途郯肴樘堑奈镔|(zhì)與水混勻超聲，加入沉淀劑、混勻靜置、離心、取上清液加水稀釋，過濾得待測液。

19、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述沉淀劑為乙腈。

20、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述含有低聚半乳糖的物質(zhì)包括含低聚半乳糖的奶粉、米粉、酸奶、乳酸菌飲料中的至少一種。

21、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，低聚半乳糖樣品的濃度在0.004~0.4 mg/ml。

22、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述超聲的時間為10~30 min。

23、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述離心的轉(zhuǎn)速為4000~6000 r/min。

24、根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述稀釋的倍數(shù)為10~50倍。

25、根據(jù)本發(fā)明的第二方面實(shí)施例提供的上述所述的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法在鑒別低聚半乳糖的結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用。

26、本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的說明書中闡述，并且，部分地從說明書中變得顯而易見，或者通過實(shí)施本發(fā)明而了解。

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網(wǎng)址: 一種低聚半乳糖的液相色譜 http://m.u1s5d6.cn/newsview393824.html