1.本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)母乳脂質(zhì)替代品釀酒酵母菌株及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

2.嬰幼兒是處于特殊成長(zhǎng)階段的群體，在這一階段，需要攝入大量且全面的營(yíng)養(yǎng)，這一時(shí)期攝入營(yíng)養(yǎng)的數(shù)量和質(zhì)量直接影響到嬰幼兒未來(lái)的生長(zhǎng)發(fā)育。母乳是嬰幼兒獲取能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的最直接來(lái)源，含有大量能夠促進(jìn)嬰兒健康生長(zhǎng)發(fā)育的特殊成分。
3.母乳脂質(zhì)是母乳的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，占母乳的3％-5％，母乳脂質(zhì)中98％為甘油三酯，是嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育的主要能量來(lái)源。在嬰幼兒0-6個(gè)月時(shí)，母乳脂質(zhì)提供了嬰幼兒所需的40％-50％的能量，同時(shí)，母乳脂質(zhì)還為嬰幼兒提供人體必需脂肪酸。研究發(fā)現(xiàn)，不僅僅是脂肪酸組成，母乳脂質(zhì)的脂肪酸分布位置也是關(guān)系到嬰幼兒是否能吸收母乳中營(yíng)養(yǎng)成分的關(guān)鍵。母乳脂質(zhì)中，2號(hào)位(sn-2)有將近50％是棕櫚酸，這一特定的甘油三酯結(jié)構(gòu)使得嬰幼兒能夠更好地吸收鈣離子，可以有效預(yù)防嬰幼兒腹瀉，避免嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)不良，降低嬰兒死亡率。然而，母乳喂養(yǎng)雖是嬰兒最好的喂養(yǎng)方式，但是在由于某些原因?qū)е聼o(wú)法使用母乳進(jìn)行喂養(yǎng)的情況下，以母乳為黃金標(biāo)準(zhǔn)的適合嬰兒的嬰配奶粉就成為替代母乳的理想產(chǎn)品。
4.近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究不僅聚焦于母乳脂肪酸組成含量，更加關(guān)注于母乳脂肪酸在甘油三酯中的位置分布，在母乳脂肪中，棕櫚酸(16:0)酯化到甘油主鏈的中間(sn-2或β)位置，油酸(18:1)主要酯化到外部(sn-1,3)位置，使三酰甘油(tg)具有獨(dú)特的立體異構(gòu)體結(jié)構(gòu)，有助于嬰兒腸道的營(yíng)養(yǎng)吸收。然而，大多數(shù)嬰兒配方奶粉中使用的脂肪來(lái)自動(dòng)物，與母乳中甘油三酯結(jié)構(gòu)不同的是動(dòng)物甘油三酯中不飽和脂肪酸如c18:1主要處于甘油主鏈的中間(sn-2或β)位置，而飽和脂肪酸如c16:0主要處于甘油主鏈的外部(sn-1,3)位置，這不利于嬰兒的吸收與生長(zhǎng)。
5.目前，母乳脂質(zhì)替代品(特定結(jié)構(gòu)的甘油三酯)主要是通過(guò)酶法合成，在市場(chǎng)上占據(jù)主要地位。如熊志琴(母乳脂替代品的酶法制備及性質(zhì)研究)以油茶籽油為原料，棕櫚酸為酰基供體，在有機(jī)溶劑體系中酶法合成sn-2位富含棕櫚酸甘油三酯。隨著母乳脂質(zhì)替代品的生產(chǎn)研發(fā)，生物從頭合成法由于其易于調(diào)控，可以合成出人們所需的各種產(chǎn)物愈發(fā)受到關(guān)注。通過(guò)基因工程改造工業(yè)生產(chǎn)菌株生產(chǎn)特定脂質(zhì)組成具有巨大的潛力，同時(shí)采用基因工程法構(gòu)建基因工程菌株從頭合成產(chǎn)物其具有低成本、原料不受限制、提取過(guò)程簡(jiǎn)單、無(wú)季節(jié)性、生產(chǎn)時(shí)間短，對(duì)環(huán)境污染小等諸多優(yōu)點(diǎn)，從而受到廣大學(xué)者的青睞。如有研究在擬南芥中使用基因工程合成了一株可以合成母乳替代品的擬南芥植株；在微生物中也有研究者通過(guò)改變底物供給合成母乳替代品。但目前尚未有通過(guò)從頭合成制備母乳脂質(zhì)替代品的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

6.為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種合成母乳脂質(zhì)替代品的釀酒酵母工程菌，通過(guò)將異源的溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶整合至釀酒酵母以及敲除自身天然溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)
移酶的方式，增加棕櫚酸(c16:0)在釀酒酵母生產(chǎn)的甘油三酯sn-2位置的含量，合成母乳替代脂。并在此基礎(chǔ)上敲除代謝途徑相關(guān)基因，進(jìn)一步增加產(chǎn)物中母乳脂質(zhì)替代品的含量。
7.本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)母乳脂質(zhì)替代品的釀酒酵母菌株，所述釀酒酵母菌株表達(dá)了溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶crlpaat1，敲除了編碼溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶的基因slc1、ale1和loa1，以及敲除了編碼甘油三酯水解酶的基因tgl3、tgl4和tgl5；
8.所述溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶crlpaat1敲除了自身定位信號(hào)肽，并在c端連接了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)肽。
9.進(jìn)一步地，所述溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶crlpaat1的核苷酸序列如seq id no.4所示。具體地，序列如下：
10.caaaaaagatctcaaaacagaagaaccaacccaagcagccaaaaccaaagcaacaacttgttgagcagcaccagtagcagccaaagctgcagccaaacctctccaagaaccataacaaacaccagcaaaaaccaaaatagaaaccaaagtaatagccaattgttgaacccacatagatgaagaataagaataagcttgtggaccaggcatagaaaatcttggaacatttttcaaatcttccaaaccataagtagcagcccaacaagaatcccaagtagcttgcaaatcagtaaaaaaagcttcaaaatttggataatcagcagatttcaaaaccttagaaaaagtagtaacacaagttctaccaaaatgaacagattgagatttttcagacaaaacttcatctttacctctagtaacaacaatttgaacaggcaattttctagaatgagcataatgcaacatacctcttttcaatggcaaagaagcaggtttagtagatctatgaccttcaggataaaccaacaaaccaggaacatgagaagaacccaaagtttgatccaaccaagcattaaaagcttctttatcagcaatagtacctctcttaaacaaaacaatacctttcaaaatcatgcaagaagtacaaaaaacagggaaaacaaaataaaccaaccatctagacattaaagcagctctaccttcagtcaaataagcatcaataaaaaaatcagcccaagatctatgattacacaaatacaaacatggaccacctttatacaaagtatgttcaccagcttgcaacaaagtaactctaaaataagcaaccaaagctctagcccaatccaacatatcatttcttttacccaaagaagcgaatctgattctatataaaatagcaaagattggtaaagaccaataaaaaacaaaaacagaaaacaagaaagatggtaaacccaaccatttagtcaaaacagacat。
11.進(jìn)一步地，所述溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶crlpaat1的自身定位信號(hào)肽的核苷酸序列如seq id no.8所示。具體地，序列如下：
12.ttgatccaaccaagcattaaaagcttctttatcagcaatagtacctctcttaaacaaaacaatacctttcaaaatcatgcaagaagtacaaaaaacagggaaaacaaaataaaccaaccatctagacattaaagcagctctaccttcagtcaaataagcatcaataaaaaaatcagcccaagatctatgattacacaaatacaaacatggaccacctttatacaaagtatgttcaccagcttgcaacaaagtaactctaaaataagcaaccaaagctctagcccaatccaacatatcatttcttttacccaaagaagcgaatctgattctatataaaatagcaaagattggtaaagaccaataaaaaacaaaaacagaaaacaagaaagatggtaaacccaaccatttagtcaaaacaga。
13.進(jìn)一步地，所述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)肽為hdel，其核苷酸序列如seq id no.13所示。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)肽在異源溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶中進(jìn)行表達(dá)，對(duì)異源?；D(zhuǎn)移酶進(jìn)行修飾，使其可以駐留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中并發(fā)揮功能。具體地，序列如下：
14.tcagaacaagcagcacaacaagcagttaataatgcgggctggtcagttatttcagcagcacaactgggctatgcgggcaaaacagatgcaagaggcacatattatggcgaaacagcgggctatacaacagcacaagcagaagttctgggcaaatatgattcagaaggcaatctgacagcaattggcatttcatttagaggcacaagcggcccgagagaatcactgattggcgatacaattggcgatgttattaatgatctgctggcgggcttcggcccgaaaggctatgcagatggctatacactgaaagcatttggccaactgctgggcgatgttgcaaaatttgcacaagcacatggcctgagcggcgaagatgttgtggttagcggccat。
15.進(jìn)一步地，編碼溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶crlpaat1的基因以質(zhì)粒pmhylp-leu為表達(dá)載體，pmhylp-leu的核苷酸序列如seq id no.5所示。
16.進(jìn)一步地，所述slc1的核苷酸序列如seq id no.15所示，所述ale1的核苷酸序列如seq id no.16所示，所述loa1的核苷酸序列如seq id no.17所示。
17.進(jìn)一步地，所述tgl3的核苷酸序列如seq id no.18所示，所述tgl4的核苷酸序列如seq id no.19所示，所述tgl5的核苷酸序列如seq id no.20所示。
18.進(jìn)一步地，所述重組釀酒酵母菌株以釀酒酵母s.cerevisiae cen pk2-1c、w303、fy1679或by4743為出發(fā)菌株。
19.本發(fā)明的重組釀酒酵母菌株的構(gòu)建方法，包括以下步驟，以下步驟可為任意順序：
20.s1、敲除溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶基因的自身定位信號(hào)肽，并在c端連接內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)肽，得到去溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶基因，將所述去溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶基因?qū)脶劸平湍钢校?br>21.s2、敲除釀酒酵母自身的溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(slc1、ale1和loa1)；
22.s3、敲除釀酒酵母自身的甘油三酯水解酶(tgl3、tgl4和tgl5)，得到所述重組釀酒酵母菌株。
23.進(jìn)一步地，在步驟s1中，將溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶基因采用cre/loxp技術(shù)整合至釀酒酵母基因組，包括以下步驟：
24.1)所述溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶編碼基因通過(guò)cre/loxp系統(tǒng)如seq id no.5、seq id no.6和seq id no.7所示進(jìn)行基因整合表達(dá)，選用組成型啟動(dòng)子p
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cyc1
，設(shè)計(jì)pcr的引物，使基因表達(dá)框相鄰片段的重疊區(qū)達(dá)到40～100bp，構(gòu)建crlpaat1(ncbi reference sequence:xp_042921325.1)的基因表達(dá)整合框。
25.2)通過(guò)cre/loxp的方法將溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)框整合至釀酒酵母104c、416d、208c、1622a、308a和911b位點(diǎn)。
26.進(jìn)一步地，在步驟s2中，使用cre/loxp方法將釀酒酵母自身編碼溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶ale1、loa1和slc1基因敲除。
27.本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述釀酒酵母菌株在制備母乳脂質(zhì)替代品中的應(yīng)用。
28.進(jìn)一步地，所述的應(yīng)用為，以葡萄糖為底物，發(fā)酵生產(chǎn)母乳脂質(zhì)替代品。
29.進(jìn)一步地，發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，ph為6.0-8.0。
30.進(jìn)一步地，發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，溫度為20-30℃。
31.進(jìn)一步地，將上述釀酒酵母菌株接種至以葡萄糖為碳源無(wú)氨基氮源無(wú)菌培養(yǎng)基、限制氮源的ypd無(wú)菌培養(yǎng)基、無(wú)機(jī)鹽無(wú)菌培養(yǎng)基或限制氮源的大豆蛋白胨無(wú)菌培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，在ph＝6.0-8.0，200-300rpm，20-30℃條件下通氣發(fā)酵。
32.本發(fā)明的有益效果：
33.本發(fā)明提供的重組釀酒酵母可實(shí)現(xiàn)以葡萄糖為碳源的無(wú)菌培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)母乳替代脂，為代謝工程改造釀酒酵母合成母乳脂質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明提供的重組釀酒酵母的構(gòu)建方法簡(jiǎn)單，便于使用，具有很好地應(yīng)用前景。
附圖說(shuō)明
34.圖1為改變異源基因crlpaat1定位；
35.圖2為薄層層析分離甘油三酯結(jié)果；
36.圖3為不同菌株中總脂肪酸和sn-2位c16:0的相對(duì)含量。
具體實(shí)施方式
37.下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以更好地理解本發(fā)明并能予以實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對(duì)本發(fā)明的限定。
38.涉及的實(shí)驗(yàn)材料：
39.250ml搖瓶，分析天平，滅菌鍋，重組菌株，搖床
40.培養(yǎng)基(g/l)：
41.ynb培養(yǎng)基：ynb 3.4，硫酸銨10，葡萄糖20，尿嘧啶0.05，組氨酸0.05，亮氨酸0.05，色氨酸0.05；
42.限制氮源的ypd無(wú)菌培養(yǎng)基：葡萄糖20，酵母提取物10，蛋白胨10；
43.無(wú)機(jī)鹽無(wú)菌培養(yǎng)基：葡萄糖10，(nh4)2so
4 1，k2hpo
4 0.125，khpo
4 0.875，ki 0.0001，mgso4·
7h2o 0.5，cacl2·
2h2o 0.l，nacl 0.1，維量元素母液lml，維生素母液lml；
44.以及限制氮源基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20，硫酸銨4，kh2po
4 2.5,mgso4·
7h2o 0.5；
45.種子培養(yǎng)基：ynb培養(yǎng)基,無(wú)機(jī)鹽無(wú)菌培養(yǎng)基,限制氮源的ypd無(wú)菌培養(yǎng)基,限制氮源基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基；
46.發(fā)酵培養(yǎng)基：ynb培養(yǎng)基,無(wú)機(jī)鹽無(wú)菌培養(yǎng)基,限制氮源的ypd無(wú)菌培養(yǎng)基,限制氮源基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基。
47.涉及的檢測(cè)方法：
48.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gc-ms)檢測(cè)法：島津(gcms-qp2010 se)，sh-rtx-wax色譜柱，流動(dòng)相為he，柱溫100℃，進(jìn)樣量1μl，分流比20:1，流量1.0ml/min。
49.本發(fā)明中，以重組釀酒酵母s.cerevisiae cen pk2-1c mata；ura3-52；trp1-289；leu2-3,112；his3-δ1；mal2-8c；suc2；s.cerevisiae w303 mata；ura3-1；trp1-δ1；leu2-3,112；his3-11；ade2-1；can1-100；s.cerevisiae fy1679 mata；ura3-52；trp1-δ63；leu2-δ1；his3-δ200；gal2和s.cerevisiae by4743 mata；ura3-δ0；met15-δ0；leu2-δ0；his3-δ1；lys-δ0為出發(fā)菌株，采用cre/loxp方法將衣藻屬來(lái)源的溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶整合至釀酒釀酒酵母基因組，獲得具有合成母乳脂質(zhì)替代品(甘油三酯)能力的釀酒酵母菌株。
50.釀酒酵母是又稱面包酵母或者出芽酵母。釀酒酵母是與人類關(guān)系最廣泛的一種酵母，作為食品安全菌株已用于制作面包和饅頭等食品、釀酒工業(yè)。近年來(lái)，學(xué)者們開(kāi)始研究利用釀酒酵母生產(chǎn)天然產(chǎn)物，如青蒿酸、三七皂苷等。釀酒酵母具有高安全性，低致病性，高抗逆性，而且受噬菌體污染的概率較低等優(yōu)點(diǎn)，因此它也在基因工程領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。然而，釀酒酵母自身甘油三酯結(jié)構(gòu)與母乳相差較大。因此，為了獲得母乳脂質(zhì)替代品生產(chǎn)工程菌株，我們采用cre/loxp技術(shù)將?；D(zhuǎn)移酶代謝途徑整合至釀酒酵母，以達(dá)到生產(chǎn)母乳脂質(zhì)替代品的效果。
51.以下實(shí)施例所用引物見(jiàn)下表：
[0052][0053]
[0054][0055]
實(shí)施例1異源?；D(zhuǎn)移酶表達(dá)釀酒酵母菌株(tg-1～tg-4)的構(gòu)建
[0056]
根據(jù)ncbi上公布的衣藻屬來(lái)源的溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶crlpaat1(ncbi reference sequence:xp_042921325.1)，按照釀酒酵母密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化并進(jìn)行全基因合成。根據(jù)重疊衍生pcr引物設(shè)計(jì)方法，設(shè)計(jì)引物使基因表達(dá)框相鄰片段的重疊區(qū)達(dá)到40～100bp。設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增釀酒酵母cen pk2-1c染色體911b位點(diǎn)的上下游同源臂，啟動(dòng)子p
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adh1
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tps1
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tdh3
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slx5
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atp5
和t
cyc1
和信號(hào)肽(hdel)片段。
[0057]
以全基因合成的crlpaat1質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物異源溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶。以質(zhì)粒pmhylp-leu為模板(如seq id no.5所示)進(jìn)行pcr，擴(kuò)增獲得缺陷型標(biāo)簽片段，通過(guò)重疊延伸pcr獲得基因整合框。
[0058]
(1)通過(guò)引物f1和r1；f2和r2擴(kuò)增得到911b位點(diǎn)的上下游同源臂片段，通過(guò)引物f3和r3擴(kuò)增得到啟動(dòng)子p
tef1
片段，通過(guò)引物f4和r4擴(kuò)增得到終止子t
adh1
片段，通過(guò)引物f5和r5擴(kuò)增得到seq id no.4所示的crlpaat1基因片段，通過(guò)引物f6和r6擴(kuò)增獲得pmhylp-leu片段，通過(guò)重疊延伸pcr構(gòu)建基因表達(dá)框并將其轉(zhuǎn)入釀酒酵母cen pk2-1c，獲得菌株tg-1。
[0059]
(2)使用f5和r7將crlpaat1基因(基因序列如seq id no.4所示)自身的定位信號(hào)肽(如seq id no.8所示)進(jìn)行敲除，獲得mcrlpaat1基因，將(1)中的同源臂、(f7和r3)啟動(dòng)子、終止子、缺陷型標(biāo)簽片段按照(1)的方法構(gòu)成的基因表達(dá)框轉(zhuǎn)入釀酒酵母cen pk2-1c中，獲得菌株tg-2。
[0060]
(3)通過(guò)引物f8和r8，f9和r9擴(kuò)增得到與mcrlpaat1基因的c端和n端相連的信號(hào)肽hdel(如seq id no.13所示)片段，將與mcrlpaat1基因c端連接的信號(hào)肽hdel的片段與(2)中的片段構(gòu)成基因表達(dá)框轉(zhuǎn)入釀酒酵母cen pk2-1c中獲得菌株tg-3，將與mcrlpaat1基因n
端連接的信號(hào)肽hdel的片段與(2)中的片段構(gòu)成基因表達(dá)框轉(zhuǎn)入釀酒酵母cen pk2-1c中獲得菌株tg-4。
[0061]
對(duì)tg-3和tg-4菌株進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)tg-3菌株tag的sn-2位置的c16:0的相對(duì)含量增加至40％，因此選擇tg-3菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。以上過(guò)程均通過(guò)醋酸鋰轉(zhuǎn)化方法將構(gòu)建好的基因整合框轉(zhuǎn)化至釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞，挑取菌落進(jìn)行pcr驗(yàn)證并選取部分pcr正確的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。
[0062]
實(shí)施例2高產(chǎn)母乳脂質(zhì)替代品重組釀酒酵母菌株(tg-5～tg-14)的構(gòu)建
[0063]
根據(jù)重疊衍生pcr引物設(shè)計(jì)方法，以釀酒酵母cen pk2-1c基因組為模板，擴(kuò)增獲得(f10,r10和f11,r11)slc1、(f12,r12和f13,r13)ale1和(f14,r14和f15,r15)loa1基因上下游同源臂，以質(zhì)粒(f16,r16)pmhylp-leu、(f17,r17)pmhylp-his和(f18,r18)pmhylp-trp為模板(如seq id no.5～seq id no.7所示)進(jìn)行pcr，擴(kuò)增獲得缺陷型表達(dá)框片段。通過(guò)重疊延伸pcr獲得基因整合框并在tg-3菌株的基礎(chǔ)上，分別對(duì)上述三個(gè)基因進(jìn)行單敲除、雙敲除和三敲除，獲得tg-5(敲除slc1)、tg-6(敲除ale1)、tg-7(敲除loa1)、tg-8(敲除slc1、ale1)、tg-9(敲除slc1、loa1)、tg-10(敲除ale1、loa1)和tg-11(敲除slc1、ale1、loa1)菌株。
[0064]
對(duì)tg-5～tg-11菌株的總脂肪酸和sn-2位c16:0的相對(duì)含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3，其中，菌株tg-11總脂肪酸中c16:0的含量最高，且sn-2位c16:0的相對(duì)含量達(dá)到了60％以上。
[0065]
在tg-11菌株的基礎(chǔ)上對(duì)釀酒酵母甘油三酯水解途徑的相關(guān)基因進(jìn)行敲除，使用之前的方法進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，擴(kuò)增得到tgl3(f19,r19和f20,r20)、tgl4(f21,r21和f22,r22)和tgl5(f23,r23和f24,r24)基因上下游同源臂和缺陷型表達(dá)框(f25～f27和r25～r27)片段，依次將這三個(gè)基因敲除表達(dá)框轉(zhuǎn)入tg-11菌株中獲得tg-12(敲除tgl3)、tg-13(敲除tgl3、tgl4)和tg-14(敲除tgl3、tgl4、tgl5)菌株。
[0066]
對(duì)tg-12～tg-14菌株的總脂肪酸和sn-2位c16:0的相對(duì)含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3，最終檢測(cè)得到tg-14菌株的總脂肪酸含量相對(duì)于tg-11有所提升，且tag的sn-2位置的c16:0的相對(duì)含量增加至60％。以上過(guò)程均通過(guò)醋酸鋰轉(zhuǎn)化方法將構(gòu)建好的基因整合框轉(zhuǎn)化至釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞，挑取菌落進(jìn)行pcr驗(yàn)證并選取部分pcr正確的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。
[0067]
實(shí)施例3重組釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)母乳脂質(zhì)替代品
[0068]
本發(fā)明中所有的重組釀酒酵母菌株均通過(guò)以下方式進(jìn)行發(fā)酵。將重組的釀酒酵母重組菌株劃線與無(wú)氨基氮源平板(缺乏缺陷型相對(duì)應(yīng)的氨基酸)，30℃下培養(yǎng)直至長(zhǎng)出大量菌落。
[0069]
挑取單菌落至種子培養(yǎng)基(選用以葡萄糖為碳源的無(wú)氨基氮源無(wú)菌培養(yǎng)基、限制氮源的ypd無(wú)菌培養(yǎng)基、無(wú)機(jī)鹽無(wú)菌培養(yǎng)基以及限制氮源的大豆蛋白胨無(wú)菌培養(yǎng)基的任一培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基均可)，在30℃，220rpm培養(yǎng)18～20h至細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期。
[0070]
按起始2～5％的接種量將種子培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中(選用以葡萄糖為碳源的無(wú)氨基氮源無(wú)菌培養(yǎng)基、限制氮源的ypd無(wú)菌培養(yǎng)基、無(wú)機(jī)鹽無(wú)菌培養(yǎng)基以及限制氮源的大豆蛋白胨無(wú)菌培養(yǎng)基的任一培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基均可)，30℃220rpm培養(yǎng)72h。72h后停止培養(yǎng)，將發(fā)酵結(jié)束的酵母細(xì)胞離心之后凍干，用于后續(xù)的檢測(cè)分析。
[0071]
實(shí)施例4重組釀酒酵母母乳脂質(zhì)替代品提取與檢測(cè)
[0072]
本發(fā)明中所有的重組釀酒酵母菌株中的脂質(zhì)均通過(guò)以下方式進(jìn)行提取。在凍干的
菌體中加入十五烷酸甘油三酯作為內(nèi)標(biāo)，加入甲醇和玻璃珠進(jìn)行振蕩破碎，然后將破碎完的溶液轉(zhuǎn)移到新的容量瓶中，加入氯仿，將溶液置于超聲水浴10分鐘，將超聲完成的上清轉(zhuǎn)移至新的容量瓶中，再次加入1.5ml甲醇/氯仿溶劑進(jìn)行提取，重復(fù)該步驟兩次，并將所得的脂質(zhì)提取物進(jìn)行合并，在合并的溶液中加入2.5ml氯仿和3ml nacl水溶液。劇烈振蕩樣品，10000rpm離心5min，棄上層液體，將下層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至新的玻璃管中，使用氮吹儀吹干有機(jī)相，使用正己烷進(jìn)行復(fù)溶。使用薄層層析方法對(duì)提取的脂質(zhì)進(jìn)行分離，展層劑為正己烷：乙醚：乙酸(70:30:1，v:v:v)，使用溴百里酚藍(lán)對(duì)層析版上的脂質(zhì)進(jìn)行顯色，根據(jù)顯色結(jié)果使用取樣器將甘油三酯條帶取下，然后將分離得到的甘油三酯樣品置于10ml離心管中，再向試管中加入0.2ml正己烷。之后加入50mg胰甘油三酯水解酶和2ml tris-hcl(ph＝8)緩沖液，小心搖動(dòng)，之后再加入0.5ml膽酸鈉溶液，0.2ml氯化鈣溶液，蓋上離心管蓋，小心搖動(dòng)，隨后將離心管置于40℃的水浴鍋中5min，期間保持手搖，水浴后去除振蕩器上振蕩2min，之后加入1ml鹽酸溶液(6mol/l)和1ml乙醚，蓋上蓋子，劇烈震蕩10s，在4000rpm離心4min，吸取有機(jī)相，氮吹至200ul后使用gc-ms進(jìn)行測(cè)定?；蚨ㄎ唤Y(jié)果如圖1，薄層結(jié)果如圖2，c16:0含量占比如圖3。
[0073]
從圖1中可看出，將異源基因crlpaat1直接整合在釀酒酵母基因組時(shí)，基因的表達(dá)量較低；將異源基因自身信號(hào)肽進(jìn)行敲除之后得到的mcrlpaat1基因，在釀酒酵母中表達(dá)量明顯提高，同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)基因主要在胞質(zhì)中游離表達(dá)；在mcrlpaat1基因c端添加信號(hào)肽之后得到rmcrlpaat1基因，該基因在釀酒酵母中表達(dá)較強(qiáng)，且在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中定位。
[0074]
對(duì)比例1
[0075]
將溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶替換為以下序列(1)，敲除自身的定位信號(hào)肽(序列如seq id no.22所示)，并在敲除后基因的c端添加信號(hào)肽hdel，具體步驟同實(shí)施例1，得到菌株tg-15；
[0076]
將溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶替換為以下序列(2)，在基因的c端添加信號(hào)肽hdel，具體步驟同實(shí)施例1，分別得到菌株tg-16、tg-17。
[0077]
(1)蕓苔屬來(lái)源的溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶lpat1(ncbi reference sequence:af111161)，基因序列如seq id no.1所示；
[0078]
(2)智人來(lái)源的溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶agpat1(ncbi reference sequence:nc_000006.12)和agpat2(ncbi reference sequence:cah71722.1)，基因序列分別如seq id no.2和3所示；
[0079]
對(duì)比例2
[0080]
將信號(hào)肽hdel替換為以下信號(hào)肽：(1)srp14(基因序列如seq id no.9所示)、(2)srp54(基因序列如seq id no.10所示)、(3)cyb5(基因序列如seq id no.11所示)、(4)sec12(基因序列如seq id no.12所示)、(5)fehdel(基因序列如seq id no.14所示)，具體步驟同實(shí)施例1的菌株tg-3，分別得到菌株tg-18～tg-22。
[0081]
顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明所作的舉例，并非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式變化或變動(dòng)。這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引申出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。

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