摘 要：母乳低聚糖（human milk oligosaccharides，HMOs）是母乳中獨特的營養(yǎng)成分，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種類繁多，不同的HMOs可能具有不同的功能。本文在HMOs的個體差異性、結(jié)構(gòu)多樣性與功能活性方面介紹了HMOs的最新研究進展，重點闡述了HMOs在人體內(nèi)的代謝途徑以及體外的合成途徑，最后闡述了HMOs在嬰兒配方粉中的應(yīng)用現(xiàn)狀，提出了研究及應(yīng)用中面臨的問題。HMOs的應(yīng)用是嬰兒配方奶粉發(fā)展中的重大突破，縮小了配方奶粉喂養(yǎng)兒在腸道菌群組成、免疫功能以及認知等方面上與母乳喂養(yǎng)兒的差距。HMOs的深入研究為新型嬰兒配方奶粉的開發(fā)提供理論依據(jù)。

母乳是嬰兒營養(yǎng)的最佳選擇。母乳中的HMOs是僅次于乳糖和脂肪的第三大營養(yǎng)物質(zhì)，HMOs不能被人近端腸道吸收，但可在大腸發(fā)揮益生元的作用，其對嬰兒生長發(fā)育、免疫系統(tǒng)發(fā)育、腸道微生態(tài)系統(tǒng)建立和腸黏膜屏障功能等方面有重要的作用。HMOs或許能縮小配方粉喂養(yǎng)嬰兒與母乳喂養(yǎng)兒的差距[1]。母乳中約含有1%的HMOs，在足月母乳中巖藻糖基化、唾液酸化和非巖藻糖基化中性HMOs的比例大約為35%～50%、12%～14%和42%～55%[2]。HMOs的體內(nèi)代謝關(guān)系到其功能活性，其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)特性又決定了體外合成的難度。因此，了解HMOs的體內(nèi)代謝與體外合成對HMOs的深入研究與應(yīng)用具有重要意義。

1 HMOs的差異性與多樣性

1.1 HMOs在個體間的差異性

研究指出HMOs在不同個體間存在著明顯的差異。Mcguire等[3]的研究團隊報告了不同地理環(huán)境的人群HMOs在組成與濃度上的差異。出現(xiàn)這種差異主要受到母親的血型和相關(guān)基因的表達以及外在環(huán)境因素的影響。不同Lewis（Le）血型及分泌類型與HMOs的組成密切相關(guān)，其在體內(nèi)表達的含量和活性的高低決定了HMOs糖鏈中成分結(jié)構(gòu)的差異。其次，外在原因還包含母親飲食、地域環(huán)境（比如一個地區(qū)城市與農(nóng)村之間）等因素的影響。HMOs在同一個體的不同哺乳期也存在不同，并且隨著體質(zhì)量與年齡的變化而變化[3]。HMOs在人初乳中質(zhì)量濃度達到20～25 g/L，而在成熟乳中降至5～10 g/L。在24～28 歲母親的乳中，HMOs的含量明顯高于14～18 歲母親的乳汁[4]。此外，與足月分娩的婦女相比，早產(chǎn)兒的母乳中HMOs的濃度高于足月兒，并且早產(chǎn)婦女乳汁中含有的巖藻糖基化或唾液酸化的HMOs存在更大的差異[5]。

了解不同HMOs的結(jié)構(gòu)差異是非常重要的，因為越來越多的研究表明，不同結(jié)構(gòu)的HMOs可能對嬰兒健康和疾病風(fēng)險有特定的影響。例如，一項關(guān)于墨西哥嬰兒的研究中，食用低濃度2’-巖藻糖基乳糖（2’-fucosyllactose，2’-FL）的嬰兒腹瀉發(fā)病率顯著高于食用高濃度2’-FL的嬰兒[6]。另一項研究表明含有更高濃度的Fut2基因編碼的HMOs與嬰兒低過敏風(fēng)險有關(guān)[7]。此外，較低濃度的總HMOs與較高濃度的3’-唾液酸乳糖（3’-sialyllactose，3’-SL）與人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的傳播有關(guān)[8]。目前，眾多的研究表明了HMOs在人體間差異的原因，但對于這些因素以什么樣的形式產(chǎn)生影響，以及影響的程度尚不明確；因此，需要進行針對性的基因組學(xué)分析，以確定這些差異受遺傳變異影響的程度，同時，需進一步分析生活條件、行為和環(huán)境因素對差異產(chǎn)生的貢獻大小。

1.2 HMOs結(jié)構(gòu)的多樣性

HMOs結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多。了解母乳中HMOs不同的結(jié)構(gòu)與含量具有重要意義。目前已經(jīng)具有較為成熟的檢測分析方法能夠?qū)Σ糠諬MOs進行定性定量分析。首先，由于母乳中含有的多種成分，如脂類、蛋白質(zhì)、乳糖和鹽類，可能會干擾HMOs的定量檢測，因此分析檢測樣品中HMOs必須進行前處理。脂類和蛋白質(zhì)通常通過在0～4 ℃下離心、氯仿/甲醇萃?。ㄖ貜?fù)2～3 次）、乙醇沉淀、乙腈沉淀和超濾分離等技術(shù)去除[9-10]。然后，采用無孔石墨化碳將樣品進一步純化去除鹽類、乳糖、還原劑等[11]。最后，將處理后的樣品先進行分離，之后通過檢測器檢測。用于樣品分離的技術(shù)，包括多孔石墨化碳、毛細管電泳、液相色譜，一般采用質(zhì)譜和熒光檢測器檢測。目前，已有超過150 種HMOs被檢測出來。

HMOs是由5種單體排列組合后加到乳糖分子上構(gòu)成的，這5 種單體分別是N-乙酰葡萄糖胺（N-acetylglucosamine，GlcNAc）、D-葡萄糖（D-glucose，Glc）、D-半乳糖（D-galactose，Gal）、L-巖藻糖（L-fucose，F(xiàn)uc）、唾液酸（sialic acid，SA）。HMOs一般包含3～22 個糖單元，具有一定的結(jié)構(gòu)骨架（圖1A、B），其還原端都含有一個乳糖（Galβ1-4Glc）[12]。乳糖可以直接被Fuc與N-乙酰神經(jīng)氨酸（N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac）（SA的前體）修飾。同時，HMOs糖鏈的延伸也可以通過在還原端的乳糖上連接兩種二糖結(jié)構(gòu)（I型鏈Gal-β-1,3-GlcNAc和II型鏈Gal-β1-4GlcNAc）進行糖鏈的延伸。利用β-1,3鍵添加二糖結(jié)構(gòu)使糖鏈發(fā)生線性延伸，而兩個二糖之間的β-1,6鍵則引入鏈的分支[13]，延伸的糖鏈又可以進行巖藻糖基化或唾液酸化。一些HMOs還會以幾種異構(gòu)體形式存在，例如乳酰-N-巖藻糖基五糖（圖1C）。之前的研究基于所發(fā)現(xiàn)的HMOs結(jié)構(gòu)，提出了一個由13 個結(jié)構(gòu)組成的核心單元。但隨著檢測技術(shù)的進步，發(fā)現(xiàn)了更多新的HMOs結(jié)構(gòu)，13 個核心單元已不能完全描述所發(fā)現(xiàn)的HMOs結(jié)構(gòu)。因此，有研究人員提出將13 個核心單元擴展到19 個。本文給出了新提出的6 種核心單元的結(jié)構(gòu)示意圖[14]（圖1D）。

圖1 HMOs的結(jié)構(gòu)[12,14]
Fig. 1 Structures of HMOs[12,14]

A. HMOs結(jié)構(gòu)骨架；B. HMOs結(jié)構(gòu)中化學(xué)鍵鏈接方式；C.乳糖-N-巖藻酸激酶異構(gòu)體；LNFP.乳糖-N-巖藻五糖（lacto-N-fucopentose）；D. 6 種新的核心結(jié)構(gòu)。

HMOs是在母親乳腺中糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下生成的，乳腺中糖基轉(zhuǎn)移酶的合成受基因調(diào)控，除巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶外，所有的母親自身都能夠合成其他糖基轉(zhuǎn)移酶[15]。而巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶與母親分泌類型和Lewis血型抗原有關(guān)，分泌型（secretor，Se）基因編碼一個α-1,2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（fucosyltransferase 2，F(xiàn)UT2），Le基因編碼α-1,3/4巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（FUT3）[16]。不同母親的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達具有很大差異，導(dǎo)致酶活性不同，從而導(dǎo)致不同個體中巖藻糖基化HMOs的差異。因此，可以將女性分為4 組（Se±/Le±）不同的表現(xiàn)形式。唾液酸化的HMOs則通過唾液酸轉(zhuǎn)移酶將一個或多個SA添加到HMOs的糖鏈上，這一過程是將Neu5Ac連接至末端Gal或內(nèi)部GlcNAc上[17]。

2 HMOs的生物學(xué)功能

2.1 調(diào)節(jié)腸道菌群

腸道菌群與宿主的健康和疾病有著密切的關(guān)系，它在腸道營養(yǎng)物質(zhì)代謝、抵抗致病微生物定植、促進免疫系統(tǒng)發(fā)育及成熟等方面發(fā)揮著重要作用[18]。健康腸道菌群結(jié)構(gòu)的建立對嬰兒的生長發(fā)育至關(guān)重要，嬰兒在生命前期腸道內(nèi)微生物狀態(tài)是逐漸向著雙歧桿菌占主導(dǎo)地位過渡的[19]，而嬰兒腸道的微生物定植是一個具有挑戰(zhàn)的過程[20]。研究發(fā)現(xiàn)缺少HMOs的配方奶粉喂養(yǎng)的嬰兒與母乳喂養(yǎng)的嬰兒相比腸道菌群更脆弱[21]。一方面，HMOs能夠作為嬰兒腸道中有益細菌的代謝基質(zhì)，有助于塑造嬰兒腸道微生物群；另一方面，HMOs經(jīng)腸道益生菌代謝后產(chǎn)生多種人體可吸收利用的短鏈脂肪酸和乳酸鹽，并使腸道的pH值呈酸性，從而抑制過度繁殖的有害菌[22]。

2.2 調(diào)節(jié)免疫

HMOs在嬰兒免疫系統(tǒng)的發(fā)育中發(fā)揮著特殊的作用。HMOs的豐富多樣性具有調(diào)節(jié)嬰兒先天性免疫和適應(yīng)性免疫的潛力。胃腸道對嬰兒的免疫至關(guān)重要，腸道上皮構(gòu)成一個功能屏障，阻止腸道內(nèi)微生物群特別是病原菌對宿主的侵襲，并且提供大量免疫細胞。嬰兒的胃腸道極為敏感，容易出現(xiàn)炎癥基因的過度表達和負責(zé)先天性信號反饋調(diào)節(jié)的基因表達不足，這可能導(dǎo)致免疫反應(yīng)的放大，導(dǎo)致過度炎癥[23]。母乳喂養(yǎng)可以顯著改善嬰兒腸道免疫功能，這主要是因為母乳中的HMOs可以阻止嬰兒腸內(nèi)炎癥基因的表達，提高嬰兒的免疫力。

巖藻糖基HMOs通過競爭機制抑制細菌毒素與腸黏膜受體的黏附，如空腸彎曲菌和大腸桿菌毒素[24]。大多數(shù)巖藻糖基HMOs能夠促進輔助型T細胞2（T helper 2 cell，Th2）的活性，如2’-FL、LNFP I、LNFP III[24]。同時2’-FL與LNFP I在體外降低了促炎性巨噬細胞源性白介素（interleukin，IL）-12和γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）的水平，增加了促進Th2極化的IL-10水平[25]。而LNFP Ⅲ在體外抑制巨噬細胞和樹突狀細胞2（dendritic cell 2，DC2）的成熟，從而促使IL-4和抑制促炎性IFN-γ的產(chǎn)生[26]。與巖藻糖基HMOs類似，唾液酸化HMOs也被證明能阻止病原菌與腸道上皮細胞的結(jié)合，增強機體免疫反應(yīng)。含一個或兩個唾液酸殘基的HMOs組分顯著降低血小板中性粒細胞復(fù)合體（platelet-neutrophil complex，PNC）的形成和中性粒細胞的活化[27]。3’-SL通過肽聚糖模式識別3（peptidoglycan pattern recognition 3，PGlyRP3）促進Th2反應(yīng)，減少細胞IL-8、IL-12和TNF-α基因的表達[28]。另外，唾液酸化HMOs刺激DCs釋放細胞因子，促進T細胞轉(zhuǎn)向免疫應(yīng)答更為平衡的表型Th1和Th2[29]。許多研究證實半乳糖基乳糖（galactosyllactoses，GL）具有調(diào)節(jié)免疫的能力，如3’-GL、4’-GL、6’-GL通過抑制IL-8的產(chǎn)生，進而抑制多胞二酸（polycytodilic acid，PIC）誘導(dǎo)的腸上皮細胞的炎癥[30]。

碳水化合物的結(jié)合物是HMOs在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用的潛在機制，一些凝集素已被證明參與調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能，如C型凝集素、類動物凝集素和半乳糖凝集素[23]。一方面，HMOs可能影響凝集素功能，從而有助于細胞信號傳導(dǎo)。大多數(shù)凝集素受體在與多價碳水化合物配體交聯(lián)后通過其多聚體誘導(dǎo)信號通路[31]。另一方面，HMOs可以作為抑制性配體，唾液酸化HMOs能夠抑制選擇素介導(dǎo)的白細胞黏附內(nèi)皮細胞[32]。同樣，已有研究表明，一些HMOs能夠調(diào)節(jié)在啟動細胞免疫反應(yīng)中起著中心作用的Toll樣受體（toll-like receptor，TLR）的表達和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。體外實驗表明，添加LNFP I和6’-GL可促進TLR4的mRNA表達，而3’-SL、6’-SL和6’-GL可增強TLR4和TLR2的表達[24]。

2.3 抗病毒、抗菌作用

HMOs具有很強的抗病毒、抗菌潛力。可以抵御多種病毒病原體，如諾若病毒、輪狀病毒、流感病毒、HIV[33-34]（表1）。病毒附著于宿主表面是建立病毒感染的關(guān)鍵，通過特定的碳水化合物黏附于宿主上皮細胞，許多參與這一過程的細胞表面聚糖表位已經(jīng)被鑒定，如人類血型抗原（human blood group antigens，HBGAs），根據(jù)糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，將HBGAs分為4 種不同類型，即血型A、B、H和Lewis[33]。HMOs抗病毒最可能的機制是通過減少病毒對靶細胞的黏附，HMOs類似于各種細胞表面糖基化結(jié)構(gòu)如糖脂或糖蛋白結(jié)構(gòu)，能夠充當(dāng)病毒的可溶性受體[34]。一些具有抗病毒作用的HMOs單體已經(jīng)被證明（表1）。

表1 HMOs抗病毒作用
Table1 Antiviral effect of HMOs

注：LNDFH.乳糖-N-二巖藻六糖（lacto-N-difucohexaose）；LNT.乳糖-N-四糖（lacto-N-tetrose）；LNnT.乳糖-N-新四糖（lacto-Nneotetraose）；DFLNH.二巖藻糖基內(nèi)酯-N-六糖（difucosyllacto-Nhexaose）。

病毒 分類 結(jié)合表位 抗病毒作用的HMOs諾若病毒 GI～GVIA type、B type、H type、Leb、Ley、Lex2’-FL、3’-FL、LNFP I、LNFP III、LNDFH I、DFLNH輪狀病毒 G型和P型 A type、B type、H type、Leb、Lex LNT、LNnT、LNDFH I、LNFP I流感病毒 禽流感病毒 SA-α-2,6-Gal 6’-SL人流感病毒 SA-α-2,6-Gal 6’-SL

HMOs還可以像其抗病毒作用一樣，作為細菌特別是致病菌與宿主相互作用界面上的抗黏接劑，HMOs可以顯著減少大腸桿菌對培養(yǎng)的上皮細胞的附著，阻止微生物病原體進入[35]，如導(dǎo)致大多數(shù)細菌性腹瀉的空腸彎曲菌[36]和腸致病性大腸桿菌[35]。此外，HMOs可能有一種更直接的方法來控制病原體。HMOs可以不依賴于宿主免疫，直接抑制無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae，GB）的生長，GB是嬰兒侵襲性細菌感染的主要原因，通常是在分娩時垂直獲得，與嬰兒患肺炎、敗血癥和腦膜炎密切相關(guān)[37]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)存在HMOs時，GB不再增殖[38]。體外研究表明，HMOs具有類似于一些抗生素的作用，GB利用一種糖基轉(zhuǎn)移酶將特定的HMOs結(jié)合到細胞膜中，進而阻止GB增殖[39]。進一步研究分離不同的HMOs組分，發(fā)現(xiàn)其抑制GB活性僅限于特定的非唾液酸化HMOs，這些非唾液酸化HMOs與多種常規(guī)抗生素具有協(xié)同作用[38]。

2.4 HMOs對腦發(fā)育的影響

越來越多的證據(jù)表明，HMOs在大腦的生長發(fā)育以及認知能力的建立中起著關(guān)鍵作用。髓鞘化、突觸的形成以及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放都受到受體糖基化的調(diào)節(jié)。有報道稱在大鼠大腦的突觸連接中有巖藻糖基化糖蛋白，并且放射性標(biāo)記的巖藻糖經(jīng)顱內(nèi)注射后可迅速并入糖蛋白并轉(zhuǎn)移到神經(jīng)末梢[40]。Vázquez等[41]首次在嚙齒動物中證明了巖藻糖基化母乳低聚糖能提升大鼠與小鼠的認知能力，并且增加了腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等參與記憶形成的分子。

在大腦中，SA是腦神經(jīng)節(jié)苷脂和修飾神經(jīng)細胞黏附分子的poly-SA鏈的重要組成部分。SA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與神經(jīng)元細胞間的通訊有關(guān)。母乳中的SA主要以唾液酸化的HMOs形式存在。這些唾液酸化神經(jīng)節(jié)苷脂在突觸形成、軸突生長、樹突再生和神經(jīng)傳遞中起著重要作用。動物研究表明，學(xué)習(xí)能力的提高與腦神經(jīng)節(jié)苷脂和糖蛋白中SA的濃度有關(guān)[42]。此外，研究發(fā)現(xiàn)飲食中添加3’-SL或6’-SL會增加大腦不同區(qū)域的總SA和神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合SA的濃度[43]。HMOs對嬰兒腦結(jié)構(gòu)和認知的發(fā)育的潛在機制解析尚不完善，在嬰兒個體中的研究鮮有報道。因此，關(guān)于HMOs對腦發(fā)育影響的深入研究尤為重要，這也會為HMOs在嬰兒配方粉中的應(yīng)用增加必要性。

3 HMOs在機體內(nèi)的吸收與利用

HMOs被認為是人類第一益生元，在嬰兒胃腸道的上端不能被消化，這是由于嬰兒胃腸道上端缺乏糖苷水解酶和腸膜轉(zhuǎn)運蛋白[44]，所以大多數(shù)HMOs能直接到達胃腸道遠端，作為特定微生物的底物影響胃腸道微生物群的組成和活性。嬰兒代謝不同HMOs的能力與微生物群密切相關(guān)，是通過特定的細菌組合進行的，特別是雙歧桿菌屬、擬桿菌屬和乳酸桿菌屬[45]。HMOs與利用它的細菌具有特異性，HMOs能夠特異性地刺激腸道內(nèi)微生物的活性，而這些微生物又能夠特異性地表達唾液酸酶或者巖藻糖苷酶來切割唾液酸化和巖藻糖基化的HMOs[46]。所以腸道內(nèi)多種雙歧桿菌和類桿菌可以對不同種類HMOs加以利用，而腸桿菌等條件致病菌對HMOs的利用能力相對較差，一些有害細菌如致瀉性大腸桿菌、梭狀芽孢桿菌等幾乎不能利用HMOs[47]。

3.1 雙歧桿菌代謝HMOs的途徑

在生命早期，雙歧桿菌是母乳喂養(yǎng)嬰兒腸道的優(yōu)勢菌群，這些細菌具備專用的糖苷水解酶、轉(zhuǎn)運體和其他有助于利用HMOs的分子，所以是HMOs的主要消耗者。雖然有多種雙歧桿菌可利用HMOs，但并不是所有雙歧桿菌都能利用HMOs，不同的雙歧桿菌物種和菌株在利用HMOs的能力方面具有高度特異性，這種利用HMOs的能力取決于雙歧桿菌所配備的酶[48]。研究發(fā)現(xiàn)了兩種長雙歧桿菌亞種代謝HMOs的途徑（圖2）。其一，兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum）通過半乳糖-N-二糖/乳糖-N-二糖（galacto-N-biose/lactose-N-biose，GNB/LNB）途徑代謝HMOs[49]。兩歧雙歧桿菌具有細胞膜結(jié)合的LNB糖苷酶，能在細胞外解聚HMOs，并產(chǎn)生LNB水解產(chǎn)物，LNB通過ABC轉(zhuǎn)運體導(dǎo)入，并在GNB/LNB途徑中被LNB磷酸化酶進一步水解（圖2A）。其二，嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacterium longum subsp. infantis）與兩歧雙歧桿菌不同，其沒有胞外將HMOs裂解為LNB的乳糖-N-生物糖苷酶同系物，但是嬰兒雙歧有一個獨特的43 kb基因簇，負責(zé)編碼一系列糖苷酶、ABC轉(zhuǎn)運體和細胞外寡糖溶質(zhì)結(jié)合蛋白[50]。所以HMOs能夠通過ABC轉(zhuǎn)運體完整地運輸?shù)桨麅?nèi)，由各種胞漿糖苷酶進行水解。如：巖藻糖苷酶、β-半乳糖苷酶、唾液酸酶（圖2B）[51]。

圖2 兩歧雙歧桿菌（A）和嬰兒雙歧桿菌（B）代謝HMOs的途徑[52]
Fig. 2 Metabolic pathways of HMOs in Bifidobacterium bifidum (A)and Bifidobacterium infantis (B)[52]

3.2 Roseburia代謝HMOs的途徑

低聚糖抵抗人體胃部及腸道前端酶的消化到達腸道末端為腸道菌群的建立提供主要驅(qū)動力。雙歧桿菌屬不同成員在利用HMOs方面的競爭力，加強了雙歧桿菌在母乳喂養(yǎng)嬰兒的腸道菌群中的優(yōu)勢地位。嬰兒腸道微生物群在斷奶和引入固體食品期間發(fā)生顯著變化，即雙歧桿菌被硬壁菌取代，成為成熟腸道菌群中最豐富的門。在這一時期，來自碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生的短鏈脂肪酸如丙酸鹽和丁酸鹽，其濃度顯著增加[53]。鑒于在腸道菌群建立初期，雙歧桿菌在HMOs上的競爭優(yōu)勢決定其在菌群中的優(yōu)勢地位，因此在斷奶期以及之后一段時期，處于優(yōu)勢地位的梭狀芽孢桿菌目特別是Roseburia對HMOs的代謝能力受到關(guān)注。

Pichler等[54]通過基因組分析，發(fā)現(xiàn)在Roseburia中，HMOs利用位點具有多樣性并普遍存在，并提出了Roseburia代謝HMOs的全新途徑（圖3）。研究揭示了Roseburia兩個亞種R. homis和R. inulinivorans代謝HMOs的機制。在R. homis中，LNT、LNB和黏蛋白衍生的GNB被LNB轉(zhuǎn)運體捕獲并進入細胞質(zhì)隨后水解為LNB，然后被磷酸化酶（RhGLnbp112）進一步磷酸化為1-磷酸-α-D-半乳糖和相應(yīng)的N-乙酰己糖胺。乳糖則被β-半乳糖苷酶水解。在R.inulinivorans中，HMOs在細胞外表面先進行初步水解，由相應(yīng)的酶（RiLea/b136）催化發(fā)生，初步水解的HMOs通過相應(yīng)的轉(zhuǎn)運體（RiLea/bBP）進入到細胞內(nèi)，通過巖藻糖苷酶（RiFuc29和RiFuc95）的協(xié)同作用去除Fuc，然后與在R. homis中一樣，被磷酸化酶進一步分解。同時，SA單糖也可以通過相應(yīng)的轉(zhuǎn)運體進入到R. inulinivorans進行分解。分解產(chǎn)生的半乳糖和1-磷酸半乳糖通過Leloir途徑轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖，N-乙酰己糖胺在進入糖酵解前轉(zhuǎn)化為6-磷酸-N-乙酰葡萄糖胺。部分經(jīng)過糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸可以轉(zhuǎn)化為丁酸鹽[55]。

圖3 Roseburia代謝HMOs的途徑[54]
Fig. 3 Metabolic pathway of HMOs in Roseburia[54]

3.3 極少量被胃腸道吸收的HMOs的代謝途徑

雖然HMOs在胃腸道上端不被消化，但HMOs對母乳喂養(yǎng)的嬰兒具有全身健康益處，如全身免疫調(diào)節(jié)。這需要HMOs進入嬰兒的血液，研究發(fā)現(xiàn)高達1%的HMOs被胃腸道吸收[56]，在全身循環(huán)中可以被利用。一些研究利用13C標(biāo)記的半乳糖喂養(yǎng)哺乳期婦女，該標(biāo)記物可以直接進入到母親的母乳低聚糖中，最終在嬰兒的尿液中檢測到這些13C-HMOs。這表明HMOs在吸收后可能先進入嬰兒的血液循環(huán)中，然后通過尿液排出[57]。研究人員對16 例健康母乳喂養(yǎng)嬰兒的尿液和血漿研究發(fā)現(xiàn)，一些小分子質(zhì)量的HMOs能被完整地吸收到血液循環(huán)中，如2’-FL、3’-FL、LNnT[58]。

4 HMOs體外合成

從母乳中分離出HMOs僅在結(jié)構(gòu)鑒定和基礎(chǔ)研發(fā)有一定的應(yīng)用，但是，受限于其極低的產(chǎn)量，這種方法不適合商業(yè)化的生產(chǎn)，HMOs的有限供應(yīng)阻礙了其在嬰兒營養(yǎng)中的應(yīng)用，并阻礙了對其生物學(xué)效應(yīng)的研究。因此，對于HMOs人工合成的探索與開發(fā)尤為重要。從化學(xué)合成到生物技術(shù)制造的轉(zhuǎn)變，使得它們的產(chǎn)量和價格都更加趨向于商業(yè)化應(yīng)用，特別是應(yīng)用在嬰兒配方奶粉。它也加速了臨床前的基礎(chǔ)研究和臨床HMOs生物學(xué)領(lǐng)域的研究。

4.1 合成策略

越來越多關(guān)于HMOs合成的研究提出了許多HMOs合成的有效策略，這些策略為高效、精準以及大量合成HMOs提供了有力依據(jù)。Faijes等[17]在研究中總結(jié)并提出了逆向聚合合成策略來進行HMOs的合成（圖4）。最常用的逆合成策略是2＋2聚合反應(yīng)，將I型或II型糖鏈結(jié)構(gòu)組裝到乳糖受體上，并且根據(jù)相關(guān)的化學(xué)或酶反應(yīng)對其進行適當(dāng)保護和活化。該反應(yīng)能夠產(chǎn)生不同的線性糖鏈或分支糖鏈結(jié)構(gòu)，這些糖鏈結(jié)構(gòu)可以進一步被巖藻糖基化或唾液酸化以獲得相應(yīng)的衍生物。另一個逆合成策略類似于HMOs的生物合成途徑，在乳糖分子上以順序的方式依次添加N-乙酰氨基葡萄糖和半乳糖進行糖鏈延伸，在延伸的糖鏈結(jié)構(gòu)上進行巖藻糖基化或唾液酸化生成各種HMOs。這兩種策略都先添加I型或II型糖鏈再進行巖藻糖基化或唾液酸化，而另一種策略則是直接使用巖藻糖基化或唾液酸化的供體，如Lewis表位（Lea/Lex或Leb/Ley）直接添加到乳糖分子上[1]。

圖4 逆向合成策略進行HMOs的合成[17]
Fig. 4 General retrosynthetic strategies for HMO production[17]

4.2 合成方法

4.2.1 化學(xué)合成法

糖苷鍵的構(gòu)建是化學(xué)合成中最基本、最重要的過程。保護基的選擇和糖苷化反應(yīng)中特定糖苷鍵構(gòu)型的選擇性生成，是HMOs化學(xué)合成中的關(guān)鍵點。特定位置與構(gòu)型的糖苷鍵的穩(wěn)定高效構(gòu)建需要選擇出適合的保護基?；瘜W(xué)合成的方法一般包括逐步縮合定向、“一鍋法”合成和固相合成。比如，Glycom A/S公司已經(jīng)通過化學(xué)合成大規(guī)模生產(chǎn)2’-FL和LNnT，并且能夠用于臨床前和臨床項目的研究中；Jennum等[59]利用一鍋糖基化反應(yīng)，半乳糖硫糖苷化學(xué)選擇性偶聯(lián)至鄰苯二甲酰亞胺保護的葡糖胺硫糖苷產(chǎn)生二糖，然后耦合到乳糖中的3’-位置，在第一次偶聯(lián)中形成受保護的乳糖胺硫苷時，能夠合成四糖結(jié)構(gòu)的HMOs。同時，“一鍋法”已用于高效合成由N-乙酰基乳糖胺、乳糖和巖藻糖組成的乳糖-N-新巖藻糖等五糖結(jié)構(gòu)的HMOs。

化學(xué)合成方法能夠合成所需要的特定結(jié)構(gòu)的HMOs，特別是在合成結(jié)構(gòu)復(fù)雜、分支多的HMOs時具有優(yōu)越性。但是，HMOs的化學(xué)合成過程存在許多問題，如糖苷鍵形成的立體和區(qū)域選擇性控制的不準確，多個活化、保護和脫保護步驟的復(fù)雜性使工業(yè)化生產(chǎn)具有諸多挑戰(zhàn)，同時，其HMOs得率卻難以提升。并且隨著鏈長或分支模式的增加將使其合成更為復(fù)雜[60]。

4.2.2 體外酶法

體外酶法與體內(nèi)細胞工廠法都離不開酶的作用，特別是糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷水解酶（glycoside hydrolase，GH），因為HMOs合成中糖基化反應(yīng)由這兩種酶催化進行。糖基轉(zhuǎn)移酶催化單糖從糖核苷酸供體轉(zhuǎn)移到受體形成糖苷鍵，進而合成二糖、寡糖或多糖。GH則在特定條件下催化轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)[12,61]。體外酶法的關(guān)鍵點是通過酶工程合成更為有利的酶，因為相關(guān)的酶是HMOs合成過程中必不可少的。

體外酶法合成具有能有效保證糖苷化反應(yīng)中糖苷鍵構(gòu)型和能夠?qū)翁侵饌€加到糖基受體特定位置的兩大顯著優(yōu)點。酶法在體外進行，合成條件較體內(nèi)的細胞法更容易控制，所以復(fù)雜的HMOs可以通過該方法合成。體外酶法合成HMOs依然面臨許多挑戰(zhàn)，比如，獲得在體外仍然具有高效的酶是困難的，在體外反應(yīng)中還會受到酶本身性質(zhì)的限制。

4.2.3 體內(nèi)細胞工廠法

細胞法通過代謝工程微生物生產(chǎn)HMOs，利用微生物的代謝機制和體內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶的區(qū)域和立體選擇性的活性，糖基轉(zhuǎn)移酶的功能表達、其供體和受體底物在體內(nèi)運輸?shù)郊毎蚝铣傻目捎眯?，以及防止核苷酸副產(chǎn)物對合成酶的產(chǎn)物抑制作用，重組全細胞過度表達相應(yīng)的異源糖基轉(zhuǎn)移酶基因和參與糖核苷酸供體生物合成的基因[17,62]。目前通過合成生物學(xué)和代謝工程策略構(gòu)建的一些模式宿主菌株，主要包括大腸桿菌、酵母、谷氨酸棒桿菌和枯草芽孢桿菌。在單細胞培養(yǎng)基中生產(chǎn)HMOs時，大腸桿菌是生產(chǎn)HMOs最常用的微生物[63]。

到目前為止，已有文獻報道使用細胞工廠方法生產(chǎn)了超過42 種結(jié)構(gòu)的HMOs。并且微生物細胞工廠和大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)已成功應(yīng)用于2’-FL的工業(yè)規(guī)模合成。但是體內(nèi)細胞工廠法目前僅能夠合成含有3～10 個單糖單元的低聚糖，并且大多數(shù)情況下不產(chǎn)生獨特的HMOs，而是低聚糖的混合物。

5 HMOs在嬰兒配方粉產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用

嬰兒配方奶粉的發(fā)展一直致力于向母乳更加靠近，但目前仍有眾多因素與母乳存在區(qū)別，特別是HMOs成分。目前市售的奶粉主要是利用益生元（將低聚半乳糖（galactooligosaccharides，GOS）與低聚果糖（fructooligosaccharides，F(xiàn)OS）按照質(zhì)量比9∶1添加）來代替HMOs，雖然益生元有一定的作用，但其取代不了HMOs。越來越多的臨床實驗表明，添加了人工合成的HMOs的配方奶粉不僅在成分上更接近母乳，而且在功能上也更接近母乳，用該配方奶粉喂養(yǎng)的嬰兒在生長發(fā)育、耐受性、吸收和排泄效率、免疫發(fā)育等方面與母乳喂養(yǎng)的足月嬰兒相似。因此，HMOs在嬰兒配方食品中的應(yīng)用已然成為這一行業(yè)發(fā)展的新趨勢。

目前，在國外部分HMOs已被允許應(yīng)用于嬰兒配方奶粉中（表2）。毋庸置疑，隨著全球各地監(jiān)管和法規(guī)進程的推進，可以預(yù)計會有越來越大的HMOs市場容量被釋放出來，也將會有更多的生產(chǎn)廠商加入進來。當(dāng)前市場上HMOs的生產(chǎn)供應(yīng)商全部是國外的公司，如巴斯夫、杜邦、菲仕蘭等。雖然我國目前尚未允許HMOs在嬰兒配方粉中應(yīng)用，但是已有越來越多的學(xué)者關(guān)注到這一領(lǐng)域，并且在研究中也取得了不錯的成果。

表2 可用于嬰兒配方粉中的HMOs
Table2 HMOs approved for application in infant formula

允許添加的HMOs 建議劑量 已批準國家和地區(qū) 最早批準時間2’-FL不高于1.2 g/L（歐洲）；不高于96 mg/100 kJ（澳大利亞）歐洲國家、美國、澳大利亞、亞太地區(qū)（中國香港、新加坡等）等40多個國家或地區(qū)2014年歐洲食品安全局率先允許HMOs應(yīng)用在嬰幼兒配方粉中LNnT不高于0.6 g/L（歐洲）；不高于24 mg/100 kJ（澳大利亞）歐洲國家、美國、澳大利亞等 2017年LNT 不高于0.8 g/L 歐洲 2020年

6 結(jié) 語

總之，作為母乳重要組成部分的HMOs具有重要的功能作用，但是其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)限制著人們對HMOs的認知以及應(yīng)用。隨著HMOs人工合成的進一步發(fā)展，特別是重組細胞的生物合成在大規(guī)模生產(chǎn)和分離純化方面有了一定的進展，HMOs在嬰兒配方奶粉中的應(yīng)用會更被重視。HMOs的種類眾多，僅添加一種或少數(shù)幾種是不足以滿足嬰兒對HMOs的所有需求，并且HMOs在個體之間還存在著差異，因此仍需大量深入研究，特別是需要大量臨床研究為HMOs的有益效果以及在嬰兒配方奶粉中的應(yīng)用提供合理詳細的證據(jù)。

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