編譯：微科盟聽雪齋，編輯：微科盟居居、江舜堯。

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導讀   新生兒微生物組的母體播種促進了持久的生物足跡，但其如何影響生命早期的疾病易感性仍然未知。本研究假設給懷孕小鼠喂食丁酸鹽會影響新生兒對膽道閉鎖的易感性，膽道閉鎖是新生兒的一種嚴重膽道疾病。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)給母鼠服用丁酸鹽可使新生小鼠抵抗炎癥和膽管損傷，并提高存活率。肝免疫細胞活化和存活特性的預防與擬桿菌和梭菌的糞便特征有關，并增加新生小鼠糞便代謝物中的谷氨酸/谷氨酰胺和次黃嘌呤。在患有膽道閉鎖的人類新生兒中，這些細菌的糞便微生物組特征表現(xiàn)不足，谷氨酸/谷氨酰胺受到抑制，次黃嘌呤途徑增加。直接給新生小鼠施用丁酸鹽或谷氨酰胺可減輕疾病表型，但只有谷氨酰胺可使膽管上皮細胞對自然殺傷細胞的細胞毒性產(chǎn)生抗性。因此，母體攝入丁酸鹽會影響新生小鼠的糞便微生物群和代謝物以及實驗性膽道閉鎖的表型表達，谷氨酰胺會促進膽管上皮細胞的存活。    

論文ID

原名：Maternal regulation of biliary disease in neonates via gut microbial metabolites

譯名：母體通過腸道微生物代謝物調節(jié)新生兒膽道疾病

期刊：Nature Communications

IF：17.694

發(fā)表時間：2022.1

通訊作者：Shao-tao Tang ＆ Jorge A. Bezerra

通訊作者單位：美國辛辛那提大學醫(yī)學院；美國辛辛那提兒童醫(yī)院醫(yī)療中心

DOI號：10.1038/s41467-021-27689-4

實驗設計

結果

1 母體攝入丁酸鹽可保護新生兒免受膽管損傷 

本研究給懷孕小鼠喂食丁酸鹽并評估新生小鼠對病毒感染的結果。在整個妊娠期和分娩后的前4周，將丁酸鹽添加到雌性BALB/c小鼠的飲用水中(200 mmol/L，pH調節(jié)至7.5)；另一組僅接受飲用水作為對照(圖1A)。在分娩后24 h內(nèi)，我們給后代腹腔注射1.5 × 106熒光形成單位(ffu)的恒河猴輪狀病毒(RRV)(或相似體積的磷酸鹽緩沖鹽水[PBS]來控制新生小鼠)。

在水喂養(yǎng)母親的小鼠中，輪狀病毒感染會導致進行性黃疸并在14天內(nèi)導致80%的死亡率，剩下的20%代表在該小鼠模型中可以觀察到的嚴重程度的微小變化。相比之下，丁酸鹽喂養(yǎng)母親的小鼠的臨床進化分為一小群小鼠，它們具有相似的進行性黃疸和死亡率(40%的幼崽，稱為“患病”)和僅表現(xiàn)出短暫性黃疸的第二個存活組(60%的幼鼠，稱為“抗性”)。

該“抗性”組的幼鼠血清總膽紅素(膽汁淤積的標志物)和丙氨酸氨基轉移酶(ALT；肝損傷的標志物)水平低于有癥狀的同窩幼鼠和對照組(圖1B-E)。與臨床和生化改善相一致的是，丁酸鹽喂養(yǎng)母親的幼鼠肝外膽管(EHBD)是通暢的，肝臟炎癥僅限于門靜脈，而輪狀病毒感染的對照組則有完全的膽管阻塞和廣泛的肝損傷(圖1F和圖S1A-C)。在RRV感染后第7天，丁酸鹽喂養(yǎng)母親的小鼠的組織炎癥和損傷減少與肝臟或膽管中的病毒滴度無關(圖1G)。

為了控制丁酸鹽誘導的腸道內(nèi)容物酸化對疾病表型保護的潛在影響，我們根據(jù)用于丁酸鹽的相同實驗方案。我們發(fā)現(xiàn)妊娠期丙酸喂養(yǎng)不能保護新生小鼠免受RRV誘導的BA的影響，這可以通過黃疸的均勻發(fā)作和進展、到第14天100%的死亡率、高血清ALT和膽紅素以及EHBD和門靜脈完全阻塞來證明炎癥(圖S2A-F)。這些實驗支持母體丁酸鹽喂養(yǎng)在保護新生小鼠膽道損傷方面可能具有致病作用。

 基于丁酸鹽的免疫調節(jié)特性，我們通過流式細胞術分析在輪狀病毒感染后7天(導管阻塞時間)對肝單個核細胞(MNCs)進行了量化，發(fā)現(xiàn)輔助T細胞(TH、CD3+CD4+)、細胞毒性T細胞(TC、CD3+CD8+)和NK (CD3–CD49b+)細胞顯著減少，調節(jié)性T細胞(TREG、CD3+CD4+CD25+Foxp3+)和IL-10+ TREG細胞優(yōu)先增加，但對巨噬細胞、中性粒細胞或樹突狀細胞(DCs)沒有影響(圖1H和圖S3)。流式細胞儀分析的門控策略如圖S10A-G所示。因此，母體攝入丁酸鹽可抑制RRV感染新生兒中效應淋巴細胞的組織浸潤，促進IL-10+ TREG細胞的活化，并阻止疾病表型的表達。為了確定丁酸鹽是否直接促進了對RRV的抗病性和炎癥反應的抑制，我們在感染后1天開始向RRV感染的新生小鼠口服丁酸鹽(0.3 mg/g體重)(圖2A)，遵循先前公布的方案。

丁酸鹽降低了黃疸的發(fā)生率，提高了存活率，并在不改變膽管和肝臟中病毒滴度的情況下防止了導管阻塞(圖2B-E)?；谶@些發(fā)現(xiàn)和丁酸鹽的免疫調節(jié)特性，我們通過在0.1-0.25 mM丁酸鹽存在下培養(yǎng)RRV感染的新生小鼠的肝MNC 3天來驗證丁酸鹽抑制效應淋巴細胞活化的假設。丁酸鹽對MNC中Foxp3 mRNA表達只有適度的影響，并意外地降低了Il10 mRNA表達(圖2F，G)。這些發(fā)現(xiàn)提出了一種可能性，即母體喂養(yǎng)丁酸鹽對肝膽損傷的保護作用包括其他微生物組依賴性因素。

圖1. 母體攝入丁酸鹽可抑制子代肝臟和膽管損傷。

A示意圖顯示對輪狀病毒(RRV)感染小鼠給藥丁酸鹽或水，然后評估膽道疾病。

B水或丁酸鹽喂養(yǎng)母親的RRV感染新生小鼠的黃疸(廣義線性混合效應模型，雙側Wald檢驗，采用Bonferroni校正；****p?<?0.0001)和C存活率(雙側對數(shù)秩檢驗；****p?<?0.0001)(每組n?=?67-74只小鼠)。來自水或丁酸鹽喂養(yǎng)母親的RRV或PBS(Ctrl，n?=?4)后12–14天新生小鼠的血漿丙氨酸氨基轉移酶(ALT，[D])和總膽紅素(E)(n?=?5)

F RRV或PBS后12-14天肝外膽管(EHBD)和肝臟切片(?水和丁酸鹽=母體喂養(yǎng)；比例尺=100 ?μm；PV門靜脈)。對每個組織樣本進行H&E染色的15-30個EHBD和5-10個肝臟切片進行組織學分析。

G水和丁酸鹽喂養(yǎng)母鼠的新生小鼠感染RRV后第7天EHBD和肝臟中的病毒滴度(平均值?±?SD，韋爾奇校正的雙尾非配對Student’s t檢驗；每組n=?5個生物學上獨立的EHBD或肝臟；ns?=?不顯著)。

H火山圖顯示RRV感染7天后，水和丁酸鹽處理的母親的新生小鼠之間的肝單個核細胞p值和倍數(shù)變化。使用生物學上不同的樣本確定重復值，并使用雙尾非配對Student’s t檢驗計算p值。流式細胞儀分析的門控策略如圖S10A-K所示。

圖2. 用丁酸鹽治療新生兒可減少肝膽損傷。

A丁酸鈉灌胃RRV感染新生小鼠的示意圖。

B每日用丁酸鹽或PBS處理的RRV感染新生小鼠的黃疸(廣義線性混合效應模型，雙側Wald檢驗，采用Bonferroni校正；****p?<?0.0001)和C存活率(雙側對數(shù)秩檢驗；***p?<0.001)。

D來自水喂養(yǎng)母親的新生小鼠感染RRV后第7天EHBD和肝臟中的病毒滴度(平均值?±?SD，韋爾奇校正的雙尾非配對t檢驗；每組n?=?5；ns?=不顯著)以及E?在RRV感染14天后丁酸鹽處理小鼠的EHBD切片中的病毒滴度。對每個組織樣本15-30個經(jīng)H&E染色的EHBD切片進行組織學分析。比例尺??=?50 μM。用或不用丁酸鹽培養(yǎng)的RRV-naive或primed肝單個核細胞中的Foxp3(F)和Il10(G)mRNA，標準化為Gapdh(平均值?±?SD，Duncan多重比較的雙尾方差分析，每組n?=?3，* p ?<?0.05，**p?<?0.01，ns?=?不顯著)。 

2 抗病后代與丁酸鹽喂養(yǎng)的母親具有相似的微生物特征 

為了研究丁酸鹽是否能選擇性富集與抑制組織損傷相關的腸道微生物群，我們分析了分娩時母親以及病毒接種后12-14天感染RRV和未感染RRV的新生小鼠的糞便微生物群(圖3A)。在水喂養(yǎng)對照組中，16s rRNA測序產(chǎn)生的操作分類單元(OTUs)的非度量多維標度(NMDS)分析表明，母親的微生物組與RRV未感染后代的微生物組分離，并與患有膽道梗阻的感染新生小鼠不同(圖3B，C)。

同樣，在RRV感染后未出現(xiàn)膽道梗阻的丁酸鹽組的微生物OTU(“抗性”亞組)與其丁酸鹽喂養(yǎng)的母親和RRV未感染的新生小鼠相似，但不同于發(fā)生疾病的小鼠亞組(“患病亞組”；圖3D，E)。

與患病表型的小鼠相比，丁酸鹽處理的懷孕小鼠與其抗病后代之間共享細菌特征的其他證據(jù)包括更多的共享OTUs(圖3F和表S1)、厚壁菌門和擬桿菌門的優(yōu)勢富集，以及對RRV引起的膽道損傷具有抗性的小鼠中的變形菌門減少(圖3G，H)。相應地，對在丁酸鹽喂養(yǎng)的懷孕小鼠糞便樣本中檢測到的1315個OTUs進行分析，顯示擬桿菌門和厚壁菌門占優(yōu)勢(表S2)。這些數(shù)據(jù)將丁酸鹽喂養(yǎng)的母親的微生物群與其對疾病表型具有獨特抗性的后代聯(lián)系起來。

圖3. 丁酸鹽喂養(yǎng)的母親和對疾病表型有抗性的后代之間共有的微生物特征。

A水和丁酸鹽喂養(yǎng)的雌性RRV感染小鼠糞便微生物組分析的實驗概述。注射RRV或PBS后12–14天，來自水(B，C)和丁酸鹽喂養(yǎng)(D，E)的母親和后代糞便樣本的16s rRNA操作分類單元(OTU)的NMDS排序和相似性分析(ANOSIM)。

F Venn圖描繪了丁酸鹽處理的懷孕母鼠及其感染RRV且有(患病)或無(抗性)膽道梗阻的后代的OTU數(shù)量(Fisher精確檢驗和校正標準化殘差的Z值，每組n?=?6-11)。

G 85個OTU在丁酸鹽喂養(yǎng)的母親和患病及抗病后代之間共享，而508個OTU在丁酸鹽喂養(yǎng)的母親和抗病后代之間共享(卡方檢驗和校正標準化殘差的Z值，每組n?=?6-11)。

H Cladogram圖顯示，在來自丁酸鹽喂養(yǎng)母親的RRV感染新生小鼠中，患病和抗性表型之間的細菌類群豐度存在顯著差異(LDA得分>3.5)(Kruskal-Wallis秩和檢驗，每組n?=?6-11)。 

3 小鼠糞便代謝物抑制免疫細胞活化 

為了尋找微生物組抑制疾病表型的潛在機制，我們過濾水喂養(yǎng)或丁酸鹽喂養(yǎng)母鼠的新生小鼠的糞便上清液，并將上清液與來自RRV感染新生小鼠的肝臟MNCs一起培養(yǎng)(圖4A)。丁酸鹽組的糞便上清液顯著增加了MNC中Il10和Foxp3 mRNA的表達，并降低了Tnfa的表達(圖4B-D)，表明糞便衍生分子抑制了促炎回路。為了鑒定這些分子，我們通過基于質子核磁共振譜(1H-NMR)的代謝組學分析了來自水或丁酸鹽喂養(yǎng)母親的新生小鼠的糞便上清液，這些代謝組學可定量56種化合物。代謝產(chǎn)物的NMDS分析將丁酸鹽組與非丁酸鹽組區(qū)分開來(圖4E)，丁酸鹽喂養(yǎng)母鼠的幼鼠糞便上清液中氨基酸、酮體、短鏈脂肪酸和檸檬酸循環(huán)的代謝中間產(chǎn)物顯著增加(圖4F和圖S4A、B)。

在兩組之間存在顯著差異的37種代謝物中，丁酸鹽組的糞便上清中次黃嘌呤和谷氨酸的豐度增加最大，其相關分子肌苷和谷氨酰胺的變化幅度較小(圖4G)，從而提高了它們在抑制新生小鼠免疫介導的膽管損傷中的潛在效應作用。為了研究代謝物與糞便微生物種群之間的關系，我們分析了來自“患病”和“抗性”亞組的糞便微生物組的16s rRNA測序數(shù)據(jù)，使用PICRUSt量化宿主基因家族、使用MetaCyc分析通路，并使用ALDEx2來測試差異豐度。我們在“抗性”小鼠亞組中發(fā)現(xiàn)了谷氨酸/谷氨酰胺、次黃嘌呤/肌苷和丁酸途徑的富集(圖S5)。丁酸途徑由產(chǎn)丁酸的厚壁菌(厚壁菌門、梭菌門、梭菌目和瘤胃球菌科)和擬桿菌(擬桿菌門、擬桿菌綱、擬桿菌目、擬桿菌科、擬桿菌屬)分類群代表(圖S6)。這些途徑共有的細菌基因與丁酸合成的乙酰輔酶A和賴氨酸途徑的分子有關(表S3)。

圖4. A體外糞便上清液-免疫細胞培養(yǎng)和糞便代謝物分析示意圖。

在水或丁酸鹽喂養(yǎng)母親的新生小鼠糞便上清液中培養(yǎng)的RRV誘導的肝MNC中，Il10(B)、Foxp3(C)和Tnfa(D)的mRNA表達與Gapdh的比率(平均值?±?SD，雙尾非配對t檢驗，每組n?=?4，*P?<?0.05，**p?<?0.01，***p?<?0.001)。

E 14日齡水或丁酸鹽喂養(yǎng)母親的新生小鼠糞便上清液中代謝物的NMDS和ANOSIM分析。

F火山圖顯示了水和丁酸鹽喂養(yǎng)母親的新生小鼠之間具有p值和倍數(shù)變化的糞便代謝物。使用生物學上不同的樣本確定重復值，并使用雙尾非配對t檢驗計算p值。G根據(jù)火山圖測得的歐幾里德距離排序的糞便代謝物。 

4 人類新生兒糞便宏基因組測序中的代謝途徑富集 

為了探索新生小鼠的微生物和代謝特征與人類嬰兒肝膽損傷潛在機制的相關性，我們對102名確診為BA的嬰兒和28名正常對照(NC)的糞便樣本進行了鳥槍宏基因組測序(圖5A和圖S7A)。

從總體微生物群落組成來看，BA組與對照組在觀察到的物種數(shù)量或Shannon多樣性或分離度上均無差異(圖S7B-E)。Shannon指數(shù)和NMD之間差異不大可能與幼兒腸道微生物組固有的低多樣性有關。通過回歸分析檢查細菌種群，發(fā)現(xiàn)BA中Proteobacteria、Bacilli (Lactobacillus spp.)、Fusobacteria和其他病原體(如鏈球菌、克雷伯氏菌和腸球菌)的豐度更高，而NCs中Bacteroidetes和Clostridia顯著富集(圖5B和圖S7F，G)，類似于在丁酸鹽喂養(yǎng)母親的抗病新生小鼠中觀察到的富集。

為了確定這種微生物特征如何潛在地轉化為功能差異，我們使用HUMAnN2匯總了UniRef90基因家族到MetaCyc通路的人類微生物圖譜的序列reads，并使用ALDEx2測試差異豐度。根據(jù)校正后的p<0.05確定的14條途徑中，有7條與谷氨酸/谷氨酰胺和丁酸鹽分子相關，PWY-4984(尿素循環(huán))和CITRULBIO-PWY(L-瓜氨酸生物合成)與NCs分離的效應大小最高(圖5C和表S4)。

在NCs中富集的7個物種中(圖S7G)，當使用BioCyc數(shù)據(jù)庫進行分析時，F(xiàn)lavonifractor plautii、Hungatella hathewayi、Clostridium neonatale、Bacteroides dorei和Bacteroides fragilis(圖S7H)顯示參與丁酸生產(chǎn)的酶和基因的過表達(表S5)。與來自丁酸鹽喂養(yǎng)母親的RRV-naive小鼠糞便中的高濃度次黃嘌呤相反，次黃嘌呤(在PWY0-1297嘌呤降解超途徑中)在BA嬰兒的糞便中富集，從而提高了谷氨酸/谷氨酰胺和次黃嘌呤在疾病表型確定中發(fā)揮不同作用的可能性。

圖5. A膽道閉鎖嬰兒和健康對照的糞便微生物組分析示意圖概述。B Cladogram圖顯示膽道閉鎖嬰兒(n?=?102)和年齡匹配的對照(n=28)之間的的細菌類群豐度存在顯著差異(校正后的p值<0.05)。C膽道閉鎖微生物群落和對照組顯著調節(jié)的功能通路，由HUMAnN2根據(jù)Metayc通路計算(校正后的p值<0.05)。

圖6. 谷氨酰胺抑制實驗性膽道閉鎖的梗阻表型并提高存活率。

A用肌苷和/或谷氨酰胺治療RRV感染的新生小鼠的實驗設計。

B-D注射PBS或感染RRV的新生小鼠腹腔注射肌苷、谷氨酰胺和肌苷+?谷氨酰胺后的黃疸發(fā)生率?(每組n?=?22-29；廣義線性混合效應模型，雙側Wald檢驗，Bonferroni校正**P?<?0.01，***p?<?0.001，ns?=?不顯著)。在出生后的前2周，與接受PBS(對照)的新生小鼠相比，接受肌苷(E)、谷氨酰胺(F)和肌苷+?谷氨酰胺(G)治療的新生小鼠的存活率?(每組n?=?22-29；雙側對數(shù)秩檢驗，****p?<?0.0001，ns?=?不顯著)。注射磷酸鹽緩沖鹽水(PBS；Ctrl，n)或RRV感染和肌苷(n=4)、谷氨酰胺(n=4)和肌苷+谷氨酰胺(n=4)每日治療12-14天后的血漿丙氨酸氨基轉移酶(ALT，[H])和總膽紅素水平(I?)(平均值±?SD，Duncan多重比較雙尾方差分析*P?<?0.05，**p?<?0.01，***p?<?0.001，****p?<?0.0001)。RRV后12-14天和注射RRV后肌苷、谷氨酰胺和肌苷+谷氨酰胺每日治療后12-14天新生小鼠肝外膽管(EHBD)和肝臟切片(J-O)的蘇木精-伊紅染色切片。對每個組織樣本經(jīng)H&E染色的15-30個EHBD和5-10個肝臟切片進行組織學分析。 

5 谷氨酰胺可預防膽道損傷并促進上皮細胞存活 

為了直接研究谷氨酸/谷氨酰胺和次黃嘌呤/肌苷在疾病機制中的生物學作用，我們從接種RRV后一天開始，每隔一天對來自水喂養(yǎng)母親的新生小鼠腹腔注射谷氨酰胺(0.25 mg/g體重)、肌苷(一種由核糖環(huán)和次黃嘌呤組成的核苷，0.2 mg/g體重)、谷氨酰胺+肌苷或PBS(圖6A)。選擇谷氨酰胺的理由是基于其在BA患兒中的水平較低，它是一種條件必需氨基酸，影響細胞內(nèi)生物能量利用，它通過谷胱甘肽(GSH)支持細胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)；相反，谷氨酸(帶負電荷)發(fā)揮肝外生物學效應，如神經(jīng)傳遞。

由于次黃嘌呤的水溶性差和潛在毒性，我們使用肌苷(一種天然存在的嘌呤和次黃嘌呤的前體)，具有更好的安全性和免疫調節(jié)特性。肌苷給藥并沒有改變感染RRV的新生小鼠的黃疸發(fā)展或存活率差的情況；相比之下，單獨使用谷氨酰胺可顯著降低黃疸，提高存活率至83.3%(圖6B-G)，并抑制組織損傷(圖6H-O)，T細胞、NK細胞、DCs、中性粒細胞和巨噬細胞數(shù)量較少，IL-10+TREG細胞數(shù)量增加(圖7A、B和圖S8)。從用谷氨酰胺處理的RRV感染小鼠中分離出的肝NK細胞的功能評估顯示，其體外溶解膽管細胞的能力降低(膽管上皮細胞；圖7C)。

為了研究谷氨酰胺如何調節(jié)NK細胞溶解膽管細胞的能力，我們首先使用NK細胞-膽管細胞共培養(yǎng)試驗來評估白細胞介素(IL)-10是否對細胞溶解有保護作用。在RRV誘導的肝NK細胞和膽管細胞的培養(yǎng)基中添加IL-10(30? ng/ml)并不能阻止膽管細胞溶解(圖7D)。為了研究谷氨酰胺抑制NK細胞裂解的機制，我們用谷氨酰胺進行了試驗，發(fā)現(xiàn)8-16?mM谷氨酰胺阻斷了膽管細胞溶解(圖7E)。為了精確識別谷氨酰胺的細胞靶點，我們在細胞裂解試驗之前分別用谷氨酰胺孵育RRV誘導的肝NK細胞或膽管細胞。雖然用谷氨酰胺預孵育NK細胞不會抑制細胞溶解(圖7F)，但用谷氨酰胺預孵育膽管細胞會使細胞對NK細胞誘導的溶解產(chǎn)生抗性(圖7F)。 基于谷氨酸/谷氨酰胺調節(jié)細胞內(nèi)氧化平衡的能力，我們測量了用谷氨酰胺培養(yǎng)的膽管細胞中的GSH，發(fā)現(xiàn)在所有濃度下GSH都顯著增加(圖7G)。

為了檢測GSH的富集是否會獨立地阻止膽管細胞溶解，我們將N-乙酰半胱氨酸(NAC)添加到共培養(yǎng)試驗中，并觀察到幾乎完全阻止膽管細胞溶解(圖7H)。為了測試GSH豐度與谷氨酰胺在體內(nèi)的保護作用的相關性，我們將RRV接種到新的新生小鼠組中，并使用圖6A所示的實驗策略和方案將其分配給谷氨酰胺或生理鹽水處理。雖然RRV感染顯著降低了肝臟和EHBD中GSH的濃度，但谷氨酰胺的施用增加了兩種組織中的GSH水平，并接近未感染對照組的水平(圖7I，J)?？傊@些數(shù)據(jù)確定了谷氨酰胺通過GSH富集促進膽管細胞對抗病毒激活的NK細胞存活的獨特保護作用。

圖7. A肝單個核細胞流式細胞術和體外NK細胞介導的膽管毒性試驗的圖示。

B火山圖注射了磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)和谷氨酰胺的新生小鼠之間在注射RRV 7天后的肝免疫細胞的p值和倍數(shù)變化。使用生物學上不同的樣本確定重復值，并使用雙尾非配對t檢驗計算p值。流式細胞術分析的門控策略如圖S10A-K。

C在30 ng/ml IL-10存在(n=3)或不存在(n=3)的情況下，與來自PBS(n?=?3)或谷氨酰胺(n?=?3)注射的新生小鼠的RRV誘導的肝NK細胞和小鼠膽管細胞系或D共培養(yǎng)后膽管細胞溶解百分比(平均值?±?SD，雙尾非配對t檢驗，****p <?0.0001，ns?=?不顯著)。

E 用RRV誘導的NK細胞與增加濃度的谷氨酰胺共培養(yǎng)(每組n?=?4)，或當單個細胞類型與谷氨酰胺預孵育時，測定膽管細胞溶解(每組n?=?4；平均值?±?SD，Duncan多重比較雙尾方差分析，*p?<?0.05，**p?<?0.01，***p?<?0.001，****p?<?0.0001，ns?=?不顯著)。

G 顯示與不同濃度的谷氨酰胺培養(yǎng)后在膽管細胞中測量的總GSH水平(每組n?=?3-4；平均值?±?SD，Duncan多重比較雙尾方差分析***p?<?0.001，****p?<?0.0001)。

H 在谷氨酰胺(n=8；2個技術重復和4個生物學重復)和N-乙酰半胱氨酸(NAC)(n=8，2個技術重復和4個生物學重復；平均值?±?SD，Duncan多重比較雙尾方差分析***p<?0.001，****p?<?0.0001)存在下，NK細胞介導的膽管細胞溶解。I 對照組和RRV感染的新生小鼠經(jīng)谷氨酰胺治療或未經(jīng)谷氨酰胺治療后肝臟(每組4個生物重復)和 J 肝外膽管(每組4個生物重復)上清液中測量的GSH總水平(平均值?±?SD，Duncan多重比較雙尾方差分析，**p?<?0.01，***p?<?0.001，****p?<?0.0001)。

討論

妊娠期丁酸喂養(yǎng)對抑制新生兒膽管損傷的有益影響強調了母親因素與出生后早期疾病易感性的相關性。在實驗性BA(產(chǎn)前發(fā)病和多因素發(fā)病的嚴重疾病原型)中，在懷孕小鼠的飲用水中簡單添加短鏈脂肪酸(丁酸)可使新生小鼠抵抗組織損傷和膽管阻塞表型。通過尋找導致表型改善的生物過程，我們在丁酸鹽喂養(yǎng)的母親和對實驗性BA有抗性的新生兒中發(fā)現(xiàn)了相似的糞便微生物群特征，以及來自丁酸鹽喂養(yǎng)母親的新生兒腸道內(nèi)容物中谷氨酸/谷氨酰胺和次黃嘌呤/肌苷代謝物的富集。給RRV感染的幼鼠服用谷氨酰胺并將其添加到培養(yǎng)的膽管細胞中，可抑制炎癥，提高組織中GSH水平，并保護上皮細胞免受活化的肝NK細胞的細胞溶解特性的影響。將丁酸鹽直接施用于新生兒顯示出其抑制淋巴細胞活化、增加IL-10+TREG細胞和防止膽道損傷的能力，而與微生物組變化無關。

然而，其在體外無法抑制活化的肝臟MNCs或誘導Il10 mRNA的表達，這表明存在其他阻止肝臟和膽管損傷的因 素。 與已證實的丁酸鹽在厭氧環(huán)境中促進微生物種群差異生長的影響一致，對組織損傷有抵抗力的新生小鼠的糞便中存在大量厚壁菌和擬桿菌(類似于丁酸鹽喂養(yǎng)的母親的糞便微生物特征)，這一特征也存在于健康人類嬰兒的糞便中。

值得注意的是，結腸中約85%的總丁酸生產(chǎn)能力由厚壁菌門(包括毛螺菌科和瘤胃球菌科)代表，而在較小程度上由擬桿菌門譜系代表。這種微生物特征的保護作用的初步線索來自其在RRV感染的患有BA的新生小鼠和患有該疾病的人類嬰兒的糞便中的代表性不足，其中Proteobacteria、Bacilli(乳桿菌屬)、Fusobacteria和其他機會致病菌(如鏈球菌、克雷伯氏菌和腸球菌)的富集更為顯著。微生物種群相關性的一個更強有力的線索是，丁酸鹽喂養(yǎng)的母親所生的新生小鼠糞便代謝物中谷氨酸和谷氨酰胺的增加，以及谷氨酰胺給藥在很大程度上阻止了新生小鼠實驗性BA的發(fā)展。 

從機制上講，谷氨酰胺對活化的肝NK淋巴細胞的細胞溶解特性顯示出膽管上皮的主要細胞保護作用。這與先前報道的NK細胞在膽管上皮損傷中的作用一致，抗體介導的NK細胞丟失可防止新生小鼠在RRV感染后發(fā)生上皮損傷和膽管阻塞。然而，在本研究中，谷氨酰胺似乎主要有益于膽管上皮，正如預孵育實驗所表明的那樣，在預孵育實驗中，用谷氨酰胺培養(yǎng)膽管細胞使這些細胞抵抗活化的肝NK細胞的細胞溶解特性。為了探索谷氨酰胺促進膽管細胞存活的潛在機制，我們發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺豐富了RRV感染幼鼠肝臟和膽管中GSH的細胞內(nèi)含量，以及在補充谷氨酰胺的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的膽管細胞中GSH的含量，并促進NAC存在下培養(yǎng)的膽管細胞的細胞保護。

NAC的保護作用與先前的一項研究一致，該研究報告了BA患兒中GSH相關基因表達降低和不良預后，以及在纖維化膽管病變模型中用NAC治療的新生小鼠的預后改善。這些數(shù)據(jù)表明谷氨酰胺和谷胱甘肽在促進上皮細胞存活方面具有重要的特性。 母體丁酸鹽?→?新生兒腸道Clostridiales和Bacteroidetes以及谷氨酸/谷氨酰胺合成富集?→?防止組織損傷的定向鏈接對于理解生命早期表現(xiàn)出的疾病的致病機制具有重要意義。本研究沒有控制膽汁淤積對新生兒微生物組成的影響及其對疾病結局的影響。在人類中，這可以通過納入一組年齡匹配的患有其他類型膽汁淤積綜合征的人類嬰兒來實現(xiàn)。在實驗上，這可以通過膽管結扎來實現(xiàn)，但由于無法在1-2天大的老鼠身上進行這類手術，因此該模型并不特別適合。

在人類BA中，已在患有該疾病的不同隊列中檢測到幾種病毒(如輪狀病毒、巨細胞病毒、呼腸孤病毒)，但缺乏流行病學重現(xiàn)性或疾病發(fā)病機制中直接因果關系的實驗證據(jù)表明，其他因素可能導致組織損傷和疾病的完整表型表達。丁酸鹽或其他代謝物通過母乳的垂直傳播可能有助于后代的疾病保護。雖然我們沒有測量哺乳期小鼠的代謝物，但在母乳中發(fā)現(xiàn)了高達750 ?μM的丁酸濃度，可能調節(jié)耐受性細胞因子的表達、TREG細胞群和抗IL-1β活性。此外，谷氨酸和谷氨酰胺是母乳中豐富的游離氨基酸，在哺乳1-6個月期間，谷氨酰胺濃度增加約350%。

本研究發(fā)現(xiàn)，新生兒發(fā)育中的微生物群是母親影響下的因素之一，可調節(jié)出生后生命早期的疾病易感性。微生物組作為代謝物的來源，可以抑制免疫細胞(丁酸和谷氨酰胺)并促進上皮細胞中的生存信號(谷氨酰胺)，從而間接保護肝臟和膽管免受病毒誘導的組織損傷。這些數(shù)據(jù)提高了丁酸鹽和/或谷氨酰胺在BA或其他兒童肝膽疾病中調節(jié)免疫反應和幫助組織修復的潛力。除了我們發(fā)現(xiàn)的疾病特異性影響外，母親和新生小鼠之間微生物特征的相似性以及它們在懷孕期間飲食改變后的變化強調了母親對可能調節(jié)新生兒臨床表型表現(xiàn)的關鍵生物學過程的影響。

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