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腸道微生態(tài)在腦老化認(rèn)知功能減退中的作用及機(jī)制研究

來(lái)源：泰然健康網(wǎng) 時(shí)間：2024年12月15日 10:02

腸道微生態(tài)在腦老化認(rèn)知功能減退中的作用及機(jī)制研究

【摘要】： 目的:隨著社會(huì)的不斷進(jìn)步和發(fā)展,人類生存質(zhì)量大幅提高,預(yù)期壽命不斷增長(zhǎng),全球性人口老齡化程度也日趨增加。老年人群機(jī)體功能不斷減退,各臟器生理儲(chǔ)備功能下降,機(jī)體的脆弱性增加,維持穩(wěn)態(tài)的能力下降,面對(duì)各種應(yīng)激時(shí),發(fā)病和死亡的風(fēng)險(xiǎn)大大增加。因此,深入了解衰老的生物學(xué)過(guò)程,提高生命質(zhì)量,實(shí)現(xiàn)健康老齡化,預(yù)防衰老相關(guān)疾病的發(fā)生,不僅是生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重大科學(xué)問(wèn)題,也是具有重要戰(zhàn)略意義的社會(huì)問(wèn)題。老化,是指隨年齡增長(zhǎng)個(gè)體生存及整體功能下降的過(guò)程,是正常生命進(jìn)程中的一個(gè)必然階段。隨增齡發(fā)生的腦老化過(guò)程雖有各種不同的改變及表現(xiàn),但認(rèn)知功能減退(增齡性認(rèn)知功能減退)是其最重要的特征,其機(jī)制復(fù)雜且不明確。在人體腸道中生活著100萬(wàn)億個(gè)微生物,被稱為腸道微生物或腸道菌群。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)腸道微生物的改變與許多疾病相關(guān),包括心血管疾病、腸易激綜合征(IBS)、炎癥性腸病、肥胖和2型糖尿病等。來(lái)自人群研究發(fā)現(xiàn),老年人群的腸道微生態(tài)發(fā)生顯著改變,構(gòu)成老化過(guò)程的重要機(jī)制和標(biāo)志,可能影響老年人的健康水平和疾病發(fā)生。越來(lái)越多的證據(jù)表明腸道微生物參與調(diào)控大腦功能及行為,腸道菌群改變可能參與神經(jīng)退行性疾病AD、PD以及精神類疾病如自閉癥譜系障礙(ASD)和抑郁等的發(fā)生。也有一些報(bào)道顯示腸道微生態(tài)對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響,包括:與SPF(Specified Pathogen Free,無(wú)特定病原體)小鼠相比,GF(Germ Free,無(wú)菌)小鼠表現(xiàn)為非空間記憶(新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn))的缺陷和工作記憶(T迷宮)的損傷;聯(lián)合抗生素(氨芐青霉素、桿菌肽、美羅培南、新霉素、萬(wàn)古霉素)處理SPF小鼠,使小鼠的新物體識(shí)別記憶受損;用C.rodentium(檸檬酸桿菌)感染SPF小鼠改變腸道微生物,則導(dǎo)致應(yīng)激誘導(dǎo)的記憶障礙,而在感染前使用益生菌干預(yù)能夠預(yù)防感染導(dǎo)致的腸道微生物的改變并改善其學(xué)習(xí)記憶功能和HPA軸功能。但上述所有研究都是成年鼠在特殊實(shí)驗(yàn)條件如無(wú)菌(GF)鼠、致病菌感染、使用益生菌或抗生素?cái)_亂正常菌群,觀察到腸道微生態(tài)對(duì)學(xué)習(xí)記憶產(chǎn)生了影響。在此過(guò)程,既無(wú)衰老的過(guò)程,又無(wú)老化的生物學(xué)特征,不能反映老化條件下腸道微生態(tài)與認(rèn)知功能的關(guān)聯(lián)。目前尚無(wú)利用正常衰老的動(dòng)物,系統(tǒng)觀察腸道微生態(tài)對(duì)腦老化認(rèn)知功能減退(增齡性認(rèn)知功能減退)的作用及機(jī)制探討的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究利用正常衰老大鼠及將老年大鼠的腸道菌群移植給年輕大鼠的動(dòng)物模型進(jìn)行三部分實(shí)驗(yàn)。(1)通過(guò)基于操作條件反射的延遲匹配樣本任務(wù)(DMTP)和Y迷宮,觀察年輕大鼠和老年大鼠認(rèn)知行為差異;通過(guò)16s rRNA基因測(cè)序比較年輕大鼠與老年大鼠的腸道菌群;(2)通過(guò)糞菌移植(FMT),將老年大鼠的腸道菌群移植給年輕大鼠,觀察具有了老年大鼠腸道菌群的年輕大鼠其認(rèn)知行為是否改變;在此基礎(chǔ)上,通過(guò)rs-fMRI觀察FMT對(duì)不同腦區(qū)及功能連接的影響;通過(guò)電鏡和Golgi染色觀察FMT對(duì)突觸結(jié)構(gòu)及樹(shù)突棘數(shù)量的影響;通過(guò)Western Blot及IHC檢測(cè)FMT對(duì)NMDAR1、BDNF、GR和突觸素表達(dá)量的影響;(3)慢性氧化應(yīng)激損傷是引起腦老化及認(rèn)知功能減退的重要機(jī)制。檢測(cè)老年大鼠和具有了老年大鼠腸道菌群的年輕大鼠腦組織氧化應(yīng)激水平,包括脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA的改變及機(jī)體抗氧化酶SOD、GSH-PX活性,探討在正常老化過(guò)程中,腸道菌群是否通過(guò)氧化應(yīng)激機(jī)制引起腦老化認(rèn)知功能減退。本研究的結(jié)論有可能為腦老化認(rèn)知功能減退(增齡性認(rèn)知功能減退)的發(fā)生發(fā)展及可能機(jī)制提供新的證據(jù)。方法:第一部分觀察老化引起的認(rèn)知行為、腦組織形態(tài)、一些重要信號(hào)分子及腸道菌群的改變。(1)通過(guò)基于操作條件反射的延遲匹配樣本任務(wù)(DMTP)和Y迷宮比較年輕大鼠與老年大鼠的認(rèn)知行為。DMTP主要檢測(cè)大鼠的工作記憶。DMTP包括三個(gè)階段即樣本階段、延遲階段和選擇階段。在樣本階段,房燈亮,實(shí)驗(yàn)開(kāi)始,一個(gè)桿伸出(為樣本桿),老鼠壓桿后桿回縮,開(kāi)始計(jì)時(shí)延遲。經(jīng)過(guò)一定的可變延遲(0 s、2 s、4 s、8 s、12 s、18 s、24 s)后,兩桿同時(shí)伸出,和樣本階段相同的桿為正確桿,選擇正確則獲得食物獎(jiǎng)勵(lì)。Y迷宮主要檢測(cè)大鼠的空間記憶。實(shí)驗(yàn)分兩個(gè)階段,在訓(xùn)練期,用隔板擋住一個(gè)臂(此臂為新異臂),大鼠由起始臂背對(duì)迷宮的中心放入,在起始臂和其他臂自由探索10 min,然后取出;間隔1 h后,開(kāi)始測(cè)試期,打開(kāi)新異臂,大鼠仍由起始臂放入,在三個(gè)臂探索5 min。記錄大鼠進(jìn)入每個(gè)臂的次數(shù)及在每個(gè)臂的持續(xù)時(shí)間。(2)通過(guò)透射電鏡觀察年輕大鼠與老年大鼠海馬和mPFC突觸結(jié)構(gòu)的改變;分析老化引起的突觸結(jié)構(gòu)參數(shù)的改變,包括突觸間隙寬度、突觸后致區(qū)(postsynaptic density,PSD)厚度和突觸界面曲率。通過(guò)Golgi染色觀察年輕大鼠與老年大鼠腦組織樹(shù)突棘數(shù)量。(3)通過(guò)Western Blot及IHC檢測(cè)年輕大鼠與老年大鼠海馬和mPFC的NMDAR1、BDNF、GR及突觸素的表達(dá)。(4)通過(guò)16s rRNA基因測(cè)序比較年輕大鼠與老年大鼠的腸道菌群。收集年輕大鼠與老年大鼠糞便,提取微生物組總DNA,對(duì)16s rDNA的V3、V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將獲得的序列按97%相似度對(duì)可操作分類單元(Operational Taxonomic Unit,OTU)進(jìn)行歸并,進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)和Beta多樣性分析;將OTU代表序列與Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)的模板序列進(jìn)行比對(duì),獲取各樣本在門(mén)、綱、目、科、屬五個(gè)分類水平上的組成和豐度,分析各樣本在不同分類學(xué)水平的菌群組成。第二部分FMT將老年大鼠的腸道菌群移植給年輕大鼠,觀察改變年輕大鼠的腸道菌群,對(duì)其認(rèn)知行為、腦組織形態(tài)及一些重要信號(hào)分子的影響。FMT:取老年大鼠的盲腸內(nèi)容物,溶于一定體積的生理鹽水中,制成糞菌混懸液,800 g離心5 min,取上清獲得新鮮菌液,用于FMT。接受糞菌移植的年輕大鼠,用抗生素混合液灌胃預(yù)處理3天減輕自身菌群對(duì)移植菌群的抵抗,最后一次抗生素處理24 h后,開(kāi)始FMT,每天1次FMT,連續(xù)3天,之后每周2次,持續(xù)2個(gè)月,直至行為測(cè)試。通過(guò)16s rRNA基因測(cè)序確定FMT對(duì)腸道菌群的重塑;通過(guò)DMTP和Y迷宮觀察FMT對(duì)認(rèn)知行為的影響;通過(guò)rs-fMRI觀察FMT對(duì)腦區(qū)及功能連接的影響;通過(guò)透射電鏡及Golgi染色觀察FMT對(duì)突觸結(jié)構(gòu)及樹(shù)突棘的影響;通過(guò)Western Blot及IHC檢測(cè)FMT對(duì)NMDAR1、BDNF、GR及突觸素表達(dá)量的影響;第三部分觀察氧化應(yīng)激在FMT引起腦老化認(rèn)知改變過(guò)程的重要作用。檢測(cè)年輕與老年大鼠腦組織氧化應(yīng)激水平,包括脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA的含量及機(jī)體抗氧化酶SOD、GSH-PX活性,確定老年大鼠腦組織氧化應(yīng)激水平。同時(shí)檢測(cè)FMT后,具有老年大鼠腸道菌群的年輕大鼠腦組織MDA含量及SOD、GSH-PX活性的改變,探討在正常老化過(guò)程中,腸道菌群是否通過(guò)氧化應(yīng)激機(jī)制引起腦老化認(rèn)知功能減退。結(jié)果:(1)隨月齡增加,老年大鼠出現(xiàn)認(rèn)知功能減退。在基于操作條件反射的延遲匹配樣本任務(wù)(DMTP)中,當(dāng)延遲間隔為18 s、24 s時(shí),年輕鼠的正確壓桿率分別為82.43%±5.16%、77.57%±8.55%,而老年鼠的正確壓桿率明顯低于年輕大鼠分別為62.33%±4.40%、52.80%±5.40%(p<0.05);在Y迷宮,年輕大鼠探索新臂次數(shù)占總探索次數(shù)的比率為0.43±0.02,而老年大鼠探索新臂次數(shù)比率明顯減少為0.28±0.02(p<0.01);年輕大鼠探索新臂的時(shí)間占總探索時(shí)間的比率為0.54±0.04,而老年大鼠探索新臂的時(shí)間比率明顯減少為0.22±0.03(p<0.01)。同時(shí),老年大鼠海馬和內(nèi)側(cè)前額葉突觸結(jié)構(gòu)及重要信號(hào)分子發(fā)生改變。隨增齡老年大鼠突觸結(jié)構(gòu)改變,包括突觸間隙變寬,突觸后致密區(qū)(PSD)變薄、突觸界面曲率減小,樹(shù)突分支減少、樹(shù)突棘密度減小;海馬和內(nèi)側(cè)前額葉NMDAR1、BDNF及突觸素表達(dá)水平降低。這些指標(biāo)可作為腦老化的檢測(cè)指標(biāo)。(2)隨月齡增加,老年大鼠腸道微生態(tài)也發(fā)生改變?；贠TU及基于微生物類群的腸道菌群差異性分析均表明,老年大鼠的腸道菌群與年輕大鼠的明顯不同,包括菌群多樣性降低、優(yōu)勢(shì)菌遷變。老年大鼠的Shannon指數(shù)降低(p<0.05),說(shuō)明老年大鼠腸道菌群多樣性降低。擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)和變形菌門(mén)(Proteobacteria)是大鼠糞便中主要的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。老年大鼠與年輕大鼠的擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和放線菌門(mén)存在顯著差異;在屬水平,與年輕鼠相比,老年鼠Bulleidia、Collinsella、Lactobacillus、Treponema、Allobaculum、Ruminococcus、Parabacteroides水平增加,而Prevotella、Bacteroides、Sutterella、Phascolarctobacterium、Bilophila水平降低。(3)糞菌移植(FMT)改變了大鼠腸道菌群。將老年大鼠的腸道菌群移植給年輕大鼠,年輕大鼠的腸道菌群呈現(xiàn)“老年化”的特征,包括FMT組大鼠Shannon指數(shù)降低,多樣性降低;門(mén)水平,FMT組大鼠擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)減少、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)增加;屬水平,FMT組大鼠Prevotella,Bacteroide,Parabacteroides,Corynebacterium,Catenibacterium,paludibacter水平降低,Adlercreutia增加,與老年大鼠接近。(4)FMT在改變年輕大鼠腸道菌群的同時(shí),改變了年輕大鼠認(rèn)知功能。在DMTP任務(wù)中,當(dāng)延遲間隔為18 s、24 s時(shí),NFMT組大鼠的正確壓桿率分別為82.89%±3.86%、77.11%±6.35%,而FMT組大鼠的正確壓桿率明顯減少分別為58.00%±5.88%、50.55%±3.88%(p<0.05);在Y迷宮,NFMT組大鼠探索新臂次數(shù)占總探索次數(shù)的比率為0.45±0.02,而FMT組探索新異臂的次數(shù)比率明顯減少,為0.34±0.02(p<0.01);NFMT組大鼠探索新臂的時(shí)間占總探索時(shí)間的比率為0.44±0.04,而FMT組探索新臂的時(shí)間比率減少為0.32±0.04(p<0.05);同時(shí),rs-fMRI發(fā)現(xiàn)FMT引起海馬與其他腦區(qū)功能連接發(fā)生改變;FMT引起突觸結(jié)構(gòu)和樹(shù)突棘改變,包括突觸間隙變寬、突觸后致密區(qū)變薄、突觸界面曲率變小、樹(shù)突分支減少、樹(shù)突棘密度減小;FMT引起某些重要的信號(hào)分子如BDNF、NR1及突觸素表達(dá)減少。表明腸道菌群在正常腦老化認(rèn)知功能減退中發(fā)揮作用。(5)氧化應(yīng)激可能是FMT引起腦老化認(rèn)知功能減退的重要機(jī)制。與年輕大鼠相比,老年大鼠海馬和內(nèi)側(cè)前額葉MDA含量增加、SOD活性下降;通過(guò)菌群移植,具有“老年”腸道菌群特征的年輕大鼠海馬和內(nèi)側(cè)前額葉MDA含量也增加、SOD活性也下降;表明在正常老化過(guò)程中,腸道菌群可能通過(guò)增加氧化損傷和抑制抗氧化酶SOD活性引起腦老化認(rèn)知功能減退。結(jié)論:(1)隨月齡增加,老年大鼠出現(xiàn)認(rèn)知功能減退,突觸結(jié)構(gòu)改變及重要信號(hào)分子NMDAR1、BDNF、突觸素表達(dá)水平降低;同時(shí)腸道菌群也發(fā)生改變;(2)通過(guò)糞菌移植(FMT)將老年大鼠的腸道菌群移植給年輕大鼠,FMT在改變年輕大鼠腸道菌群的同時(shí),年輕大鼠出現(xiàn)認(rèn)知功能減退,突觸結(jié)構(gòu)改變及重要信號(hào)分子NMDAR1、BDNF、突觸素表達(dá)水平降低等一系列老年大鼠的特征。表明在腦老化認(rèn)知功能減退中,腸道菌群的改變發(fā)揮了重要作用;(3)腸道微生態(tài)可能通過(guò)影響氧化應(yīng)激在腦老化認(rèn)知功能減退中發(fā)揮作用。

【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019