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采用泡沫分離技術(shù)從茶多酚廢液中提取茶氨酸的工藝的制作方法

來源：泰然健康網(wǎng) 時間：2024年12月08日 20:12

本發(fā)明涉及一種提取茶氨酸工藝，特別涉及一種采用泡沫分離技術(shù)從茶多酚廢液中提取茶氨酸的工藝。

背景技術(shù)：

茶氨酸(l.theanine)是一種手性非蛋白質(zhì)氨基酸，是1950年日本學(xué)者酒戶彌二郎在研究玉露茶鮮爽滋味成分的過程中發(fā)現(xiàn)的，占茶葉干重的l％-2％，占茶葉中游離氨基酸總量酌40％-70％，被稱為“天然鎮(zhèn)靜劑”。茶氨酸在醫(yī)學(xué)上用于抗腫瘤輔助藥物，抗糖尿病，調(diào)節(jié)情緒和降血壓，減輕酒精對肝臟的傷害。茶氨酸在食品行業(yè)用作功能性、風(fēng)味食品添加劑、茶飲料的品質(zhì)改良劑。茶氨酸還有減肥、抗疲勞、保護心腦血管以及作為凈水劑凈化飲用水和化妝品中的保濕劑等功能。茶氨酸是21世紀(jì)的健康食品。目前茶氨酸的主要制備途徑有：提取分離法、化學(xué)合成法、細(xì)胞組織培養(yǎng)法及微生物發(fā)酵法；提取分離純化的方法主要有：試劑沉淀法、離子交換樹脂法、大孔吸附樹脂法、膜分離法、雙水相萃取、高效液相色譜制備法、結(jié)晶法、泡沫分離技術(shù)。

泡沫分離技術(shù)又被稱為吸附泡沫分離技術(shù)，是以氣泡為載體來分離、濃縮表面活性物質(zhì)的一種技術(shù)。泡沫分離技術(shù)最早應(yīng)用于礦物浮選以及工業(yè)廢水中有用添加劑的回收。70年代才開始將泡沫分離技術(shù)引入生物分離領(lǐng)域，如蛋白質(zhì)及酶的分離純化。在分離過程中不需要添加其他溶劑，只需通入空氣或是其他惰性氣體即可；適合處理稀溶液，而且能夠得到較高的富集比。目前利用泡沫分離技術(shù)提取分離茶氨酸的報道較為少見。利用泡沫分離技術(shù)從茶多酚廢液中提取分離茶氨酸的研究工藝尚未出現(xiàn)報道情況。從茶多酚廢液中進一步提取分離茶氨酸可以實現(xiàn)資源再利用。

研究表明目前，泡沫分離技術(shù)已在金屬制造業(yè)和漁業(yè)中實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。在食品工業(yè)及生化研究中，泡沫分離技術(shù)已被用于蛋白質(zhì)、多糖及其他生物活性物質(zhì)等的分離提取，但多處于實驗室研究階段，泡沫分離氨基酸報道較少。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種采用泡沫分離技術(shù)從茶多酚廢液中提取茶氨酸的工藝，以解決泡沫分離和重結(jié)晶等技術(shù)處理茶葉粗提液獲得茶氨酸的工藝條件中的實際技術(shù)問題。

為了實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明的設(shè)計方案如下：

一種采用泡沫分離技術(shù)從茶多酚廢液中提取茶氨酸的工藝，包括以下步驟：

(1)對茶多酚廢渣浸提，制得含濾渣浸提液；

(2)將步驟(1)制得的含濾渣浸提液進行抽濾，得到浸提液；

(3)向步驟(2)制得的浸提液中加入乙酸乙酯進行萃取，分離后，水相液體備用；

(4)向步驟(3)制得的水相液體中添加十二烷基硫酸鈉進行起泡，接著進行震蕩氣泡離子交換，將茶氨酸置換到泡沫中，收集泡沫；

(5)將步驟(4)收集到的泡沫采用無水乙醇消泡并冷凍結(jié)晶，待去除上清液后，獲得沉降結(jié)晶；

(6)將步驟(5)制得的結(jié)晶離心真空冷凍干燥或鼓風(fēng)干燥，收集干燥后的晶體重結(jié)晶，接著干燥，制得茶氨酸。

進一步地，步驟(1)中對茶多酚廢渣浸提的條件：浸提溫度為恒溫水浴80-100℃，料液比為1:10-30，浸提時間為30-60min。

進一步地，步驟(4)中所述十二烷基硫酸鈉的添加量為1-2g。

進一步地，步驟(4)中震蕩的條件：在恒溫水浴振蕩器中震蕩氣泡，水浴溫度為25-30℃，震蕩頻率180r/min。

進一步地，步驟(4)中氣泡離子交換時間為20-40min。

進一步地，所述氣泡離子交換時間為30-35min。

進一步地，步驟(5)中無水乙醇的質(zhì)量濃度為95％，無水乙醇的加入量為泡沫溶液體積的2-4倍。

進一步地，步驟(5)中冷凍結(jié)晶的條件：在0-5℃下冷凍24h結(jié)晶。

進一步地，步驟(6)中離心的速率為8000rpm，冷凍干燥是在60℃下進行的，鼓風(fēng)干燥是在95℃下進行的。

進一步地，步驟(6)中收集干燥后的晶體重結(jié)晶的方法如下：取干燥后的晶體用蒸餾水配成20％的溶液，再加入3-4倍體積的無水乙醇，在常溫下振蕩混勻后，靜置1-2h，用離心率為8000rpm離心機離心去除產(chǎn)生的沉淀，離心清液60℃減壓濃縮為80％的溶液，冷卻后加4倍體積的無水乙醇，0℃下冷藏24h，產(chǎn)生結(jié)晶狀物質(zhì)，在4℃和離心速率為8000rpm下離心得類白色固體，將所得固體用熱水溶解，同上述方法重結(jié)晶3次。

通過本技術(shù)方案，可以實現(xiàn)以下效果：

(1)本發(fā)明利用添加十二烷基硫酸鈉在液體中震蕩起泡，吸附液體中的茶氨酸等物質(zhì)，使之實現(xiàn)固液分離；通過進一步的研究，從眾多表面活性物中篩選出了合適本發(fā)明工藝的表面活性物——十二烷基硫酸鈉，已達到了較好的分離效果，解決了泡沫分離和重結(jié)晶等技術(shù)處理茶葉粗提液獲得茶氨酸的工藝條件中的關(guān)鍵問題。

(2)本發(fā)明從廢液廢渣中提取出茶氨酸，為后面研究茶氨酸提供一種新的技術(shù)方法參考；同時利用泡沫分離技術(shù)對茶多酚廢液中的茶氨酸物質(zhì)進一步回收，提高了經(jīng)濟效益。

【附圖說明】

圖1是茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；

圖2是不同濃度十二烷基硫酸鈉對茶氨酸提取率的影響圖；

圖3是不同起泡時間對茶氨酸提取的影響圖；

圖4是不同料液比對茶氨酸提取的影響圖；

圖5是不同的浸提溫度對茶氨酸提取的影響圖；

圖6是茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品高效液相色譜圖；

圖7是樣品中茶氨酸高效液相色譜圖。

【具體實施方式】

1材料與方法

1.1試劑與材料

茶多酚廢渣：茶葉賀州昭平綠茶，賀州學(xué)院食品與生物工程學(xué)院有機化學(xué)實驗室。

標(biāo)準(zhǔn)樣品：純度99％以上的茶氨酸，采購于北京索萊寶科技有限公司。

添加劑：十二烷基硫酸鈉。

所用試劑如：無水乙醇；乙酸乙酯，乙酸，甲醇，茚三酮，丙酮；諾無特別說明均為分析純ar。

1.2主要設(shè)備

高效液相色譜儀(株式會社島津制作所，日本)；dhg-9240a型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進醫(yī)療器械有限公司)；ar224cn型電子分析天平(上海舜宇科學(xué)儀器有限公司)；jj500型電子天平(江蘇常熟徐市)；hh-s4型恒溫水浴鍋(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；shz-d(ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限公司)；fz102型粉碎機(河北省黃馬華市新興電器廠)；zwy110x30恒溫水浴震蕩器；fz102型粉碎機(河北省黃馬華市新興電器廠)h1850r臺式高速冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)。

1.3茶氨酸提取率測定方法

1.3.1茶氨酸的提取工藝流程

茶多酚廢渣→浸提→抽濾→浸提液→乙酸乙酯萃取→水相→添加表面活性物→起泡→收集泡沫→消泡→無水乙醇沉淀(0-5℃24h)結(jié)晶沉降→去除上清液→離心真空冷凍干燥或鼓風(fēng)干燥→茶氨酸→分析檢測。

所述茶氨酸的提取工藝，包括以下步驟：

(1)對茶多酚廢渣浸提，浸提的條件：浸提溫度為恒溫水浴80-100℃，料液比為1:10-30，浸提時間為30-60min，制得含濾渣浸提液；

(2)將步驟(1)制得的含濾渣浸提液進行抽濾，得到浸提液；

(3)向步驟(2)制得的浸提液中加入乙酸乙酯進行萃取，分離后，水相液體備用；

(4)向步驟(3)制得的水相液體中添加十二烷基硫酸鈉進行起泡，添加量為1-2g，接著進行震蕩氣泡離子交換，震蕩的條件：在恒溫水浴振蕩器中震蕩氣泡，水浴溫度為25-30℃，震蕩頻率180r/min，氣泡離子交換時間為20-40min，將茶氨酸置換到泡沫中，收集泡沫；

(5)將步驟(4)收集到的泡沫采用質(zhì)量濃度為95％的無水乙醇消泡并冷凍結(jié)晶，無水乙醇的加入量為泡沫溶液體積的2-4倍，冷凍結(jié)晶的條件：在0-5℃下冷凍24h結(jié)晶，待去除上清液后，獲得沉降結(jié)晶；

(6)將步驟(5)制得的結(jié)晶離心真空冷凍干燥或鼓風(fēng)干燥，離心的速率為8000rpm，冷凍干燥是在60℃下進行的，鼓風(fēng)干燥是在95℃下進行的，取干燥后的晶體用蒸餾水配成20％的溶液，再加入3-4倍體積的無水乙醇，在常溫下振蕩混勻后，靜置1-2h，用離心率為8000rpm離心機離心去除產(chǎn)生的沉淀，離心清液60℃減壓濃縮為80％的溶液，冷卻后加4倍體積的無水乙醇，0℃下冷藏24h，產(chǎn)生結(jié)晶狀物質(zhì)，在4℃和離心速率為8000rpm下離心得類白色固體，將所得固體用熱水溶解，同上述方法重結(jié)晶3次，接著干燥，制得茶氨酸。

1.3.2茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別準(zhǔn)確吸取茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1mg/ml)0.0、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5ml，用水定容至10ml，此標(biāo)準(zhǔn)系列的濃度為0.0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.15、0.20mg/ml的茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，進樣分析，用峰面積對濃度進行線性回歸，表明在給定的濃度范圍內(nèi)茶氨酸檢測呈線性，如圖1所示，回歸方程為y＝32321x+589825，(y為峰面積，x為濃度，μg/ml)：線性相關(guān)系數(shù)r2＝0.9995。

1.3.3茶氨酸總量的測定

準(zhǔn)確稱量10.0000g茶多酚廢渣，固定液料比為1:20ml/g，水浴加熱時間45min，水浴浸提溫度為80℃，將浸提液冷卻后抽濾，將抽濾后的提取液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入相同體積的乙酸乙酯，充分混勻靜置直到分層完畢，取下相液體，將相提取液濃縮到100ml；添加十二烷基硫酸鈉1.5g，起泡30min，收集泡沫，消泡，加入2-3體積乙醇重結(jié)晶，計算重量，加入離子水溶解定容到100ml，第一次待測液取2.0ml加入10ml容量瓶中，利用高相液相色譜儀進行測定，第二次、第三次待測液取5.0ml進行測定，每次平行測定三次，取其平均值，計算每次測得的茶氨酸含量，把幾次測得的茶氨酸含量總和加起來作為茶多酚廢渣中茶氨酸的總量。濾液中茶氨酸含量的計算公式為：

式中:

m—待測液中茶氨酸含量(mg/g)；

c—待測液溶液濃度(μg/ml)；

v—提取液體積(ml)；

v1—定容體積(ml)；

w—樣品的干重(g)。

1.3.4茶氨酸提取率的測定

準(zhǔn)確稱量10.0000g茶多酚廢渣，固定液料比為1:20ml/g，水浴加熱時間45min，水浴浸提溫度為80℃，得到茶濃縮液。將浸提液冷卻后抽濾，將抽濾后的提取液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入相同體積的乙酸乙酯，充分混勻靜置直到分層完畢，取水相脫除有機溶劑后制得茶浸提液，備用。將獲得的水相置于250ml錐形瓶中，添加入十二烷基硫酸鈉1.5g，攪拌均勻，再將其混勻轉(zhuǎn)至恒溫水浴振蕩器(180r/min,25℃)中進行震蕩起泡，30min后收集泡沫，進行消泡處理，再用95％乙醇沉淀(0-5℃冷藏24h重結(jié)晶)，去除上清液，8000rpm離心，收集晶體，將所得晶體在60℃下進行真空干燥或者95℃鼓風(fēng)干燥，得到茶氨酸樣品，加入水將其溶解并定容至25ml容量瓶中，過膜利用高效液相色譜儀檢測其吸收值，計算濃度與產(chǎn)率。

式中：

x—樣品中茶氨酸的提取率(％)；

m—待測液中茶氨酸含量(mg/g)；

m—樣品中茶氨酸的總量(mg/g)。

1.4單因素對茶氨酸提取率影響試驗方法

以十二烷基硫酸鈉添加量、起泡時間、料液比、浸提時間；4個因素為自變量，茶氨酸提取率為考察指標(biāo)，通過固定其他3個因素，改變某一因素的取值，平行重復(fù)測定三次，確定相關(guān)因素的影響，并為后續(xù)正交試驗設(shè)計提供各個因素的取值范圍，本研究水浴溫度為80℃，震蕩氣泡條件為(180r/min，25℃)。

1.4.1單因素試驗考察不同十二烷基硫酸鈉添加量對茶氨酸提取率的影響

取十二烷基硫酸鈉添加量為1g、1.25g、1.5g、1.75g、2g；固定起泡時間30min，料液比1:20，浸提時間45min；進行提取實驗，考察不同濃度十二烷基硫酸鈉對茶氨酸提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，茶氨酸提取率隨著十二烷基硫酸鈉的增大而增大，當(dāng)?shù)竭_一定比例后，茶氨酸提取率曲線呈現(xiàn)緩慢下降。這是因為十二烷基硫酸鈉的上升在一定程度上提高了傳質(zhì)推動力，起泡置換效果更佳；而十二烷基硫酸鈉超過1.75g后，不僅會有一部分雜質(zhì)也被提取出來，也造成茶氨酸的提取率下降，所以曲線呈下降現(xiàn)象。故選擇十二烷基硫酸鈉1.75g最適宜。

1.4.2單因素試驗考察不同起泡時間對茶氨酸提取率的影響

取起泡時間為20min、25min、30min、35min、40min；固定十二烷基硫酸鈉添加量為1.5g，料液比1:20，浸提時間45min；進行提取實驗，考察不同起泡時間對茶氨酸提取的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，茶氨酸提取率隨著起泡時間的增大而增大，當(dāng)?shù)竭_一定值后，茶氨酸提取率曲線呈現(xiàn)快速下降。這是因為起泡時間的上升在一定程度上提高了對茶氨酸分子的置換能力，而十二烷基硫酸鈉超過35min后，不僅會有一部分雜質(zhì)也被提取出來，而且會影響茶氨酸在泡沫的存在，被其他物質(zhì)置換出來，造成茶氨酸的提取率下降，所以曲線呈下降現(xiàn)象。故選擇起泡時間為35min最適宜。1.4.3單因素試驗考察不同料液比對茶氨酸提取的影響

取料液比為1:10、1:15、1:20、1:25、1:30；固定十二烷基硫酸鈉添加量為1.5g，浸提時間45min，起泡時間30min；進行提取實驗，考察不同料液比對茶氨酸提取的影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，茶氨酸提取率隨著料液比的增大而增大，當(dāng)?shù)竭_一定值后，茶氨酸提取率曲線呈現(xiàn)緩慢下降。這是因為料液比的上升在一定程度上提高了傳質(zhì)推動力，而料液比超過1:20之后，不僅會有一部分雜質(zhì)也被提取出來，溶液中物質(zhì)提取增加，會造成部分被提取出來的茶氨酸損耗，造成茶氨酸的提取率下降，所以曲線呈下降現(xiàn)象。故選擇料液比1:20最適宜。

1.4.4單因素試驗考察不同浸提時間對茶氨酸提取的影響

取起浸提時間為30min、37.5min、45min、52.5min、60min；固定十二烷基硫酸鈉添加量1.5g，起泡時間30min，料液比1:20；進行提取實驗，考察不同的浸提溫度對茶氨酸提取的影響，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，在52.5min以下茶氨酸的提取率隨著溫度的升高而增大，說明在一定的范圍內(nèi)升高溫度有利于茶氨酸的溶出，這是因為溫度升高，茶氨酸溶出速率加快，52.5min后曲線趨于下降。這是因為提取時間過久，氨基酸容易產(chǎn)生變性，目標(biāo)產(chǎn)物有損耗，因此選擇浸提溫度52.5℃最適宜。

1.5茶氨酸提取工藝條件優(yōu)化試驗方法

茶氨酸提取工藝條件優(yōu)化試驗方法采用正交分析法。

1.5.1正交分析試驗設(shè)計

從單因素試驗中確定對茶氨酸提取率影響最大的主次因素，選定其中3個因素的零水平與波動區(qū)，以茶氨酸提取率為考察指標(biāo)，得出最佳提取工藝條件。1.5.2茶氨酸提取最佳工藝條件驗證

通過正交試驗分析法優(yōu)化得到最佳提取工藝條件，結(jié)合實際，運用最佳工藝條件進行提取驗證試驗，平行測定三次。

2試驗結(jié)果與分析

2.1茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程

按照1.3.2試驗方法繪制茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線見圖1。

由圖1可知，得到茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和相關(guān)系數(shù)為:

y＝32321x+589825；r2＝0.9995

式中：

y—峰面積；

x—標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(mg/ml)。

2.2茶多酚廢渣中茶氨酸總量的測定結(jié)果

根據(jù)1.3.2中的試驗操作，利用高效液相色譜儀，計算每次測得待測液中的茶氨酸濃度，得出茶氨酸含量，把三次測得的茶氨酸含量總和加起來取平均值作為樣品中單寧的總量。茶氨酸的總量m(mg/g)＝(m1+m2+m3)/3；

2.3單因素試驗結(jié)果

由單因素實驗結(jié)果可知，十二烷基硫酸鈉1.75g，起泡時間35min，料液比1：20，浸提溫度52.5min，有最高值，故在此條件較為適宜。

2.4正交試驗分析

2.4.1正交試驗因素水平

根據(jù)單因素試驗結(jié)果可知，對一定量的茶多酚廢渣進行提取實驗，采取3個不同的十二烷基硫酸鈉添加量(1.5、17.5、2g)；三個不同的料液比(1：20、1：25、1:30/ml)和三個不同的浸提時間(37.5、45、52.5min)，用三因素三水平正交試驗進行茶氨酸提取優(yōu)化試驗，以十二烷基硫酸鈉添加量、液料比、浸提時間三個因素作為變量，以茶氨酸的提取率作為考察指標(biāo)。

表1試驗因素與水平

2.4.2試驗方案

正交試驗方案詳見表2

表2正交試驗方案

由正交試驗分析可知，當(dāng)提取條件為a1b2c2時，即十二烷基硫酸鈉添加量為1.5g，料液比為1:25，浸提時間為45min時，在高效液相色譜儀中會有最大吸收峰值出現(xiàn)，結(jié)合線性回歸方程可知茶氨酸的提取量和提取率都是最大的，提取率達到67.91％，純度為73.51％。

3各項檢測條件確定

3.1高效液相色譜最佳洗脫條確定

按照1.3.2節(jié)方法進行測定實驗，最終確定的分離最好流動相條件，離子水：甲醇＝1：0.75(v/v)，液相甲醇濃度為75％，流速為1ul/min，柱溫40℃，峰時間12.5min左右，檢測波長254nm。

3.2樣品實測情況

由圖2顯示，茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品經(jīng)衍生后測定，標(biāo)準(zhǔn)樣品在12:30-13:00min之間有最大吸收峰值，經(jīng)檢測待測樣品在12:749min有最大吸收峰值；圖3樣品中茶氨酸的測定顯示高效液相色譜圖，茶氨酸衍生物出峰前后無其他氨基酸衍生物干擾，此方法可用作茶氨酸準(zhǔn)確定性及定量的測定方法。

利用正交優(yōu)化試驗，無水乙醇重結(jié)晶三次以上，進一步純化可得純度達到89.42％的茶氨酸樣品。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明的技術(shù)范圍作任何限制，故但凡依本發(fā)明的權(quán)利要求和說明書所做的變化或修飾，皆應(yīng)屬于本發(fā)明專利涵蓋的范圍之內(nèi)。

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