人參果莖尖脫毒培養(yǎng); 人參果( Solanum muricatum Ait )是近年來國內(nèi)引進(jìn)和推廣種植的新型果蔬作物,其營養(yǎng)保健價(jià)值高于一般果蔬。人參果主要通過扦插繁殖,體內(nèi)病毒感染嚴(yán)重,并逐代積累, 嚴(yán)重影響其生長發(fā)育以及產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量。通過莖尖培養(yǎng)進(jìn)行種苗脫毒和快速繁殖是生產(chǎn)無病毒種苗的有效途徑。有關(guān)人參果組織培養(yǎng)方面的研究已有多篇報(bào)道,但脫毒培養(yǎng)方面的研究較少。本研究采用不同的處理方法進(jìn)行莖尖脫毒培養(yǎng), 以期為人參果脫毒苗的工廠化生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。;實(shí)驗(yàn)方法 無菌苗培養(yǎng)：選取生長健壯、無病蟲的健康植株，外植體（莖尖、莖段） 在無菌條件下用75%酒精浸泡1 min，再用5%次氯酸鈉溶液浸泡15 min，無菌水沖洗5～6 次，然后用無菌濾紙吸干，于解剖鏡下剝?nèi)?.2 mm 莖尖，接種于附加白糖3%，瓊脂0.7%，pH 值5.8 的基本培養(yǎng)基上初代培養(yǎng)。為降低污染，每個(gè)培養(yǎng)基均接種1個(gè)莖尖。 生長分化培養(yǎng)基篩選 以MS 培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基, 分別加入1.0 mg·L-1 6-BA 以及0、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 mg·L-1NAA, 以選出最適NAA濃度。之后以最適濃度NAA與0、1.0、2.0和3.0mg·L-1 6-BA 組合, 篩選出人參果生長分化的最佳激素配比。 在MS 培養(yǎng)基中, 添加不同濃度NAA, 促使頂芽快速伸長, 以利于莖尖的剝離和切取。NAA 實(shí)驗(yàn)濃度為0、0.05、0.10、0.50、1.00 和2.00 mg·L-1。; 莖尖剝離、接種和培養(yǎng) 取伸長最快的試管苗莖尖,在XTX-2型體視顯微鏡下切取0.2mm 莖尖,接種于下列培養(yǎng)基上,比較其生長分化質(zhì)量。A1: MS+0.1mg·L-1NAA+2.0mg·L-1 6-BA;A2:MS+0.2mg·L-1 NAA+2.0mg·L-1 6-BA;A3:MS+0.2mg·L-1NAA+4.0mg·L-1 6-BA;A4:MS+0.4mg·L-1NAA+4.0mg·L-16-BA。 壯苗快繁培養(yǎng)基篩選 在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選用MS+0.5mg·L-1NAA培養(yǎng)基, 分別加入0、0.01、0.05、0.10、0.20和0.30mg·L-1PP333,篩選有利于壯苗快繁的最佳培養(yǎng)基。 病毒檢測 在繼代培養(yǎng)的試管苗中隨機(jī)抽取5瓶,利用生物學(xué)和電子顯微鏡方法觀察脫毒狀況。生物學(xué)測定方法:將人參果組培苗取出沖洗干凈后,研成汁液,分別接種,鑒別寄主10種,置隔離溫室中觀察癥狀反應(yīng)。電子顯微鏡觀察是將鋪有福爾馬膜的銅網(wǎng),用直粘法制片,觀察病毒的粒體形態(tài)。同時(shí)取未脫毒培養(yǎng)的植株做同樣檢測。實(shí)驗(yàn)由國家出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢疫實(shí)驗(yàn)所進(jìn)行。;結(jié)果和分析;莖尖大小對存活率和分化的影響 植物脫毒苗組織培養(yǎng)的關(guān)鍵是莖尖的切取,只有頂端分生組織及其下部尚未分化維管組織的芽尖未受病毒感染,因此,芽尖切取應(yīng)不超過0.2~0.3mm。莖尖愈大,愈易成活,但去病毒的概率降低;莖尖太小不易成活, 或只有愈傷組織的增殖,不易分化。本研究共接種48個(gè)莖尖,存活28個(gè),成活率58%。其中有4 瓶生長較慢,只有愈傷組織的增殖,無芽的分化;另有3瓶莖尖切取過大(0.4mm),很快直接發(fā)芽、生根,并長成完整植株。 NAA對人參果莖尖伸長的作用 植物的莖尖被葉原基所包被,不易切取,因此,在取材之前通常用35℃的溫度促使芽莖尖迅速伸長,然后再切取莖尖。本實(shí)驗(yàn)則根據(jù)適宜濃度的生長素類物質(zhì)可促進(jìn)細(xì)胞縱向快速伸長的理論,通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中NAA濃度來選取有利于人參果莖尖快速伸長和剝離的培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。;表1 培養(yǎng)基中不同濃度NAA 對人參果莖尖生長狀況的影響 適宜濃度的NAA有利于莖尖的生長和不定根的產(chǎn)生,其中0.5mg·L-1 NAA 既促進(jìn)莖的快速伸長,又利于根的發(fā)生。濃度過高,對伸長生長有抑制作用,并易使莖段基部脫分化形成灰色愈傷組織,甚至使某些莖段的腋芽不能萌發(fā)并發(fā)生褐化而死亡。用MS+NAA0.5mg·L-1 培養(yǎng)的莖尖,與在35~38℃條件下不加任何生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)的組培苗作比較,其莖尖形態(tài)特征相似,均較易剝離、切取和培養(yǎng),但前者操作簡便易行。; 6-BA和NAA對莖尖形成愈傷組織及其分化的影響 培養(yǎng)基中6-BA和NAA的相對含量和絕對含量直接影響著莖尖愈傷組織的形成和分化。由表2結(jié)果可以看出,當(dāng)培養(yǎng)基中6-BA 濃度為2.0mg·L-1,NAA濃度為0.2mg·L-1時(shí),愈傷組織的增殖速度較快,組織塊緊密,分化特征及組織塊生長狀

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