摘要：【目的】 探討渥堆過程中四川黑茶品質(zhì)成分及主要酶類活性的變化規(guī)律.【方法】 采用國家標(biāo)準(zhǔn)測定方法和常用測定方法對四川黑茶渥堆過程中品質(zhì)成分含量和酶類活性進(jìn)行全程監(jiān)測.【結(jié)果和結(jié)論】 除咖啡堿含量變化不明顯外，茶多酚、兒茶素、茶黃素、茶紅素、茶褐素、纖維素、原果膠、蛋白質(zhì)、氨基酸、水溶性果膠、可溶性糖含量均在渥堆工藝中下降，其含量降幅分別為69.2%、43.7%、79.3%、81.7%、52.4%、9.6%、60.0%、62.3%、66.2%、32.2%和37.2%.多酚氧化酶、過氧化物酶活性分別在渥堆的第19和12天達(dá)到峰值，纖維素酶、果膠酶活性在渥堆的第17天達(dá)到峰值，相較于剛扎堆時(shí)，其酶活性分別提高了246%、371%、371%和223%.四川黑茶渥堆過程中主要品質(zhì)成分及酶類活性復(fù)雜的變化，促成了其相關(guān)品質(zhì)特征的形成.

Variations in quality ingredients and primary enzymes activities of Sichuan dark tea during post-fermentation

Abstract: 【Objective】 The purpose of this study was to investigate the changes in quality ingredients and primary enzyme activities of Sichuan dark tea during post-fermentation.【Method】 The quality ingredients and primary enzyme activities of Sichuan dark tea were monitored during the entire post-fermentation using national standard measuring methods and some common measuring methods.【Result and conclusion】 The results showed that except for caffeine, the contents of polyphenols, catechins, theaflavins, thearubigins, theabrowns, cellulase, pectin, protein, amino acid, soluble pectin, and soluble sugar declined by 69.2%, 43.7%, 79.3%, 81.7%, 52.4%, 9.6%, 60.0%, 62.3%, 66.2%, 32.2%, and 37.2%, respectively, in the process of post-fermentation.The activities of polyphenol oxidase, peroxidase, cellulase and pectinase increased to the maximum on the 19th, 12th, 17th and 17th day of postfe rmentation process, respectively, and they increased by 246%, 371%, 371% and 223%, respectively, compared with the beginning of post-fermentation.The variation of the quality ingredients and primary enzymes of Sichuan dark tea during post-fermentation is complex, which contributes to the formation of quality characteristics of Sichuan dark tea.

邊疆少數(shù)民族同胞在日常生活中寧可三日無糧，不可一日無茶[1]，黑茶具有降脂減肥，消除油膩的功效[2-5]，可以消除少數(shù)民族因特殊飲食習(xí)慣帶來的健康威脅.四川黑茶具有悠久的加工歷史，其降脂、減肥功效已被科學(xué)試驗(yàn)證實(shí)[6]，其品質(zhì)的高低直接影響著藏民的生活.

渥堆被認(rèn)為是黑茶制作的關(guān)鍵工藝，實(shí)則為特殊的發(fā)酵過程，黑茶品質(zhì)風(fēng)格的形成依賴于此階段茶葉中各種生化成分的轉(zhuǎn)化[7-8].對四川黑茶渥堆過程中主要品質(zhì)成分及酶類活性變化的研究旨在進(jìn)一步認(rèn)識其品質(zhì)風(fēng)味形成的實(shí)質(zhì)，同時(shí)探明此過程中主要酶類對品質(zhì)成分轉(zhuǎn)化的具體作用，對于改進(jìn)四川黑茶的生產(chǎn)工藝，提高其品質(zhì)，保證藏族人民的飲茶質(zhì)量具有重要意義.

1 材料與方法 1.1 材料與儀器

四川黑茶樣品，由四川雅安茶廠提供，其制茶原料為二級毛茶(條茶); 電子天平QUINTIX224-1CN，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司產(chǎn)品; 電子恒溫水浴鍋HH-S，鄭州長城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品; 紫外可見分光光度計(jì)UV-2450PC，日本島津公司產(chǎn)品.

1.2 試驗(yàn)方法 1.2.1 樣品采集

在四川黑茶渥堆的不同時(shí)期(其中，渥堆第5天進(jìn)行1翻，第13天進(jìn)行2翻，第24天出堆)，采用5點(diǎn)取樣法，取距堆表50 cm處的茶樣，設(shè)3個(gè)重復(fù)，取樣后立即用冰盒保存樣品并帶回實(shí)驗(yàn)室，供理化分析.所采樣品位于的堆層的具體溫、濕度條件:扎堆時(shí)該堆層茶坯溫度高至85 ℃，相對濕度高達(dá)100%，茶葉含水量高達(dá)37%.渥堆期間該堆層的溫度始終保持在45~71 ℃，茶葉含水量(w)保持在15%~35%.

1.2.2 相關(guān)理化指標(biāo)測定

水分含量、咖啡堿及茶多酚含量測定采用國標(biāo)法[9-11].兒茶素、茶黃素、茶紅素、茶褐素、蛋白質(zhì)、氨基酸含量測定按黃意歡[12]方法進(jìn)行.可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法[13].纖維素、原果膠、水溶性果膠含量測定按鐘蘿[14]方法進(jìn)行.多酚氧化酶、纖維素酶和果膠酶活性測定按郝瑞雪等[15]方法進(jìn)行.過氧化物酶活性測定按齊蘭蘭[16]方法進(jìn)行.以上各酶活性測定時(shí)，將其在一定溫度和pH條件下，單位時(shí)間內(nèi)使底物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)產(chǎn)物所需要的酶量定義為1個(gè)酶活性單位(U).

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析.

2 結(jié)果與分析 2.1 四川黑茶渥堆過程中茶多酚及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量的變化

四川黑茶渥堆過程中茶多酚、兒茶素以及茶黃素、茶紅素和茶褐素含量見圖 1，在整個(gè)渥堆過程中，茶多酚、兒茶素均總體呈現(xiàn)下降趨勢，其中茶多酚下降趨勢較為明顯，其含量降幅達(dá)69.2%，兒茶素則下降了43.7%.由此可見，茶多酚含量的變化主要體現(xiàn)在兒茶素類物質(zhì)含量的降低，這與齊桂年等[17]相關(guān)研究結(jié)果一致.而茶多酚含量的降低則主要?dú)w因于渥堆過程中茶多酚的酶促和非酶促氧化、聚合及轉(zhuǎn)化等系列反應(yīng)[18-20].值得注意的是，茶紅素、茶褐素在整個(gè)渥堆工藝完成后并未得到積累，茶紅素、茶褐素在渥堆過程中，因上一級多酚類物質(zhì)氧化產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，其含量在短期內(nèi)有所增加，而后其又轉(zhuǎn)化為下一級的氧化產(chǎn)物，其含量有所減少，出現(xiàn)時(shí)增時(shí)減的變化情況，到出堆時(shí)，相較于扎堆時(shí)其含量降幅分別達(dá)到了81.7%和52.4%，這與齊蘭蘭[16]的研究結(jié)果不一致.茶黃素在渥堆7 d后雖有所積累，但在出堆時(shí)其含量降至整個(gè)渥堆過程的最低水平，其含量降幅為79.3%.在黑茶渥堆過程中，部分多酚類物質(zhì)主要在多酚氧化酶的作用下氧化、聚合為茶黃素，茶黃素進(jìn)而與雙黃烷醇偶聯(lián)氧化形成茶紅素，最終促使茶褐素的形成[21].可見，茶黃素、茶紅素在整個(gè)渥堆過程中含量的降低主要為茶褐素的形成提供了前提，而茶褐素并未得到積累的原因還有待深究.色素指數(shù)(即茶黃素含量和茶紅素含量之和與茶褐素含量的比值)反應(yīng)了茶湯的顏色和明亮度，當(dāng)色素指數(shù)較大時(shí)，茶湯較紅亮，反之，呈暗褐色.在整個(gè)渥堆過程中色素指數(shù)出現(xiàn)了比較大的幾次波動，其變化規(guī)律與茶黃素、茶紅素的變化呈現(xiàn)較大的一致性.在黑茶出堆時(shí)，色數(shù)指數(shù)降至整個(gè)渥堆過程的最低水平，其降幅為61.3%，這些變化可能是四川黑茶除品種原因外湯色呈橙紅色而非紅褐色的原因.

圖 1 四川黑茶渥堆過程中茶多酚及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量的變化 Figure 1 Variations in polyphenol and the transformation product contents of Sichuan dark tea during post-fermentation

2.2 四川黑茶渥堆過程中咖啡堿、蛋白質(zhì)、大分子糖類物質(zhì)及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量的變化

在整個(gè)渥堆過程中，咖啡堿含量變化不大，出堆時(shí)相較于扎堆時(shí)只下降了3.13%，這與咖啡堿本身性質(zhì)比較穩(wěn)定有很大關(guān)系.纖維素、原果膠、蛋白質(zhì)含量在扎堆時(shí)最高，在渥堆過程中呈下降趨勢，至出堆時(shí)，其含量分別下降了9.6%、60.0%和62.3%.這與纖維素酶、果膠酶的酶促作用以及蛋白質(zhì)的水解有著直接的關(guān)系[22].可溶性糖也呈逐步下降的趨勢，其含量降幅為37.2%，水溶性果膠和游離氨基酸的含量在渥堆過程中由于果膠酶對原果膠的酶促水解及蛋白質(zhì)水解而有所增加，而后又因微生物生長需對其加以利用等因素的影響，其含量有所減少，表現(xiàn)出時(shí)增時(shí)減的變化情況，至出堆時(shí)，其含量較扎堆時(shí)分別下降了32.2%和66.2% (圖 2).由此可見，在渥堆過程中，大分子糖類物質(zhì)和蛋白質(zhì)的降解并沒有使可溶性糖、水溶性果膠和游離氨基酸得到積累.可溶性糖、水溶性果膠沒有得到積累的原因，可能為渥堆后期微生物大量繁殖，將其作為碳源的需求逐漸增加，而可被分解的碳水化合物逐漸減少，同時(shí)，由于可溶性糖還可與氨基酸產(chǎn)生孟拉德反應(yīng)，因此，在渥堆后期可溶性糖和水溶性果膠含量逐漸減少[23-24].在黑茶渥堆過程中的濕熱環(huán)境下，微生物的作用使得蛋白質(zhì)水解生成氨基酸，氨基酸進(jìn)一步通過酶的作用脫羧、脫氨形成芳香物質(zhì)，以及微生物將氨基酸作為其生長所需氮源而利用消耗[25-26]，這些都可能是四川黑茶渥堆過程中蛋白質(zhì)含量減少而氨基酸未得到相應(yīng)積累的原因.

圖 2 四川黑茶渥堆過程中咖啡堿、蛋白質(zhì)、大分子糖類物質(zhì)及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物含量的變化 Figure 2 Variations in caffeine, protein, macromolecular carbohydrates and their transformation product contents of Sichuan dark tea during post-fermentation

2.3 四川黑茶渥堆過程中主要氧化酶類和水解酶類活性的變化

本試驗(yàn)通過對四川黑茶渥堆工藝的全程跟蹤，發(fā)現(xiàn)在堆心處的多酚氧化酶、過氧化物酶、纖維素酶和果膠酶活性隨渥堆進(jìn)程均出現(xiàn)了動態(tài)變化(圖 3).多酚氧化酶活性在渥堆第19天達(dá)到峰值，與剛扎堆時(shí)的酶活性相比，增加了2.46倍，但出堆時(shí)降至整個(gè)渥堆過程的最低水平.過氧化物酶活性在渥堆2翻前(第12天)達(dá)到峰值，相較于剛扎堆時(shí)增加了3.71倍，在臨近出堆時(shí)，該酶活性降至最低.據(jù)有關(guān)研究[27]顯示，渥堆過程中可能產(chǎn)生了與鮮葉中不同的多酚氧化酶同工酶，且該酶具有較高的活性，從而使多酚氧化酶表現(xiàn)出較大的活性變化，但在臨近渥堆結(jié)束時(shí)，由于渥堆溫度的改變以及微生物活動使渥堆茶坯酸堿度發(fā)生變化，多酚氧化酶活性呈降低的趨勢.本文中過氧化物酶活性的變化與黃建安等[27]的研究結(jié)果有所差異，這可能是渥堆過程中微生物復(fù)雜的生理代謝活動所致.纖維素酶和果膠酶活性在渥堆的第17天達(dá)到峰值，分別比剛扎堆時(shí)增加了3.71和2.23倍，1翻后上述2種水解酶的活性一直呈現(xiàn)上升趨勢，特別是在渥堆的后半階段，其酶活性一直處于較高水平，直至21d時(shí)開始大幅下降，由圖 3b明顯看出，這2種酶活性的變化呈雙峰模式，這可能是由于微生物新陳代謝活動的周期性或微生物種群的更迭，從而導(dǎo)致了這2種酶活性的波動性變化，此研究結(jié)果與劉仲華等[28]相關(guān)研究結(jié)果相符.

圖 3 四川黑茶渥堆過程中主要氧化酶類和水解酶類活性的變化 Figure 3 Variations in major oxidase and hydrolase activities of Sichuan dark tea during post-fermentation

3 討論與結(jié)論

四川黑茶渥堆過程中，諸多品質(zhì)成分發(fā)生了深刻的化學(xué)變化，其中，茶多酚和茶褐素含量變化最為明顯，茶多酚含量在渥堆過程中顯著下降，這對于減少茶湯苦澀味，形成四川黑茶滋味醇和等品質(zhì)特征有重要的促進(jìn)作用.茶黃素和茶紅素含量在此過程中呈現(xiàn)下降的趨勢，色素指數(shù)也是下降的，而茶褐素在渥堆完成后并沒有積累增加，這與傳統(tǒng)黑茶渥堆中茶黃素和茶紅素含量減少而茶褐素含量增加有所出入.雖然在渥堆進(jìn)程中多酚氧化酶對茶多酚等多酚類物質(zhì)產(chǎn)生催化作用，使其轉(zhuǎn)化為相應(yīng)產(chǎn)物，最終形成茶褐素，但渥堆中相關(guān)微生物的活動以及濕熱環(huán)境等因素對茶褐素等物質(zhì)的影響也不可忽視.茶褐素的主要組分是多酚類、多糖、蛋白質(zhì)和核酸等[29]，在渥堆這一復(fù)雜環(huán)境中，這些組分也可能發(fā)生了重大的變化，從而導(dǎo)致茶褐素含量的減少.另有研究[30]揭示，茶褐素的形成并不只是通過茶黃素和茶紅素轉(zhuǎn)化而來，還可能有多糖和蛋白質(zhì)的參與，相關(guān)蛋白質(zhì)和多糖含量的減少也會對其造成不利的影響，但本研究中茶褐素含量減少的真正原因還有待深究.

大分子的纖維素、原果膠和蛋白質(zhì)在渥堆過程中含量下降，但其相關(guān)產(chǎn)物可溶性糖、水溶性果膠和游離氨基酸的含量在渥堆完成后并沒有積累增加.在渥堆開始時(shí)，茶葉中就存在氧化酶類和水解酶類的活性，隨著渥堆進(jìn)程的深入，這些酶類的活性也發(fā)生了較大的變化，尤其是纖維素酶和果膠酶，其活性整體呈上升的趨勢，并處于較高水平.纖維素酶、果膠酶能分別將纖維素、原果膠這類大分子糖類物質(zhì)降解為可溶性糖、水溶性果膠這類小分子物質(zhì)，對黑茶“甘滑”、“厚重”的味感具有良好的促進(jìn)作用[31].然而，可溶性糖、水溶性果膠以及游離氨基酸在渥堆完成后并未得到相應(yīng)的積累，這是否與微生物將其用于自身生存以及相關(guān)生化轉(zhuǎn)化有關(guān)尚待進(jìn)一步研究、證實(shí).黑茶渥堆是一個(gè)復(fù)雜的生化過程，相關(guān)動力的催化使得黑茶獨(dú)有品質(zhì)特征形成.由于本研究渋及內(nèi)容有限，黑茶渥堆過程中其它相關(guān)因素對其品質(zhì)形成的影響還有待進(jìn)一步探明.

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