本發(fā)明涉及苗木育種領(lǐng)域，具體涉及一種高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)油茶的快速育種方法。

背景技術(shù)：

狹義上的油茶是指普通油茶（camelliaoleiferaabel.），又名茶子樹、茶油樹、白花茶，是山茶科（theaceae）山茶屬（camellia）的一種，主要形態(tài)特征為小喬木或灌木，花白色，頂生，蒴果，因其種子可榨油（茶油）供食用而得名。而廣義上的油茶是山茶科山茶屬植物中種子含油率較高，且有一定的栽培經(jīng)營面積的樹種的統(tǒng)稱，不僅包括普通油茶，還包括小果油茶、攸縣油茶、廣寧油茶、越南油茶、高州油茶、狹葉油茶、越南油茶、栓殼紅山茶、浙江紅花油茶、南榮油茶、騰沖紅花油茶、金花茶等種類。油茶喜溫暖陽光，怕寒冷，要求年平均氣溫16~18℃，主要分布在我國長江流域及南地區(qū)，此外，在緬甸、越南、馬來西亞及日本等國也有少量的分布。中國是世界上最大的油茶產(chǎn)地，現(xiàn)有的油茶林面積約為400萬hm2，其中湖南、江西、廣西、福建、浙江、廣東等省是我國的油茶主產(chǎn)區(qū)。

油茶與油棕、油橄欖和椰子并稱為世界四大木本油料植物，具有極高的綜合利用價值。首先油茶最重要的作用是榨油，因此油茶的含油率、脂肪酸組成是衡量油茶產(chǎn)量和質(zhì)量的重要指標(biāo)。利用油茶種子榨出的油稱為茶油，茶油是一種優(yōu)質(zhì)的食用油，其營養(yǎng)豐富，富含不飽和脂肪酸和人體必需的微量元素，被譽(yù)為“東方橄欖油”。茶油的不飽和脂肪酸含量達(dá)90%以上，以油酸和亞油酸為主，還含有少量的亞麻酸等高價不飽和脂肪酸，且不含對人體有害的芥酸，深受群眾喜愛。茶油具有較好的保健和醫(yī)用功能，其中油酸可降低血液總膽固醇和有害膽固醇，卻不降低有益膽固醇，營養(yǎng)界把油酸稱為“安全脂肪酸”；亞油酸是人體不能合成但又是必需的不飽和脂肪酸，它是合成前列腺素的主要原料，并具有降低膽固醇和血脂，改善血液流變性及其預(yù)防冠心病等特殊功能；茶油中油酸含量相對穩(wěn)定，亞油酸含量變動幅度較大，因此油酸含量的多少可作為評定茶油品質(zhì)的重要標(biāo)志之一。其次油茶榨油后留下的茶籽粕中含有茶皂素、茶籽多糖、茶籽蛋白等，都是化工、輕工、食品、飼料工業(yè)產(chǎn)品等的原料；第三油茶是一種常綠、長壽樹種，一次種植，收獲期長達(dá)百年以上，一般栽后8-10年郁閉成林，既能增加油源，又可提高森林覆蓋率，具有美化環(huán)境、保持水土、涵養(yǎng)水源、調(diào)節(jié)氣候的生態(tài)功能。

雖然油茶的綜合利用價值很高，但我國的油茶產(chǎn)業(yè)還沒有得到足夠的發(fā)展，其主要原因是油茶普遍產(chǎn)量不高，且產(chǎn)量不穩(wěn)定，無法滿足更大的市場需求。據(jù)統(tǒng)計，我國茶油常年產(chǎn)量約20萬噸，而其中70%的產(chǎn)量來自30%的植株，可見低產(chǎn)劣株所占比例相當(dāng)大。油茶低產(chǎn)的原因有多方面，如傳統(tǒng)上的實生繁殖造成了林分品種混雜、劣株比例大，株產(chǎn)差異大；很多油茶林林分結(jié)構(gòu)不合理，稀密不均；多代同堂，林分衰老，自然更新能力差等，但是最根本原因是油茶遺傳分化嚴(yán)重，種質(zhì)雜亂，良莠不齊，良種水平低。因此為了增加油茶產(chǎn)量、提高油茶品質(zhì)，加速油茶高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品種的育種步伐，提高整體良種化水平，是當(dāng)前油茶生產(chǎn)中的首要任務(wù)。

一直以來，常規(guī)雜交育種在油茶品種育種中擔(dān)負(fù)著重要角色。雜交育種是一種改良植物親本品質(zhì)，創(chuàng)造植物新品種的重要而有效的途徑，通過雜交產(chǎn)生的雜種后代除了可以遺傳雙親的優(yōu)良性狀，還可以引起雜種后代的生物體產(chǎn)生遺傳變異，從而表現(xiàn)出一些新的優(yōu)良性狀，這些新的優(yōu)良性狀往往可以克服或削弱其雜交親本的一些原有的不良性狀。但是，常規(guī)雜交育種存在的一些問題也在一定程度上制約了油茶育種技術(shù)的發(fā)展，例如油茶是木本植物，生育周期長，進(jìn)行新品種育種要花費數(shù)十年的時間；油茶屬于異花授粉植物，一直處于高度雜合狀態(tài)，通過自交手段很難獲得純系，而且育種后代性狀特性復(fù)雜而不穩(wěn)定，植株個體良莠不齊。因此油茶的育種技術(shù)迫切需要進(jìn)行改革。

單倍體育種是現(xiàn)代生物技術(shù)育種手段之一，在育種上可以利用f1代雜交種花藥、花粉或未受精的子房，通過離體培養(yǎng)獲得單倍體材料經(jīng)自然或人工染色體加倍產(chǎn)生雙單倍體，雙單倍體（dh）具有完全純合同質(zhì)的特性并且是標(biāo)準(zhǔn)的自交系，因此通過單倍體育種不僅可以克服雜種性狀的分離縮短育種年限，而且可以快速育種自交系，從而大大加快育種的進(jìn)程。單倍體育種還能為育種選優(yōu)工作帶來便利，單倍體加倍后獲得的雙單倍體植株，可排除雜合體中顯性因子掩蓋隱性因子造成的干擾，植株的表現(xiàn)型和基因型一致，提高了選擇的準(zhǔn)確性和可靠性。如果將單倍體育種技術(shù)與常規(guī)育種手段相結(jié)合，應(yīng)用于油茶的新品種育種中，將具有極大的發(fā)展前景。

花藥離體培養(yǎng)是人工誘導(dǎo)單倍體的最常用手段，也是單倍體育種的物質(zhì)基礎(chǔ)。然而目前國內(nèi)關(guān)于油茶花藥培養(yǎng)的研究不多，并且多數(shù)研究只停留在花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)出愈傷組織，只有隆振雄曾有普通油茶通過花藥培養(yǎng)獲得愈傷組織并形成綠芽點和根的報道，這說明油茶花藥培養(yǎng)在實踐過程中仍然存在諸多問題?；ㄋ幣囵B(yǎng)受到的影響因素很多，主要包括基因型、花藥的發(fā)育階段、預(yù)處理、培養(yǎng)方法及培養(yǎng)條件的影響，目前油茶花藥培養(yǎng)的“瓶頸問題”是如何使愈傷組織分化出完整的再生植株。本發(fā)明團(tuán)隊經(jīng)過多年的研究，初步建立了油茶花藥培養(yǎng)再生體系，并成功獲得了油茶花培再生植株，最終實現(xiàn)了油茶高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)品系的快速育種。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對背景技術(shù)中存在的缺點和不足做出改進(jìn)和創(chuàng)新，提供一種高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)油茶的快速育種方法，該方法大大縮短了油茶良種的育種年限，具有極高的實用價值。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：

一種高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)油茶的快速育種方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

1）育種親本的篩選：根據(jù)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的育種目標(biāo)，篩選出具有較多與育種目標(biāo)一致的優(yōu)良性狀、并且適宜當(dāng)?shù)胤N植的兩個油茶品種/系作為育種親本；

2）將育種親本進(jìn)行雜交，收獲f1代雜交種：在育種親本的花期，采用常規(guī)人工授粉的方法將二者進(jìn)行雜交，次年結(jié)實后收獲f1代雜交種；將f1代雜交種正季種植于大田；

3）f1代雜交種花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)：f1代雜交種生長發(fā)育進(jìn)入初花期時，采集并篩選出小孢子發(fā)育進(jìn)入單核靠邊期的健康花蕾，將花蕾先置于4℃低溫預(yù)處理5~7d，再用冷等離子體處理15~20s，將處理后的花蕾進(jìn)行表面消毒，然后小心剝?nèi)』ㄋ帲ㄇ谐ńz）接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在溫度23~25℃、黑暗的條件下培養(yǎng)40~50d誘導(dǎo)出愈傷組織；

4）愈傷組織分化培養(yǎng)：當(dāng)上述愈傷組織大小長至2~3mm時，及時轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基上，在溫度24~26℃、光照強(qiáng)度1400~1800lx、光照時間10~12h/d的條件下培養(yǎng)55~65d，期間每28d左右繼代1次，愈傷組織可分化出幼苗；

5）健苗生根培養(yǎng)：當(dāng)上述步驟分化出的幼苗株高長到3~4cm時，轉(zhuǎn)接到健苗生根培養(yǎng)液中，在溫度24~26℃、光照強(qiáng)度2000~2400lx、光照時間13-15h/d的條件下培養(yǎng)26~32d獲得生長健壯的花培再生植株；

6）馴化移栽：花培再生植株長出3~5片真葉、6~8條根系后，轉(zhuǎn)移到溫度為15~30℃、濕度為80~90%的溫室中，自然光照條件下馴化7~10d，然后將花培再生植株從培養(yǎng)瓶中取出，移栽到溫室的栽培基質(zhì)中，常規(guī)栽培管理；

7）大田定植：當(dāng)上述溫室栽培的花培再生植株株高長到20cm左右時，將其作為油茶種苗定植到大田中，進(jìn)行正常施肥、除蟲、防病和撫育管理，待油茶種苗生長發(fā)育進(jìn)入成年期后根據(jù)油茶經(jīng)濟(jì)指標(biāo)和優(yōu)質(zhì)品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)一步篩選出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的油茶品系。

所述步驟1）中高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)具體是指根據(jù)油茶經(jīng)濟(jì)指標(biāo)，具有單株產(chǎn)量高、干出籽率高、鮮出籽率高、種仁含油率高的特性，根據(jù)油脂品質(zhì)指標(biāo)，具有不飽和脂肪酸總含量高、油酸含量高的特性。

所述步驟3）中篩選小孢子發(fā)育時期處于單核靠邊期的花蕾的方法為：將花蕾中的花藥挑取2~3枚碾碎，釋放出花粉，通過dapi染色確定花粉發(fā)育時期為單核靠邊期。

所述步驟3）中冷等離子體處理的具體方法為：在真空封閉環(huán)境中，以氦氣為工作介質(zhì)，60w的處理功率下對油茶花蕾進(jìn)行15~20s的非電離輻射處理。

所述步驟3）中花蕾表面消毒的方法為：將花蕾用自來水沖洗干凈，并用濾紙吸干水分，然后在無菌條件下，先用75%的酒精消毒60s，無菌水沖洗2次，再用0.1%的升汞消毒15min，無菌水沖洗5次。

所述步驟3）中誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成分為：ms培養(yǎng)基+色氨酸3.1~3.7mg/l+甘露醇14~20g/l+大豆卵磷脂4.0~4.6mg/l+硝酸鑭2.3~2.7mg/l+甜菜堿2.6~3.2mg/l+4-ipa0.9~1.1mg/l+2,4-d0.4~0.6mg/l+聚乙烯吡咯烷酮15~22g/l+油茶殼粉3.5~4.5g/l，ph為5.4~5.8。

所述步驟4）中分化培養(yǎng)基的成分為：kno31400~1800mg/l，nh4no3850~900mg/l，kh2po4330~360mg/l，mgso4·7h2o144~162mg/l，cacl2·2h2o375~400mg/l，mnso4·4h2o20~25mg/l，蛋氨酸鋅8.5~9.5mg/l，h3bo37.8~8.6mg/l，ki0.6~0.8mg/l，cuso4·5h2o0.023~0.027mg/l，cocl2·6h2o0.023~0.027mg/l，na2moo4·2h2o0.20~0.30mg/l，feso4·7h2o27~28mg/l，na2-edta36~37mg/l，肌醇85~95mg/l，維生素b60.5~0.6mg/l，nan31.4~1.8mg/l，維生素b10.5~0.6mg/l，β-胡蘿卜素0.3~0.4mg/l，d-泛酸鈣3.1~3.7mg/l，5'-肌苷酸二鈉7.5~8.0mg/l，豌豆泥50~60mg/l，聚谷氨酸2.2~2.8mg/l，四甲基戊二酸0.4~0.6mg/l，n-苯基鄰羧基苯甲酰胺0.8~1.2mg/l，復(fù)硝酚鈉1.1~1.3mg/l，紫云英花粉20~28mg/l，油茶籽油3.6~4.4g/l，麥芽糖28~34g/l，植物凝膠5~7g/l，ph為5.4~5.8。

所述步驟5）中健苗生根培養(yǎng)液的成分為1/2ms培養(yǎng)基（不含瓊脂）+硅豐環(huán)0.8~1.0mg/l+naa0.1~0.3mg/l+豌豆泥36~40mg/l，ph值為5.6~6.0。

本發(fā)明的有益效果：

1）本發(fā)明通過對油茶花藥培養(yǎng)流程進(jìn)行探索研究，首次建立了完整的油茶花藥培養(yǎng)體系，并成功獲得了油茶花培再生植株。

2）本發(fā)明將花藥培養(yǎng)技術(shù)與常規(guī)雜交育種手段相結(jié)合，應(yīng)用于油茶的育種實踐，并成功篩選出了高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的油茶新品系，極大的縮短了油茶育種年限，提高了油茶育種效率，對油茶良種育種和推廣以及油茶產(chǎn)業(yè)健康快速發(fā)展都具有重要意義。

具體實施方式

以下結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明提供的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)油茶的快速育種方法進(jìn)行詳細(xì)的說明，但是不能把它們理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。

實施例1

一種高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)油茶的快速育種方法，該方法包括以下步驟：

1）育種親本的篩選：根據(jù)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)（單株產(chǎn)量高、干出籽率高、鮮出籽率高、種仁含油率高、油酸含量高）的育種目標(biāo)，我們篩選出適宜在浙江種植的普通油茶品種長林3號和浙江青田25號作為育種親本。長林3號果實大小中等，六年生的植株單株產(chǎn)果量約3.0kg，干出籽率為24.0%，種仁含油率為46.8%，產(chǎn)量較穩(wěn)定。浙江青田25號種仁含油率52.1%，不飽和脂肪酸含量90.6%，油酸含量81.3%，油脂品質(zhì)優(yōu)良。

2）將育種親本進(jìn)行雜交，收獲f1代雜交種：2007年，在長林3號和浙江青田25的花期，采用常規(guī)人工授粉的方法將二者進(jìn)行雜交，次年結(jié)實后收獲f1代雜交種；2008年將f1代雜交種正季種植于大田。

3）f1代雜交種花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)：2012年f1代雜交種生長發(fā)育進(jìn)入初花期時，采集并篩選出小孢子發(fā)育進(jìn)入單核靠邊期的健康花蕾（篩選的方法為：將花蕾中的花藥挑取2~3枚碾碎，釋放出花粉，通過dapi染色確定花粉發(fā)育時期為單核靠邊期），將花蕾先置于4℃低溫預(yù)處理6d，再用冷等離子體處理，具體操作方法為：在真空封閉環(huán)境中，以氦氣為工作介質(zhì)，60w的處理功率下對花蕾進(jìn)行18s的非電離輻射處理，將處理后的花蕾用自來水沖洗干凈，并用濾紙吸干水分，然后在無菌條件下，先用75%的酒精消毒60s，無菌水沖洗2次，再用0.1%的升汞消毒15min，無菌水沖洗5次，然后小心剝?nèi)』ㄋ帲ㄇ谐ńz）接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在溫度24℃、黑暗的條件下培養(yǎng)40~50d誘導(dǎo)出愈傷組織，并統(tǒng)計出愈傷組織誘導(dǎo)率；

誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成分為：ms培養(yǎng)基+色氨酸3.4mg/l+甘露醇17g/l+大豆卵磷脂4.3mg/l+硝酸鑭2.5mg/l+甜菜堿2.9mg/l+4-ipa1.0mg/l+2,4-d0.5mg/l+聚乙烯吡咯烷酮18.5g/l+油茶殼粉4.0g/l，ph為5.6。

4）愈傷組織分化培養(yǎng)：當(dāng)上述愈傷組織大小長至2~3mm時，及時轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基上，在溫度25℃、光照強(qiáng)度1600lx、光照時間11h/d的條件下培養(yǎng)55~65d，期間每28d左右繼代1次，愈傷組織可分化出綠色的幼苗，并統(tǒng)計出綠苗分化率；

分化培養(yǎng)基的成分為：kno31600mg/l，nh4no3875mg/l，kh2po4345mg/l，mgso4·7h2o153mg/l，cacl2·2h2o387.5mg/l，mnso4·4h2o22.5mg/l，蛋氨酸鋅9.0mg/l，h3bo38.2mg/l，ki0.7mg/l，cuso4·5h2o0.025mg/l，cocl2·6h2o0.025mg/l，na2moo4·2h2o0.25mg/l，feso4·7h2o27.5mg/l，na2-edta36.5mg/l，肌醇90mg/l，維生素b60.55mg/l，nan31.6mg/l，維生素b10.55mg/l，β-胡蘿卜素0.35mg/l，d-泛酸鈣3.4mg/l，5'-肌苷酸二鈉7.7mg/l，豌豆泥55mg/l，聚谷氨酸2.6mg/l，四甲基戊二酸0.5mg/l，n-苯基鄰羧基苯甲酰胺1.0mg/l，復(fù)硝酚鈉1.2mg/l，紫云英花粉24mg/l，油茶籽油4.0g/l，麥芽糖31g/l，植物凝膠6g/l，ph為5.6。

5）健苗生根培養(yǎng)：當(dāng)上述步驟分化出的幼苗株高長到3~4cm時，轉(zhuǎn)接到健苗生根培養(yǎng)液中，在溫度25℃、光照強(qiáng)度2200lx、光照時間14h/d的條件下培養(yǎng)26~32d，獲得生長健壯的花培再生植株；

健苗生根培養(yǎng)液的成分為1/2ms培養(yǎng)基（不含瓊脂）+硅豐環(huán)0.9mg/l+naa0.2mg/l+豌豆泥38mg/l，ph值為5.8。

6）馴化移栽：花培再生植株長出3~5片真葉、6~8條根系后，轉(zhuǎn)移到溫度為15~30℃、濕度為80~90%的溫室中，自然光照條件下馴化7~10d，然后將花培再生植株從培養(yǎng)瓶中取出，移栽到溫室的栽培基質(zhì)中，常規(guī)栽培管理。

7）大田定植：當(dāng)上述溫室栽培的花培再生植株株高長到20cm左右時，將其作為油茶種苗定植到大田中，進(jìn)行正常施肥、除蟲、防病和撫育管理，2015年開始，待油茶種苗生長發(fā)育進(jìn)入成年期后根據(jù)油茶經(jīng)濟(jì)指標(biāo)和不飽和脂肪酸指標(biāo)進(jìn)一步篩選出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的油茶品系。

實施例2

為了證明本發(fā)明的冷等離子體預(yù)處理方法對油茶花藥誘導(dǎo)和分化的影響，本實施例取消了實施例1步驟3）中的對花蕾的冷等離子體預(yù)處理，只將花蕾置于4℃低溫預(yù)處理6d，其他操作與實施例1相同，統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率和綠苗分化率。

實施例3

為了證明本發(fā)明的分化培養(yǎng)基對油茶花藥分化的影響，本實施例將實施例1步驟4）中采用的分化培養(yǎng)基替換為n6+2.0mg/lba+0.5mg/liaa+0.5mg/l5br+1.0mg/l核黃素，該分化培養(yǎng)基來源于隆振雄《油茶花藥培養(yǎng)獲得綠芽點和根》，統(tǒng)計綠苗分化率。

結(jié)果分析

1、不同預(yù)處理方法對油茶花藥誘導(dǎo)和分化的影響，將實施例1與實施例2的愈傷組織誘導(dǎo)率和綠苗分化率統(tǒng)計如下表一。

由上表結(jié)果可以看出，本發(fā)明采用的冷等離子體預(yù)處理方法能夠提高油茶花藥培養(yǎng)中愈傷組織誘導(dǎo)率和綠苗分化率，可能是利用冷等離子技術(shù)對油茶花蕾進(jìn)行預(yù)處理，能夠提高花粉生活力和萌發(fā)力，促進(jìn)組織細(xì)胞分裂分化。

2、不同分化培養(yǎng)基對油茶花藥分化的影響，將實施例1與實施例3的綠苗分化率統(tǒng)計如下表二。

由上表結(jié)果可以看出，采用本發(fā)明的分化培養(yǎng)基，綠苗分化率達(dá)到了8.5%，明顯高于實施例3。在對比文獻(xiàn)《油茶花藥培養(yǎng)獲得綠芽點和根》中提到，由于污染而未獲得完整綠苗，而在實施例3的試驗中獲得了1.2%的綠苗分化率，可能是由于試驗中未發(fā)生污染，以及之前采用本發(fā)明的預(yù)處理方法和花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生的影響。本發(fā)明的分化培養(yǎng)基合理調(diào)控了基本元素的配比，更適合油茶花藥分化培養(yǎng)，還添加了nan3、β-胡蘿卜素、d-泛酸鈣、豌豆泥、聚谷氨酸、四甲基戊二酸、n-苯基鄰羧基苯甲酰胺、5'-肌苷酸二鈉、復(fù)硝酚鈉、紫云英花粉、油茶籽油等物質(zhì)，能增強(qiáng)組織細(xì)胞活性，促進(jìn)愈傷組織分化。

實施例1中獲得油茶花培再生植株73株，根據(jù)油茶經(jīng)濟(jì)指標(biāo)和不飽和脂肪酸指標(biāo)進(jìn)一步篩選出了2個高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的油茶品系。

以上結(jié)合具體實施例描述了本發(fā)明的技術(shù)原理。這些描述只是為了解釋本發(fā)明的原理，而不能以任何方式解釋為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。基于此處的解釋，本領(lǐng)域的技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性的勞動即可聯(lián)想到本發(fā)明的其它具體實施方式，這些方式都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

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