1(廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(華南農(nóng)業(yè)大學(xué))，廣東 廣州，510642)2(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州，510642)3(廣東嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州，510642)

摘 要 苦瓜青錢柳復(fù)合茶(后文簡稱復(fù)合茶)不僅可以抑制活性氧和老年斑的積累，改善神經(jīng)保護(hù)作用，還可以減輕脂肪的積累。進(jìn)一步利用秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)模型研究其抗氧化應(yīng)激活性，為進(jìn)一步推廣和應(yīng)用提供了理論依據(jù)。首先，復(fù)合茶可以為暴露于H2O2和百草枯引起的氧化應(yīng)激的線蟲提供很好的保護(hù)作用，尤其對氧化應(yīng)激敏感的突變體TK22。進(jìn)一步探索其抗氧化特性，發(fā)現(xiàn)線蟲的抗氧化防御體系顯著被復(fù)合茶激活。此外，復(fù)合茶處理顯著提升了線蟲抗氧化酶基因(sod-3、sod-5、ctl-1和ctl-2)和抗逆基因(hsp-16.1和hsp-16.2)的表達(dá)。最后，復(fù)合茶不會損害線蟲的繁殖和發(fā)育，甚至緩解了移動力的衰退。該研究為復(fù)合茶作為膳食佐劑在氧化應(yīng)激管理中提供了理論依據(jù)，并通過尋求新的創(chuàng)新應(yīng)用為青錢柳及苦瓜增加了價(jià)值。

過量活性氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生物分子功能損傷的重要原因[1]。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)許多富含生物活性物質(zhì)的植物提取物表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗氧化活性，可以緩解氧化應(yīng)激[2]，且它們被認(rèn)為比商業(yè)合成的抗氧化劑更經(jīng)濟(jì)、更安全[3]。此外，含有多種植物成分的復(fù)合物可能具有更高的藥用價(jià)值和/或較低的毒性[4-5]。因此，天然植物抗氧化劑作為食品添加劑、功能性食品和保健食品的潛力受到了人們的廣泛關(guān)注。

青錢柳(Cyclocarya paliurus)為胡桃科、青錢柳屬植物[6]。在1999年，青錢柳葉茶成為中國第一個(gè)通過美國食品藥品管理局認(rèn)證的保健茶[7]。因其藥用價(jià)值，目前已經(jīng)被列入中國新食品資源名單[8]。有研究表明，多糖是青錢柳葉的主要活性成分，具有一系列獨(dú)特的生物活性，如抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和降血糖作用等[9-10]。根據(jù)前期研究得知，青錢柳多糖粗提物可通過激活秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans，以下簡稱線蟲)的抗氧化防御系統(tǒng)，從而提高抗逆性[11]?？喙?Momordica charantia)，俗稱涼瓜、癩瓜，也是一種藥食同源的植物[12]?？喙显碥詹粌H具有降血糖、調(diào)節(jié)糖脂代謝和抗肥胖的藥理作用和保健價(jià)值，還具有提高免疫力、抗氧化和抗逆等作用[12]。但苦瓜獨(dú)特的苦味，極大地限制了其開發(fā)利用。課題組研究發(fā)現(xiàn)青錢柳多糖提取物能很好地協(xié)調(diào)苦瓜皂苷提取物的苦味，基于此，課題組前期以青錢柳多糖和苦瓜皂苷提取物為原料，自主研制了一款新型復(fù)合茶——苦瓜青錢柳復(fù)合保健茶(專利申請?zhí)枺篊N 108935842 A)。

本研究采用線蟲模型測定苦瓜青錢柳復(fù)合茶的抗氧化應(yīng)激作用，分析其在不同氧化應(yīng)激模型的生存率，進(jìn)一步測定其對線蟲抗氧化防御體系及相關(guān)基因表達(dá)的影響。研究結(jié)果為苦瓜青錢柳復(fù)合保健茶的抗氧化應(yīng)激功效提供了有效的理論數(shù)據(jù)，并增加青錢柳和苦瓜的價(jià)值，也對今后研發(fā)具有高效、無毒、天然的植物類保健品有著十分重要的借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青錢柳干葉，湖南省張家界諾康生態(tài)茶業(yè)有限公司；苦瓜干片，廣州康圣藥業(yè)有限公司；甜菊糖、木糖醇、檸檬酸，均為食品級，當(dāng)?shù)爻?，符合GB 2760—2014要求；二氯百草枯(paraquat)，美國Sigma-Aldrich有限公司；生化分析試劑盒,南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 苦瓜青錢柳復(fù)合茶的制備和涂布

原料的制備：按照先前報(bào)道的方法，制備青錢柳多糖提取物[11]和苦瓜皂苷提取物[13]的儲備液。

青錢柳多糖儲備液的特征：青錢柳多糖的平均分子質(zhì)量主要集中在84 061.23 Da，占58%，其次是1 312.41 Da，占29%。真空冷凍干燥后，將樣品重懸于超純水中(水溶性多糖質(zhì)量濃度137.46 μg/mL)，并保存在-20 ℃下以獲得儲備液[11]。

苦瓜皂苷儲備液的特征：先前的研究初步確定了苦瓜皂苷提取物中含有14種苦瓜皂苷，其中aglycone of momordicoside I、goyaglycoside d、momordicoside P和momordicine I是檢測到的主要成分，儲備液以25.09 mg/mL的質(zhì)量濃度儲存在-20 ℃(其中皂苷質(zhì)量濃度為726.23 μg/mL人參皂苷Rg1當(dāng)量)[13]。

保健茶儲備液的制備：在初始預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過單因素試驗(yàn)考察青錢柳多糖、苦瓜皂苷、檸檬酸和木糖醇的添加量對保健茶的感官評分以及青錢柳多糖和苦瓜皂苷的保留率的影響，并通過L9(34)正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。最佳工藝條件如下：體積分?jǐn)?shù)10%的青錢柳多糖提取物儲備液，體積分?jǐn)?shù)0.1%的苦瓜皂苷提取物儲備溶液，質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.25%的木糖醇，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的檸檬酸儲備溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%甜菊糖。其制備的茶飲具有較高的穩(wěn)定性，且色澤清晰、香氣宜人、酸甜可口，并具有青錢柳葉和苦瓜片的獨(dú)特風(fēng)味。最后，將保健茶真空濃縮至原體積的1/10制成儲備液，并保存在4 ℃。

保健茶工作液的制備和涂布：保健茶儲備液(實(shí)驗(yàn)組，Y)或滅菌純水(對照組，CK)與大腸桿菌OP50菌液按體積比為1∶9的比例混合，涂布于線蟲生長培養(yǎng)基上。

1.3 線蟲培養(yǎng)

野生型秀麗隱桿線蟲(the Bristol strain N2)，雌雄同體，北京市生命科學(xué)研究院惠贈；TK22 [mev-1 (kn1) III]突變體線蟲,秀麗隱桿線蟲遺傳學(xué)中心；大腸桿菌OP50,周慶華教授(暨南大學(xué)生物醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化研究所)惠贈。參考文獻(xiàn)[14]的方案，采用高氯酸鈉裂解法對線蟲進(jìn)行同期化處理。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激試驗(yàn)

H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激試驗(yàn)操作參考文獻(xiàn)[11]的方案，挑取60只處理3 d的線蟲暴露于0.1%體積分?jǐn)?shù)為30%的H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激壓力下。每隔30 min記錄線蟲生存、死亡數(shù)，直至線蟲全部死亡。

1.4.2 百草枯誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激試驗(yàn)

百草枯誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)操作參考文獻(xiàn)[11]的方案，挑取60只處理3 d的線蟲轉(zhuǎn)移至補(bǔ)充了10 mmol/L百草枯的藥物/對照線蟲生長培養(yǎng)基中，每隔24 h記錄生存、死亡數(shù)，直至線蟲全部死亡。

1.4.3 抗氧化酶或非酶活性測定

按照之前的方案[15],根據(jù)試劑盒提供的說明書進(jìn)行測定,結(jié)果通過蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)化。

1.4.4 關(guān)鍵抗逆/抗氧化基因表達(dá)分析

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real time,polymerase chain reaction, qRT-PCR)的操作參考文獻(xiàn)[14]。引物如附表4所示，act-1為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt法對表達(dá)基因進(jìn)行相對定量。

1.4.5 繁殖力測定

繁殖力通過產(chǎn)卵量、后代數(shù)和孵化率來綜合評價(jià)[13]。在產(chǎn)卵期每隔24 h將10條L4期幼蟲轉(zhuǎn)移至新平板中直至線蟲停止產(chǎn)卵，每組產(chǎn)卵的總數(shù)被認(rèn)為是產(chǎn)卵量，孵出的后代數(shù)量是后代數(shù)，孵化率是后代數(shù)與產(chǎn)卵量的比值。

1.4.6 生長率測定

同期化的卵在20℃孵化48h后，對每個(gè)發(fā)育階段的線蟲數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)[13]。

1.4.7 移動力測定

參考文獻(xiàn)[16]的方法記錄移動力。Ⅰ：線蟲不需經(jīng)觸碰刺激可自發(fā)運(yùn)動；Ⅱ：線蟲必須受到觸碰刺激才可運(yùn)動；Ⅲ：線蟲在受到觸碰刺激之后只能擺動頭或尾。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3次，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并通過SPSS 16.0軟件采用單因素方差分析法進(jìn)行顯著性分析，P<0.05為顯著差異。其中，生存曲線使用GraphPad(Windows 5.00版)軟件進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)分析顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 對線蟲抗氧化應(yīng)激性的影響

2.1.1 對野生型N2線蟲抗氧化應(yīng)激性的影響

在H2O2急性氧化脅迫下，復(fù)合茶處理使線蟲生存曲線發(fā)生顯著右移(圖1-a)，線蟲的平均壽命提高了11%，中位壽命和最大壽命分別提高了15%和20%(表1)。同時(shí)，在百草枯誘導(dǎo)的氧化脅迫下也發(fā)現(xiàn)類似的保護(hù)作用，平均存活時(shí)間比未經(jīng)處理的顯著增加了25%(圖1-b和表1)。

2.1.2 對突變體TK22線蟲抗氧化應(yīng)激性的影響

為進(jìn)一步測定復(fù)合茶對氧化損傷的防御作用，利用對氧化應(yīng)激敏感的TK22 [mev-1 (kn1) III]突變體進(jìn)行了H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激存活分析[17]。與對照組相比，經(jīng)過復(fù)合茶培養(yǎng)的TK22突變體不僅生存曲線發(fā)生顯著右移(圖2)，而且平均壽命、中位壽命和最大壽命都得到顯著延長(表1)。綜上，復(fù)合茶具有提高線蟲的抗氧化應(yīng)激的潛力。

a-H2O2誘導(dǎo)；b-百草枯誘導(dǎo)
圖1 氧化脅迫下野生型N2的存活曲線
Fig.1 Survival curve of wild type N2 under oxidative stress
注：壽命曲線中*表示差異顯著(*為P< 0.05，**為P < 0.01
和***為P < 0.001)(下同)

表1 不同處理?xiàng)l件下線蟲存活時(shí)間
Table 1 Survival time of C.elegans under
different treatments

處理?xiàng)l件平均壽命(1)中位壽命(2)最大壽命(3)P值(4)N2CK(H2O2)Y(H2O2)2.43±0.04a2.69±0.02b2.17±0.29a2.50±0.00b3.33±0.29a4.00± 0.00b0.000 6CK(百草枯)Y(百草枯)2.25±0.03a2.82±0.01b1.83±0.29a2.00±0.00a4.67±0.58a5.67±0.58a0.000 4mev-1CK(H2O2)Y(H2O2)1.34±0.01a1.74±0.02b1.50±0.00a1.75±0.25b2.00±0.00a2.67±0.29b<0.000 1

注：(1)平均壽命其中j生存時(shí)間(d)，dj是在年齡間隔(xj，xj+1)內(nèi)死亡的線蟲數(shù)量，n是線蟲總數(shù)。

(2)中位壽命是指存活率等于50%的時(shí)間。

(3)最大壽命是指存活率等于0%的時(shí)間。

(4)不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

圖2 H2O2誘導(dǎo)的氧化脅迫下突變體TK22的存活曲線
Fig.2 Survival curve of mutant TK22 under H2O2-induced oxidative stress

2.2 對線蟲抗氧化防御體系的影響

2.2.1 對線蟲抗氧化酶防御體系的影響

作為機(jī)體抗氧化能力的重要組成部分，抗氧化防御系統(tǒng)也得到了進(jìn)一步的研究[18]。由圖3可知，在抗氧化防御體系方面，復(fù)合茶處理組的線蟲在培養(yǎng)96 h后，其超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)的酶活力均得到顯著提高，分別增加了28%、106%和78%。

a-對線蟲SOD酶活力的影響; b-對線蟲CAT酶活力的影響; c-對線蟲GSH-Px酶活力的影響
圖3 對線蟲抗氧化酶防御系統(tǒng)的影響
Fig.3 Effect of health tea on the antioxidant enzyme defense system in C.elegans

2.2.1 對線蟲抗氧化非酶防御體系的影響

在抗氧化非酶系統(tǒng)方面，線蟲培養(yǎng)96 h后，復(fù)合茶處理組的GSH含量顯著增加33%(圖4-a)，氧化性谷胱甘肽(glutathione oxidized,GSSG)水平顯著降低了44%(圖4-b)。如圖4-c所示，作為氧化應(yīng)激的動態(tài)指標(biāo)——GSH/GSSG的比值從30.57顯著增加到72.83，與對照組相比顯著提高了1.38倍，這與GSH-Px的水平被復(fù)合茶顯著提高的結(jié)果相符，結(jié)果表明復(fù)合茶可能具有激活線蟲抗氧化防御系統(tǒng)的潛力。

a-GSH含量; b-GSSG含量; c-GSH/GSSG的比例
圖4 對線蟲抗氧化非酶防御系統(tǒng)的影響
Fig.4 Effect of health tea on the antioxidant nonenzyme defense system in C.elegans

2.3 對線蟲關(guān)鍵抗氧化和抗逆基因表達(dá)的影響

已知在線蟲中鑒定了許多調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)的遺傳因子和通路途徑[19]，因此通過qRT-PCR來定量一些對調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)起著關(guān)鍵作用的抗逆和抗氧化基因的表達(dá)水平。如圖5所示，與對照組相比，復(fù)合茶處理后超氧化物歧化酶基因(sod-3和sod-5)和過氧化氫酶基因(ctl-1和ctl-2)、熱激蛋白基因(hsp-16.1和hsp-16.2)的表達(dá)量顯著升高，因此復(fù)合茶增強(qiáng)線蟲抗氧化應(yīng)激能力可能與促進(jìn)抗氧化酶和抗逆基因的表達(dá)有關(guān)。

圖5 對線蟲關(guān)鍵抗氧化和抗逆基因表達(dá)的影響
Fig.5 Effects of health tea on the expression of key antioxidant and stress resistant genes in C.elegans

2.4 對線蟲生理功能的影響

2.4.1 對線蟲繁殖的影響

如圖6所示，與對照組相比，線蟲的總產(chǎn)卵量、總后代數(shù)以及孵化率均沒有明顯的變化。復(fù)合茶處理的線蟲的第1天產(chǎn)卵量和后代數(shù)被顯著提高，而第3天產(chǎn)卵量和后代數(shù)被顯著抑制,原因可能是保健茶具有促進(jìn)母體線蟲卵細(xì)胞的釋放的潛力，從而減少卵細(xì)胞在子宮內(nèi)的滯留(圖6-a, 6-b)?？紤]到總繁殖力沒有顯著變化，認(rèn)為復(fù)合茶不會損害線蟲的繁殖力。

a-線蟲產(chǎn)卵量;b-線蟲后代數(shù)量;c-線蟲孵化率
圖6 對線蟲繁殖力的影響
Fig.6 Effects of health tea on the fecundity in C.elegans

2.4.2 對線蟲發(fā)育的影響

為了進(jìn)一步探究復(fù)合茶是否會影響線蟲的生理功能，從發(fā)育的角度進(jìn)行了初步評價(jià)。如圖7所示，同步化的卵經(jīng)48 h孵化后，80%～84%的線蟲處于L4期，6%～8%達(dá)到L2/L3期，11～12%達(dá)到成蟲期。而經(jīng)復(fù)合茶處理后，線蟲的發(fā)育情況并無明顯差異。

圖7 對線蟲發(fā)育的影響
Fig.7 Effects of health tea on the development in C.elegans

2.4.3 對線蟲移動力的影響

線蟲的衰老伴隨著移動能力及對外界機(jī)械刺激反應(yīng)的退化[20]。如圖8所示，復(fù)合茶能明顯提高線蟲移動能力，在后期(第11天)尤其顯著。

圖8 對線蟲移動力的影響
Fig.8 Effects of health tea on the locomotivity in C.elegans

綜上，苦瓜青錢柳復(fù)合茶可以防止氧化應(yīng)激的益處可能與其主要成分青錢柳多糖和苦瓜皂苷相關(guān)。據(jù)報(bào)道，苦瓜和青錢柳葉具有促進(jìn)健康的潛力且是多功能的，具有多種生物活性，包括減肥、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、抗糖尿病、抗癌、降壓、抗菌、抗高脂血癥和抗炎等體外和體內(nèi)活性[21-22]。研究表明，苦瓜皂苷和青錢柳多糖分別是苦瓜和青錢柳葉中的主要活性成分[23-24]。青錢柳多糖也被證實(shí)可以保護(hù)氧化應(yīng)激環(huán)境下的線蟲[11]，關(guān)于苦瓜皂苷對氧化應(yīng)激下的線蟲提供的保護(hù)作用仍在研究中。因此，苦瓜青錢柳復(fù)合茶是一種富有前景的創(chuàng)新功能飲料。

3 結(jié)論

本研究利用秀麗隱桿線蟲模型探究一款自主研發(fā)的苦瓜青錢柳復(fù)合茶的抗氧化脅迫作用，結(jié)果表明，該復(fù)合茶具有優(yōu)秀的抗氧化脅迫保護(hù)潛力且不影響線蟲的基本生理功能。進(jìn)一步探究線蟲的抗氧化防御體系，發(fā)現(xiàn)其介導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激作用可能與上調(diào)抗氧化和抗逆相關(guān)基因的表達(dá),從而激活機(jī)體抗氧化酶和非酶活性有關(guān)?？傊?，該復(fù)合茶具有用于預(yù)防氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的前景。同時(shí)，本研究也為今后以苦瓜皂苷和青錢柳多糖作為一種潛在的功能性配方開發(fā)更多具有健康益處的創(chuàng)新產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)。

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