9月18日，中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究所翟琦巍研究組在國際學(xué)術(shù)期刊Nature Communications在線發(fā)表了題為“Discovery of the major 15-30 nt mammalian small RNAs, their biogenesis and function”的研究論文。該研究通過生化分析、新型高通量測序等多種分析鑒定技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了哺乳動物中長度為15-30個堿基(Nucleotide, nt)范圍內(nèi)的主要的小RNA是3’環(huán)磷酸小RNA，初步揭示這些3’環(huán)磷酸小RNA的產(chǎn)生機制，并發(fā)現(xiàn)其可以存在于Ago2復(fù)合物中，以類似于microRNA的方式結(jié)合到mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’-UTR)從而引導(dǎo)目的mRNA的降解，進而發(fā)揮生物學(xué)功能。該項研究拓展了對哺乳動物小RNA的認識，揭示了哺乳動物中15-30nt長度范圍內(nèi)的大部分未知小RNA，特別是環(huán)磷酸小RNA，初步揭示其產(chǎn)生機制，并發(fā)現(xiàn)其具有類似microRNA的重要生物學(xué)功能。

　　小RNA是一類生物體內(nèi)具有重要生物學(xué)功能、通常長度小于200nt的RNA。目前在15-30 nt長度范圍內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種類型的小RNA，例如microRNA、piRNA、tRNA-derived small RNA (tsRNA)以及small rDNA-derived RNA (srRNA)等。然而，這些小RNA是否是15-30 nt長度范圍內(nèi)的主要小RNA還并不清楚。

　　研究人員使用小鼠肝臟分離純化了大量的15-30nt長度的小RNA，讓這些小RNA通過常規(guī)的電泳染色就能清晰觀察到。隨后，通過T4 RNA ligase 2催化的3’羥基(3’-OH)小RNA與5’預(yù)腺苷化接頭的連接反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)這些15-30nt長度的小RNA絕大多數(shù)并不是3’-OH；僅當使用T4多聚核苷酸激酶(T4 Polynucleotide Kinase, T4 Pnk)催化處理后，才能幾乎全部被連接上接頭。進一步的質(zhì)譜分析及大量不同細胞或組織的多種生化分析發(fā)現(xiàn)，哺乳動物15-30nt長度的小RNA的3’末端主要為環(huán)磷酸(2’,3’-cyclic phosphate, 2’,3’-cP)，含量約為90%，這些小RNA可以稱為3’環(huán)磷酸小RNA (sRNAs with 3’-cP, sRNA-cP)。為了進一步解析這些sRNA-cP，研究人員建立了一種可以在一個樣品中同時檢測sRNA-OH和sRNA-cP的新型高通量測定小RNA序列信息的方法，稱為TANT-seq (T4 Rnl2/AP/NaIO4/T4 Pnk (3’ phosphatase minus)/RtcB-based sRNA-seq)?；赥ANT-seq高通量測序，揭示了大量的sRNA-cP和sRNA-OH的序列信息，并發(fā)現(xiàn)sRNA-cP和sRNA-OH通常具有不同的序列。

　　為了便于分析不同3’末端的小RNA，研究人員建立了一種可以同時檢測3’-OH、3’-P和3’-cP的基于定量PCR的技術(shù)方法TE-qPCR (triplex-3’-end qPCR)?；赥E-qPCR技術(shù)方法對許多sRNA-cP和sRNA-OH進行了驗證，并發(fā)現(xiàn)很多sRNA-cP和饑餓、肥胖、糖尿病等生理病理狀態(tài)有關(guān)，提示sRNA-cP有重要的生物學(xué)功能。

　　哺乳動物15-30nt長度的小RNA主要為sRNA-cP，但這些小RNA究竟是在分離純化RNA過程中隨機降解產(chǎn)生的，還是在細胞內(nèi)特異性加工產(chǎn)生的還有待解答。通過對sRNA-cP的末端序列特征分析發(fā)現(xiàn)，其3’末端主要為嘧啶堿基，而5’末端主要為嘌呤堿基。根據(jù)已知的細胞內(nèi)各種RNA內(nèi)切酶的序列識別特征，通過逐步的體外篩選以及后續(xù)的基因敲除和過表達等技術(shù)發(fā)現(xiàn)，ANG和RNase4介導(dǎo)了部分sRNA-cP的產(chǎn)生。

　　有研究報道m(xù)icroRNA、tsRNA、srRNA、snoRNA、snRNA、sinRNA、smRNA、piRNA、srpRNA以及smcRNA等小RNA都可以和Ago2結(jié)合，特別是microRNA已經(jīng)被廣泛報道可以通過和Ago2結(jié)合靶向目標mRNA的3’非翻譯區(qū)從而降解目標mRNA或抑制其翻譯。哺乳動物15-30nt長度的主要小RNA sRNA-cP是否也可以類似于microRNA和Ago2結(jié)合，從而發(fā)揮生物功能呢？研究人員通過免疫沉淀獲得了Ago2復(fù)合物，隨后抽提獲得了Ago2復(fù)合物中的RNA，并通過TANT-seq測序分析了其中的小RNA。研究發(fā)現(xiàn)Ago2復(fù)合物中，最主要的15-30nt小RNA也是sRNA-cP，含量約為80-90%，而microRNA僅占sRNA-OH的約10%，相當于Ago2復(fù)合物中sRNA-cP的含量大約為microRNA的近100倍。Ago2中這么大量的sRNA-cP，如果大部分都能發(fā)揮生物學(xué)功能，其作用和意義甚至有可能會高于microRNA。

　　為了研究這些Ago2復(fù)合物中的sRNA-cP的生物學(xué)功能，研究人員參考microRNA進行了生物信息學(xué)預(yù)測，通過熒光素報告基因篩選了一系列可能靶向的3’-UTR。從40個候選sRNA-cP預(yù)測的107個靶向的3’-UTR中，篩選出16個sRNA-cP和對應(yīng)的18個3’-UTR正反向都能有兩倍以上的調(diào)控效應(yīng)。進一步的研究發(fā)現(xiàn)其中大部分都能正反向有效調(diào)控相應(yīng)的mRNA水平，并且其中有些還進一步驗證了相應(yīng)的正反向的對于蛋白表達水平的調(diào)節(jié)作用。其中發(fā)現(xiàn)的snR-2-cP可以通過依賴于Ago2的方式，靶向著名的抗凋亡基因Bcl2的mRNA的3’-UTR靶位點，下調(diào)Bcl2的mRNA和蛋白水平，從而調(diào)控細胞凋亡。

　　為了進一步驗證sRNA-cP是否可以結(jié)合Ago2并引導(dǎo)識別和剪切靶序列，研究人員分離純化轉(zhuǎn)染了特定小RNA的Ago2復(fù)合物，在體外添加相應(yīng)的小RNA識別的靶序列。在該體外研究體系中可以清晰觀察到sRNA-cP可以序列特異性地引導(dǎo)對于靶序列的識別和剪切，并且對于靶序列的剪切位置與microRNA一致，都發(fā)生在與小RNA互補的靶序列的第10和第11個堿基之間。此外，通過直接分離純化Ago2復(fù)合物，在體外添加相應(yīng)的小RNA和小RNA識別的靶序列，也發(fā)現(xiàn)具有相一致的效果。進一步研究發(fā)現(xiàn)，sRNA-cP發(fā)揮作用時不依賴于其3’-cP。

　　該研究工作開辟了小RNA研究的新方向，為后續(xù)大量sRNA-cP的生理病理相關(guān)性及其生物學(xué)功能揭示奠定了基礎(chǔ)，也將對整個小RNA研究領(lǐng)域產(chǎn)生重要影響，有望成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的里程碑性工作。

　　中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究所賴和勁博士和馮寧博士為該論文共同第一作者。翟琦巍研究員為該論文的通訊作者。該研究工作得到了科技部國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金委、中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項、中國科學(xué)院前沿科學(xué)重點研究項目和上海領(lǐng)軍人才項目等的資助，也獲得了中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究所公共技術(shù)平臺和動物平臺的支持。

哺乳動物15-30nt主要小RNA的分析鑒定及其產(chǎn)生機制和功能的示意圖

　　論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-41554-6

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