摘要：

研究背景 艾滋病是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染引起的,嚴(yán)重威脅人類健康的傳染性疾病.據(jù)UNAIDS統(tǒng)計(jì),2008年全球感染HIV的人數(shù)有3340多萬(wàn),而08年新增的HIV感染者數(shù)量為270萬(wàn),因艾滋病死亡的人數(shù)高達(dá)200萬(wàn).我國(guó)自1985年首次發(fā)現(xiàn)HIV感染者,截止2009年10月底,估計(jì)有74萬(wàn)人發(fā)生了感染,且2009年新增的感染者數(shù)量為4.8萬(wàn).在非洲的有些國(guó)家,HIV的感染率達(dá)總?cè)丝?0%以上.因此,預(yù)防和治療艾滋病,已不僅僅是挽救個(gè)人生命的問(wèn)題,而是關(guān)系到民族存亡的大事.由于有效的艾滋病疫苗在短時(shí)期內(nèi)還難以面世,開(kāi)發(fā)高效,安全和廉價(jià)的抗HIV藥物依然是挽救艾滋病人生命的關(guān)鍵舉措,也是艾滋病防治的當(dāng)務(wù)之急.目前應(yīng)用于臨床的抗HIV藥物中逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑,蛋白酶抑制劑有26種,進(jìn)入抑制劑和整合酶抑制劑才3種,但前兩類藥物容易引起病毒耐藥現(xiàn)象和嚴(yán)重的毒副作用.因此,為了治療感染了耐藥病毒的艾滋病患者,組成更多有效的"雞尾酒"治療方案,必須大力開(kāi)發(fā)后兩類新作用機(jī)制的抗艾滋病藥物.其中HIV進(jìn)入抑制劑,由于能在病毒感染的早期進(jìn)行阻斷,更為有效地預(yù)防和治療HIV感染,而倍受重視. 已被批準(zhǔn)的HIV進(jìn)入抑制劑有兩種,分別是靶向HIV跨膜蛋白gp41的多肽藥物T-20(也叫融合抑制劑)和靶向HIV輔助受體CCR5的受體拮抗劑Maraviroc.Maraviroc只能作用于利用CCR5作為輔助受體的R5病毒,對(duì)以CXCR4為輔助受體的X4病毒無(wú)效,而T-20則對(duì)兩類病毒均具有抑制作用.然而,T-20是多肽藥物,不能口服,容易被體內(nèi)的蛋白酶降解,而且價(jià)格昂貴不是廣大的發(fā)展中國(guó)家HIV感染者所能承受的,因此開(kāi)發(fā)出具有類似作用機(jī)制的非肽類HIV進(jìn)入抑制劑迫在眉睫. 本課題根據(jù)實(shí)驗(yàn)室在相關(guān)領(lǐng)域積累的經(jīng)驗(yàn),與相關(guān)的研究組合作對(duì)大量的有機(jī)合成小分子和天然產(chǎn)物提取成分進(jìn)行抑制HIV進(jìn)入的體外活性篩選,并進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)完善新的實(shí)驗(yàn)方法,研究公認(rèn)的HIV-1抑制劑ADS-J1對(duì)gp41產(chǎn)生抑制作用的具體位點(diǎn). 第一章天然來(lái)源化合物抗HIV的活性篩選 目的: 通過(guò)對(duì)茶黃素衍生物單體進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,改變?cè)瓨悠奉伾?水溶性差等缺點(diǎn),考察改造后的化合物體外抑制HIV-1包膜介導(dǎo)的細(xì)胞融合活性和相關(guān)的生物學(xué)活性,確定改造后成分的可利用度及進(jìn)一步改造的方向,為該類化合物作為HIV進(jìn)入抑制劑的作用機(jī)制研究提供依據(jù).對(duì)番石榴葉提取成分進(jìn)行體外的免疫,分生活性檢測(cè),篩選出能在HIV-1進(jìn)入階段發(fā)揮作用的成分,并初步探討其作用機(jī)理,填補(bǔ)該類成分在HIV-1進(jìn)入抑制研究方面的空白. 方法: 1.茶黃素類衍生物的結(jié)構(gòu)改造和番石榴葉成分提取.茶黃素衍生物是文獻(xiàn)中研究最多的從紅茶中提取的TF1 (theaflavin), TF2A (theaflavin-3-monogallate), TF3 (theaflavin-3,3'-digallate),分別對(duì)它們的苯并酚酮七元環(huán)中的1",2",3",7"4個(gè)雙鍵進(jìn)行還原得到對(duì)應(yīng)的化合物TF1-4H,TF2A-4H, TF3-4H.具體操作是在Pt/C的催化下,通入H2還原,然后過(guò)濾除掉催化劑,對(duì)還原產(chǎn)物用反相柱層析分離純化得到相應(yīng)的化合物.參照相關(guān)文獻(xiàn),番石榴葉經(jīng)兩次乙醇提取的浸膏用SA-1型大孔樹(shù)脂吸附,然后用80%(V/V)的乙醇溶液洗脫,得到總皂苷的粗品.番石榴葉的乙醇提取物用FL-1型大孔樹(shù)脂吸附,然后用0.2%NaOH溶液洗脫,得到總黃酮的粗品.番石榴葉水浸泡液回流提取得到揮發(fā)油成分. 2.以上樣品先用抗體特異性的檢測(cè)抗原的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)進(jìn)行第一次篩選,有效的通過(guò)濃度梯度實(shí)驗(yàn)考察量效關(guān)系,計(jì)算抑制率并確定半數(shù)抑制濃度(Half of the inhibiting concentration, IC50)范圍.進(jìn)一步的用可直觀的從六螺旋束(six-helical bundle,6-HB)條帶變化中反映化合物抑制強(qiáng)弱的天然非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native polyacrylamide gel electrophoresis, N-PAGE)確證活性. 3.另外用HIV-1包膜介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)考察改造后的茶黃素類化合物和番石榴葉的有效成分細(xì)胞水平的抑制活性.根據(jù)融合時(shí)的細(xì)胞狀態(tài),對(duì)樣品進(jìn)行四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)相應(yīng)的細(xì)胞毒性. 結(jié)果: 1.分離純化的茶黃素衍生物結(jié)構(gòu)改造后純化的產(chǎn)物由香港浸會(huì)大學(xué)提供,本研究主要鑒定結(jié)構(gòu)改造后單體的活性大小.番石榴葉提取成分由南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院提供,黃酮粗品中總黃酮量為55.22%,皂苷粗品中總皂苷量為55.3%. 2.由于茶黃素化合物本身的不穩(wěn)定性,多次反復(fù)凍融后有部分化合物活性下降或消失,且受樣品量的限制,該部分有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不完善.首先利用抗體特異性的ELISA對(duì)茶黃素系列化合物進(jìn)行第一次篩選,發(fā)現(xiàn)25μg/mL的終濃度時(shí),化合物都有很高的抑制率.進(jìn)一步的梯度稀釋時(shí),雖然沒(méi)有做出TFl的IC50'范圍,但在終濃度11.08μM時(shí),抑制率為60%,而還原產(chǎn)物TF1-4H的IC50為0.63±0.27μM,另一組TF2A的IC50=2.60±0.56μM,還原產(chǎn)物TF2A-4H的IC50=1.13±0.27μM,第三組TF3的IC50=0.88±0.34 gM,還原產(chǎn)物TF3-4H的IC50=1.74±0.55 gM.與文獻(xiàn)值相比,本研究中IC50值略低,但都在微摩爾水平,且5μM的范圍內(nèi).N-PAGE實(shí)驗(yàn)的條帶顯示六個(gè)單體隨著濃度的降低,6-HB的顏色越來(lái)越深,表現(xiàn)出一定的量效依賴關(guān)系.用ELISA實(shí)驗(yàn)對(duì)番石榴葉的三個(gè)成分進(jìn)行初篩時(shí),發(fā)現(xiàn)以25μg/mL終濃度初篩,番石榴葉提取物總黃酮和總皂苷對(duì)6-HB的抑制率都在80%左右,揮發(fā)油成分的抑制活性較低,統(tǒng)計(jì)分析顯示前兩組與相同濃度的陽(yáng)性對(duì)照TF間無(wú)差異,而揮發(fā)油成分與TF相比差異顯著,所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)中去掉該組.在濃度梯度實(shí)驗(yàn)中,番石榴葉總黃酮和總皂苷對(duì)6-HB的抑制也表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系,IC50分別為3.9±1.3μg/mL,9.06±0.17μg/mL.進(jìn)一步的N-PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果確證了二者對(duì)gp41的作用,結(jié)果與ELISA一致,200μg/mL時(shí)與相同濃度的陽(yáng)性藥物TF的效果相近,通過(guò)對(duì)應(yīng)濃度的條帶,清楚的看到樣品量與抑制作用之間成正比關(guān)系. 3.細(xì)胞融合結(jié)果顯示,改造后TF1-4H,TF2A-4H,TF3-4H抑制細(xì)胞融合的活性比改造前的TF1,TF2A,TF3稍有增強(qiáng),都在相應(yīng)的微摩爾水平.TF1的IC50為14.63±1.40μM,TFl-4H的IC50為11.144±1.02μM.第二組TF2A的IC50為10.30±0.36μM,TF2A-4H的IC50為6.44±0.51μM.第三組TF3的IC50為8.14±0.21μM,TF3-4H的IC50為6.06±0.26μM.由于樣品量較少,沒(méi)有進(jìn)一步的考察細(xì)胞毒性.細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)中番石榴葉總黃酮和總皂苷都表現(xiàn)出一定的抑制活性,總皂苷的IC50為7.33±0.40μg/mL,總黃酮的IC50為5.3±1.3μg/mL.MTT實(shí)驗(yàn)顯示總黃酮產(chǎn)生的細(xì)胞毒性很小,半數(shù)致死濃度(concentration of 50% cytotoxicity, CC50)都在100μg/mL以上,總皂苷對(duì)CHO-WT和MT-2的CC50分別為46.86±1.27μg/mL和62.97±1.22μg/mL,統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示總皂苷在7.82μg/mL以下濃度時(shí)CHO-WT的生長(zhǎng)與對(duì)照組之間沒(méi)有顯著性差異(P>D.05),在25μg/mL以下MT-2的生長(zhǎng)與對(duì)照組之間沒(méi)有顯著性差異(PD.05). 結(jié)論: 1.茶多酚衍生物是文獻(xiàn)報(bào)道能對(duì)HIV感染的多個(gè)環(huán)節(jié)都有抑制效果的化合物,茶黃素衍生物低濃度時(shí)沒(méi)有表現(xiàn)出抑制CD4,趨化因子受體與gp120的相互作用卻表現(xiàn)出抑制gp41核心結(jié)構(gòu)6-HB形成的活性,且觀察發(fā)現(xiàn)化合物中含有沒(méi)食子?；谋炔缓幕钚院?含的個(gè)數(shù)越多活性越好,推測(cè)其活性可能是通過(guò)化合物自身帶的微弱的負(fù)電荷與靶點(diǎn)(如N末端574位的賴氨酸)的正電荷形成離子鍵實(shí)現(xiàn)的.茶多酚自身的多酚結(jié)構(gòu)使它具有上述活性,但是正因?yàn)楹卸鄠€(gè)酚羥基使化合物整體易氧化,不穩(wěn)定,且與相并的酚酮七元環(huán)一起形成一個(gè)大共軛體系使得化合物顏色較深,水溶性也不好.我們的研究通過(guò)對(duì)三個(gè)衍生物的酚酮七元環(huán)的雙鍵進(jìn)行還原,在不破壞酚羥基的前提下盡量減少生色基團(tuán),并對(duì)改造后的產(chǎn)物進(jìn)行體外活性檢測(cè).還原后化合物的顏色變淺,水溶性也增加了.ELISA, N-PAGE實(shí)驗(yàn)的結(jié)果都顯示改造后化合物表現(xiàn)出良好的抑制六螺旋束形成的活性.細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)顯示茶黃素衍生物表現(xiàn)出與文獻(xiàn)報(bào)道值相似的活性,結(jié)構(gòu)改造后的三個(gè)化合物活性比改造前還好,推測(cè)可能是因?yàn)楦脑旌蠡衔锼苄蕴岣?穩(wěn)定性增強(qiáng),且空間構(gòu)象也發(fā)生了一些變化,相同條件下到達(dá)靶位的有效濃度提高,更加有利于化合物與靶點(diǎn)的結(jié)合.這些結(jié)果既為進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)改造提供了方向又在化合物的作用機(jī)制研究方面提供了有力的證據(jù). 2.番石榴葉提取物總黃酮和總皂苷雖然是混合成分,但主要成分黃酮和皂苷含量都在55%以上.二者都能在很大范圍內(nèi)安全有效的抑制HIV-1包膜介導(dǎo)的細(xì)胞融合,這說(shuō)明二者可以在HIV的進(jìn)入階段起到抑制作用,且細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)證明在有效范圍內(nèi)樣品對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用.而靶向gp41的抗體免疫實(shí)驗(yàn)ELISA表明二個(gè)樣品都可以在微克每毫升的水平抑制gp41核心構(gòu)象6-HB的形成,該結(jié)果還被N-PAGE實(shí)驗(yàn)證實(shí),這說(shuō)明二者在進(jìn)入過(guò)程中的抑制作用可能是通過(guò)抑制了該過(guò)程中很重要的環(huán)節(jié)六股螺旋體的結(jié)構(gòu)形成來(lái)實(shí)現(xiàn)的. 第二章ADS-J1抑制HIV進(jìn)入的作用機(jī)制研

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網(wǎng)址: 天然來(lái)源化合物抗HIV的活性篩選和ADS http://m.u1s5d6.cn/newsview459832.html