脂肪氧化酶活性測定
各位同學(xué),本人前些日子做了脂肪氧化酶活性測定的工作,遇到了一些問題,想在這里向大家請教,希望大家能不吝賜教,來幫助我解脫心中的迷惑。
本人是做植物材料的,從葉片中提取粗蛋白,0.5g葉片使用液氮研磨,加入到4ml冰預(yù)冷提取緩沖液(0.05mol/L PH6.4 磷酸鈉緩沖液,1mmol/L EDTA,1%PVP,1mmol/LDTT)中,12,000g,4℃離心10min,取上清進行脂肪氧化酶酶活性分析。
通過檢測234nm光吸收(Beckman DU800, Beckman)來測定脂肪氧化酶活性,底物溶液配制:280mg亞油酸,280mgTween-20加入到8mL雙蒸水中,上下顛倒混勻,加入1mL 1mol/L NaOH使溶液澄清加雙蒸水定容到50mL,-70℃保存?zhèn)溆?Huang, et al. 2005)。
2mL反應(yīng)體系包括:1.93mL 0.1mol/L pH6.4 磷酸鈉緩沖液,50μL底物溶液,20μL酶粗提液,同時設(shè)立不加酶的空白對照,25℃反應(yīng)3min,記錄234nm光吸收變化。
實驗方法就是上面所說的,但是遇到了幾個問題。
1.在不加入粗蛋白的情況下,234nm光吸收持續(xù)上升,我覺得可能是亞油酸在空氣中氧化造成的,我又無力避免。
2.采用不同PH的緩沖液,不加粗蛋白的情況下,234nm光吸收上升的速率不同,PH越高234nm光吸收上升速率就越緩慢。
3.在加入粗蛋白后,234nm光吸收不升反降,在3分鐘后才又上升。
這樣一來我測酶活反應(yīng)基本不可能,我覺得可能是我測酶活的反應(yīng)體系出了問題,在測原核表達后的酶活性該體系還馬馬虎虎,在PH6.4時的確還是轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的粗蛋白脂肪氧化酶活性高些,但是從葉片中提取的粗蛋白就不能測出來酶活性了。
在后續(xù)的實驗我還想做酶反應(yīng)后的產(chǎn)物的HPLC分析,如此強的本底反應(yīng)讓我不知道還要不要做下去,我的方法是克隆一篇文獻的方法,這里我不是懷疑人家工作的真實性,我想可能還是我愚鈍。
[1] Huang YF, Lan WZ, Chen C, Yu LJ (2005) The role of lipoxygenase in elicitor-induced taxol production in Taxus chinensis cell cultures. Process Biochemistry 40:2793–2797
各位兄臺,給我出出主意吧,基因克隆出來,原核表達也還不錯,整個實驗卡在最后,雖然原核表達后有一些酶活性,但是總是覺得反應(yīng)體系不是很好,試驗不是很穩(wěn)定,想進一步做些酶學(xué)分析,這樣的體系真是不可靠。
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網(wǎng)址: 脂肪氧化酶活性測定 http://m.u1s5d6.cn/newsview343028.html
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