各位同學(xué)，本人前些日子做了脂肪氧化酶活性測定的工作，遇到了一些問題，想在這里向大家請教，希望大家能不吝賜教，來幫助我解脫心中的迷惑。

本人是做植物材料的，從葉片中提取粗蛋白，0.5g葉片使用液氮研磨，加入到4ml冰預(yù)冷提取緩沖液（0.05mol/L PH6.4 磷酸鈉緩沖液，1mmol/L EDTA，1%PVP，1mmol/LDTT）中，12，000g，4℃離心10min，取上清進行脂肪氧化酶酶活性分析。

通過檢測234nm光吸收（Beckman DU800, Beckman）來測定脂肪氧化酶活性，底物溶液配制：280mg亞油酸，280mgTween-20加入到8mL雙蒸水中，上下顛倒混勻，加入1mL 1mol/L NaOH使溶液澄清加雙蒸水定容到50mL，-70℃保存?zhèn)溆?Huang, et al. 2005)。

2mL反應(yīng)體系包括：1.93mL 0.1mol/L pH6.4 磷酸鈉緩沖液，50μL底物溶液，20μL酶粗提液，同時設(shè)立不加酶的空白對照，25℃反應(yīng)3min，記錄234nm光吸收變化。

實驗方法就是上面所說的，但是遇到了幾個問題。

1.在不加入粗蛋白的情況下，234nm光吸收持續(xù)上升，我覺得可能是亞油酸在空氣中氧化造成的，我又無力避免。

2.采用不同PH的緩沖液，不加粗蛋白的情況下，234nm光吸收上升的速率不同，PH越高234nm光吸收上升速率就越緩慢。

3.在加入粗蛋白后，234nm光吸收不升反降，在3分鐘后才又上升。

這樣一來我測酶活反應(yīng)基本不可能，我覺得可能是我測酶活的反應(yīng)體系出了問題，在測原核表達后的酶活性該體系還馬馬虎虎，在PH6.4時的確還是轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的粗蛋白脂肪氧化酶活性高些，但是從葉片中提取的粗蛋白就不能測出來酶活性了。

在后續(xù)的實驗我還想做酶反應(yīng)后的產(chǎn)物的HPLC分析，如此強的本底反應(yīng)讓我不知道還要不要做下去，我的方法是克隆一篇文獻的方法，這里我不是懷疑人家工作的真實性，我想可能還是我愚鈍。

[1] Huang YF, Lan WZ, Chen C, Yu LJ (2005) The role of lipoxygenase in elicitor-induced taxol production in Taxus chinensis cell cultures. Process Biochemistry 40:2793–2797

各位兄臺，給我出出主意吧，基因克隆出來，原核表達也還不錯，整個實驗卡在最后，雖然原核表達后有一些酶活性，但是總是覺得反應(yīng)體系不是很好，試驗不是很穩(wěn)定，想進一步做些酶學(xué)分析，這樣的體系真是不可靠。

相關(guān)知識

脂肪酸攝取和脂肪酸氧化
詳解脂肪酶減肥法：原理、優(yōu)勢與實施細節(jié)
細胞色素C氧化酶缺陷介紹、癥狀、病因、治療
運動與脂肪氧化動力學(xué)特征的應(yīng)用啟示
脂肪
湯其群/郭亮團隊發(fā)現(xiàn)促進脂肪燃燒的酶Cdo1，并解析其作用機制
衣物洗滌與健康生活：加酶洗衣粉篇
脂肪代謝
人體脂肪
脂肪肝

網(wǎng)址: 脂肪氧化酶活性測定 http://m.u1s5d6.cn/newsview343028.html