細(xì)菌基因組denovo測序相關(guān)的多組學(xué)聯(lián)合分析再添高分文章啦！派森諾生物與東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院李春艷老師攜手，再次在微生物基因組領(lǐng)域的《Journal of Hazardous Materials》（IF=10.588）發(fā)表研究成果！文章通過細(xì)菌完成圖+轉(zhuǎn)錄組+代謝組+實驗驗證，報道了莫氏芽孢桿菌XH1分泌的一種新的生物破乳草酸脫羧酶（OxdC），為OxdC作為一種新的遺傳資源在生物破乳中的應(yīng)用提供了新的視角。

研究背景

生物破乳具有低毒、可生物降解性、環(huán)境友好型和天然產(chǎn)物的特殊性質(zhì)等優(yōu)點，其在石化、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有著廣泛的應(yīng)用。目前常用的生物破乳劑主要是細(xì)胞壁或疏水表面的小分子，這些小分析生物破乳劑通常對W/O（油包水）乳狀液有良好的破乳效果，但對O/W(水包油)乳狀液的破乳效果不好。此外，細(xì)胞壁上的生物破乳劑還收到細(xì)胞生長和代謝的影響，一旦細(xì)胞死亡，這些分析就會失去破乳能力。一般老說，生物大分子破乳劑比小分子生物破乳劑表現(xiàn)出更好的增稠性、穩(wěn)定性和絮凝性。分子生物破乳劑的粘度越高，其吸附性能越好，油水界面上的吸附可以促進(jìn)破乳。本研究的莫氏芽孢桿菌XH1能夠分泌一種大分子生物破乳劑，但到目前為止，大分子生物破乳劑的研究還很少。

研究材料和方法

1.實驗設(shè)計

2.實驗材料：油田土壤中篩選得到的具有較高破乳效率的莫氏芽孢桿菌XH1一株

3.測序平臺：Illumina Miseq+Pacbio

4.分析內(nèi)容：細(xì)菌完成圖測序、轉(zhuǎn)錄組測序、代謝組測序、基因敲除與互補實驗、基因表達(dá)與蛋白質(zhì)純化實驗、酶活實驗等。

研究結(jié)果

為研究菌株XH1的生長和破乳效果，分別以葡萄糖和液體石蠟為唯一碳源，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以葡萄糖為唯一碳源時，菌株生長良好，但是發(fā)酵液幾乎沒有破乳能力；以液體石蠟為唯一碳源時，破乳率達(dá)94%，說明碳源的不同會影響菌株XH1生物破乳劑的合成，遂對該菌株的生物破乳劑合成過程中的差異進(jìn)行了研究。

對菌株XH1進(jìn)行基因組測序得到一條 4,203,618 bp的染色體，GC含量43.65%，基因預(yù)測總共得到4503個基因，在COG、GO、KEGG和Swissport數(shù)據(jù)庫中分別注釋到3060, 2617, 2306和3996個基因。注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn)：基因組中有和烴類降解相關(guān)的基因，另外因為該菌株長期存在與烴類環(huán)境中，其降解烴類化合物的能力被馴化，這一研究表明細(xì)菌降解烴類化合物除了和基因有關(guān)，還可馴化有關(guān)；除蛋白質(zhì)生物破乳劑外，還發(fā)現(xiàn)了脂肽輔助的破乳劑成分。對已知的具有破乳活性的菌株做比對發(fā)現(xiàn)，不同菌株產(chǎn)生的生物破乳劑的活性和種類均不盡相同，并且發(fā)現(xiàn)了對生物破乳劑的產(chǎn)生器決定性作用的---疏水烷烴的存在。

對菌株XH1進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，OxdC基因表達(dá)差異最明顯，最有可能是生物破乳相關(guān)的蛋白質(zhì)，其他幾種蛋白質(zhì)也參與了這個過程，如孢子相關(guān)蛋白和細(xì)胞內(nèi)蛋白。據(jù)報道，OxdC可以在沒有信號肽的情況下分泌到細(xì)胞外，并與烷烴代謝密切相關(guān)。為了進(jìn)一步驗證此結(jié)果，用硫酸銨對菌株XH1分泌的胞外蛋白進(jìn)行了純化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著硫酸銨的濃度增加胞外蛋白的破乳率也隨之增加，在鹽濃度為75%的時候獲得目的蛋白，代謝組研究結(jié)構(gòu)初步預(yù)測現(xiàn)有的蛋白OxdC是活性破乳蛋白之一。該蛋白由376AA組成，42,653bp，等電位點為5.16。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析，進(jìn)一步證實OxdC為破乳靶蛋白。轉(zhuǎn)化實驗和OxdC的敲除與互補實驗，則進(jìn)一步表明了OxdC參與了菌株XH1的烷烴代謝，OxdC是一種具有新功能的破乳蛋白。

為了進(jìn)一步研究OxdC的結(jié)構(gòu)和功能，做了如下研究：使用熱重分析（TGA）評估該蛋白具有良好的熱穩(wěn)定性；ProtScale分析蛋白的親水性和疏水性發(fā)現(xiàn)OxdC的表明疏水性相對較強(qiáng)；使用PyMOL對OxdC的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)Mn2+不僅通過與鄰近氨基酸的相互作用而穩(wěn)定，而且通過與兩個水分子形成氫鍵而保持穩(wěn)定，這可能屆時了OxdC具有破乳功能的原因。

因為菌株XH1在不同碳源下的破乳劑產(chǎn)生情況不一致，故分別對以葡萄糖和液體石蠟為唯一碳源時的代謝途徑進(jìn)行了比較。當(dāng)以液體石蠟為唯一碳源時，烷烴通過氧化轉(zhuǎn)化為醇、醛和酸，氧化脂肪酸進(jìn)入脂肪酸循環(huán)，經(jīng)β氧化生成乙酰輔酶A；乙酰輔酶A進(jìn)入三氯乙酸循環(huán)，生成草酰乙酸酯；草酰乙酸酯經(jīng)過乙醛酸和二元酸代謝，生成乙醛酸。草酰乙酸還可以通過乙醛酸氧化酶的活性直接水解生成OA，在酸性條件下生成OA脫羧酶(OxdC)，將OA降解為水和CO2。菌株XH1以葡萄糖為底物時pH相對穩(wěn)定，不產(chǎn)生OA或誘導(dǎo)OxdC產(chǎn)生，在這種情況下沒有破乳，而當(dāng)使用液體石蠟作為底物時，可以觀察到有效的破乳。

研究結(jié)論

本研究報道了莫氏芽孢桿菌XH1分泌的一種新的生物破乳草酸脫羧酶(OxdC)，全基因組比較表明，具有較高破乳效率的菌株均具有烷烴降解基因。對不同底物誘導(dǎo)的差異表達(dá)基因和蛋白的分析表明，XH1分泌的OxdC是一種有效的破乳劑。并通過原核基因表達(dá)、基因敲除和互補分析驗證了其破乳能力。XH1的OxdC具有較強(qiáng)的破乳能力，其破乳能力明顯優(yōu)于模式蛋白枯草芽孢桿菌168OxdC(Yvrk)。通過對其結(jié)構(gòu)特征的比較，確定OxdC表面的疏水氨基酸是XH1良好破乳活性的關(guān)鍵因素。XH1的代謝途徑以液體石蠟和葡萄糖為底物，說明碳?xì)浠衔锸巧锲迫閯┓置谒匦璧摹＿@一研究結(jié)果為XH1資源的開發(fā)利用提供了重要參考，不僅對石油污染治理有一定的參考價值，而且對食品、醫(yī)藥等行業(yè)也有一定的參考價值。因此，具有廣泛的生態(tài)、社會效益和經(jīng)濟(jì)效益和應(yīng)用前景。

本研究的細(xì)菌完成圖測序和數(shù)據(jù)分析工作由上海派森諾生物科技有限公司完成。

文章索引：Hou, Ning & Wang, Qiaoruo & Sun, Yang & Li, Xianyue & Song, Qiuying & Jiang, Xinxin & Li, Baoxin & Zhao, Xinyue & Zang, Hailian & Li, Dapeng & Li, Chunyan. (2021). A novel biodemulsifier of Bacillus mojavensis XH1–Oxalate decarboxylase with the potential for demulsification of oilfield emulsion. Journal of Hazardous Materials. 407. 124737. 10.1016/j.jhazmat.2020.124737.

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