最新研究表明對免疫細胞的適當調(diào)節(jié)，有助于理解其代謝途徑及代謝異常時引發(fā)免疫功能紊亂和疾病發(fā)展的機制。當前，這種理解還受限于對免疫細胞群的分析。單細胞應(yīng)用技術(shù)，可評估臨床樣本中單個免疫細胞的代謝狀態(tài)，有助于推動免疫代謝領(lǐng)域的發(fā)展和提高疾病診斷能力。2020年10月Artyomov等人在《Cell Metabolism》雜志上發(fā)表了一篇名為“Immunometabolism in the Single-Cell Era”的綜述，回顧了單細胞應(yīng)用技術(shù)及其驗證免疫代謝的通用原則，概述了免疫細胞的代謝異質(zhì)性，并討論了當前免疫技術(shù)的局限性及未來的探索方向，現(xiàn)介紹如下：

背景  

新陳代謝是生物過程的核心。研究表明，免疫細胞的代謝途徑與特定免疫功能與健康或疾病下的細胞狀態(tài)密切相關(guān)。癌癥和慢性炎癥代謝性疾病的發(fā)生與機體核心代謝途徑的失調(diào)有關(guān)，但基于疾病的復雜性和細胞表型的多樣性，目前對致病環(huán)境中的免疫代謝重塑尚缺乏整體理解。

機體的營養(yǎng)水平、氧氣供應(yīng)量等改變和信號分子及鄰近細胞的相互作用均可誘導代謝發(fā)生改變。細胞微環(huán)境的獨特性使體內(nèi)細胞在新陳代謝、細胞表型和免疫功能上均不完全相同。在單細胞分辨率下，解決免疫代謝的時空異質(zhì)性并闡明機理將有助于推動免疫代謝領(lǐng)域的不斷發(fā)展。單細胞圖譜分析技術(shù)有助于幫助理解細胞代謝與免疫調(diào)節(jié)和疾病進展的機制，能闡明免疫細胞代謝轉(zhuǎn)化為效應(yīng)表型的軌跡。 

常見的bulk代謝分析   細胞外通量分析  

細胞外通量分析儀如Seahorse apparatus，通過動態(tài)記錄細胞外酸化率(ECAR) 和耗氧率(OCR)可提供糖酵解和線粒體呼吸相關(guān)的核心數(shù)據(jù)。應(yīng)用特定底物和抑制劑可探究細胞對葡萄糖、谷氨酰胺或脂肪酸的相對偏好。目前的Seahorse 分析技術(shù)可簡單、快速地以96孔方式對細胞進行分析，極大擴展了免疫代謝的研究視野，但該技術(shù)無法提供有關(guān)糖酵解和線粒體內(nèi)三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）以外代謝途徑的詳細信息。應(yīng)用Seahorse 分析，有學者發(fā)現(xiàn)炎癥巨噬細胞中的糖酵解開關(guān)與線粒體功能障礙、效應(yīng)T細胞和活化樹突狀細胞(DCs)糖酵解的增加及記憶性T細胞和IL-4活化巨噬細胞的線粒體呼吸增強有關(guān)。ECAR是糖酵解的替代標記，但培養(yǎng)基酸化不一定是糖酵解增強的結(jié)果，線粒體生成的二氧化碳或細胞外TCA循環(huán)代謝中間物也可使培養(yǎng)基酸化。

穩(wěn)態(tài)代謝組學  

在特定時間點，代謝組學通過液相或氣相色譜-質(zhì)譜(LC-MS或GC-MS)可測量一系列代謝物的穩(wěn)態(tài)濃度。非靶向代謝組學測量生物樣本中的數(shù)百種代謝物，而靶向代謝組學則可預先評估代謝物并提供更具靈敏度的數(shù)據(jù)，以實現(xiàn)對代謝物濃度的精確定量?；贛S的方法需要較高的輸入通量(一般為10萬個細胞)，最新研究提出的單細胞分辨率空間測量代謝物的技術(shù)方法，把單細胞技術(shù)與基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)-質(zhì)譜成像和二次離子質(zhì)譜(SIMS)相結(jié)合，有助于探索體內(nèi)組織微環(huán)境中單細胞的免疫代謝過程。

 通量組學  

特定代謝途徑的通量變化與該途徑內(nèi)特定時間點測定的代謝物濃度不一定直接相關(guān)。通過靶向質(zhì)譜在連續(xù)時間點對底物和同位素13C或15N測量，可明確代謝通量和代謝途徑動力學。單細胞代謝譜分析技術(shù)針對不同代謝蛋白可提供一些免疫代謝信息。

關(guān)鍵的免疫代謝概念   糖酵解解析多種免疫效應(yīng)功能  

免疫活化是糖酵解通量增加的耗能過程，此過程中機體利用葡萄糖轉(zhuǎn)運體攝取葡萄糖(如GLUT1)后轉(zhuǎn)化為丙酮酸，將NAD+還原為NADH并生成ATP。糖酵解酶如己糖激酶1和2 (HK1和HK2)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、烯醇化酶和丙酮酸激酶同工酶M2 (PKM2)均可抑制細胞免疫功能。在無氧狀態(tài)下，細胞通過乳酸脫氫酶(LDH)將丙酮酸還原為乳酸以維持糖酵解通量。Seahorse 分析中，質(zhì)子和糖酵解衍生的乳酸可通過單羧酸轉(zhuǎn)運體MCT1從細胞中輸出時，這種發(fā)酵反應(yīng)稱為ECAR。糖酵解在炎癥免疫效應(yīng)細胞中最為活躍，對多種免疫細胞的活化模式至關(guān)重要且糖酵解率在B淋巴細胞和T淋巴細胞之間表現(xiàn)不同。

磷酸戊糖途徑在炎性髓細胞中尤為重要  

磷酸戊糖途徑（PPP）是機體利用葡萄糖直接氧化脫氫脫羧生成NADPH及中間產(chǎn)物為其他物質(zhì)合成提供原料的過程，G6P脫氫酶為該途徑限速酶，生成的NADPH在免疫細胞中有多種生物學效應(yīng)。中性粒細胞和炎癥巨噬細胞可利用PPP及NADPH產(chǎn)生活性氧(ROS)發(fā)揮抗感染作用。NADPH還可作為抗氧化劑防止組織細胞的過度損傷。

TCA循環(huán)和ETC為代謝的核心樞紐  

TCA循環(huán)和線粒體電子傳遞鏈(ETC)生成的能量對機體代謝至關(guān)重要。與糖酵解相比，OXPHOS生成能量更有效且與體內(nèi)免疫細胞的壽命有關(guān)。在巨噬細胞促炎活化過程中，TCA循環(huán)通過下調(diào)IDH和SDH活性而被重構(gòu)，后者通過活化髓細胞中ACOD1/IRG1產(chǎn)生特異性免疫調(diào)節(jié)代謝物衣康酸直接抑制而實現(xiàn)。 

脂肪酸代謝支持免疫細胞的表型和功能    

脂肪酸氧化(FAO)是肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1和2 (CPT1和CPT2)將長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運到線粒體基質(zhì)后經(jīng)羥?；o酶a氧化為乙酰輔酶a、NADH和FADH2并生成能量的過程。高濃度的CPT1抑制劑依托莫西實驗表明FAO在IL-4誘導的巨噬細胞、記憶性T細胞和調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）中尤為重要。然而，最近對CPT1和CPT2應(yīng)用細胞特異性基因敲除的文獻報道表明，F(xiàn)AO在此過程中很少。

與FAO相反，F(xiàn)AS是乙酰輔酶a羧化酶(ACC)將乙酰輔酶a羧化為丙二酰輔酶a，后脂肪酸合酶(FASN)將丙二酰輔酶a延長為脂質(zhì)的合成過程。FAS支持效應(yīng)T細胞增殖，是配置巨噬細胞炎癥信號的質(zhì)膜的關(guān)鍵，也是促進活化的DCs分泌細胞因子的關(guān)鍵。

不同免疫細胞間氨基酸代謝率存在差異  

T細胞免疫活化與氨基酸代謝需求增加相關(guān)，如Ⅰ型氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白1 (LAT1、CD98和SLC7A5)及TCR對信號轉(zhuǎn)導的絲氨酸途徑尤為重要。氨基酸在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的特定方向也發(fā)揮一定作用，如Th1和Th17細胞通過轉(zhuǎn)運蛋白ASCT2可增加谷氨酰胺用量應(yīng)對抗原刺激，抗炎Treg則不受谷氨酰胺供應(yīng)改變的影響。谷氨酰胺酶(GLS)將谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸為TCA循環(huán)提供燃料，該途徑可促進Th17分化，同時降低Th1和細胞毒性T淋巴細胞的分化程度。   

氨基酸在炎性巨噬細胞中也有重要的調(diào)節(jié)功能。谷氨酰胺代謝與抗炎極化有關(guān)，絲氨酸代謝與IL-1b的產(chǎn)生有關(guān)。此外，氨基酸可促使巨噬細胞產(chǎn)生效應(yīng)分子。LPS(+IFNγ)誘導的巨噬細胞主要通過誘導NO合成酶(iNOS)將精氨酸轉(zhuǎn)化為一氧化氮(NO)，IL-4誘導的巨噬細胞則主要將精氨酸代謝為鳥氨酸和多胺。

現(xiàn)有細胞技術(shù)的局限性   從體外培養(yǎng)到體內(nèi)驗證的必要性  

鑒于組織微環(huán)境的重要性，實驗室體外培養(yǎng)的細胞免疫代謝途徑明顯不同于體內(nèi)細胞。在小鼠中應(yīng)用13C-葡萄糖輸注方法研究CD8+T細胞對李斯特菌感染的代謝，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)活化的T細胞代謝狀態(tài)與體外培養(yǎng)的細胞不同，體外培養(yǎng)的T細胞在活化過程中，CD8+T細胞從OXPHOS途徑向糖酵解轉(zhuǎn)變，體內(nèi)活化的CD8+T細胞則顯示出更高的耗氧率并依靠葡萄糖依賴的絲氨酸生物合成過程。由于動物模型有其自身局限性且不能完全復制人體免疫學和生物學特征，因此將體外培養(yǎng)細胞的免疫細胞代謝技術(shù)引用到人體中的轉(zhuǎn)換尤為重要。

免疫代謝的時空異質(zhì)性尤為重要  

免疫細胞代謝依賴于營養(yǎng)物質(zhì)的供給，營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)因細胞在腫瘤或炎癥部位微環(huán)境中的位置不同而有差別。在單細胞分辨率下了解細胞代謝狀態(tài)可解釋體內(nèi)復雜組織微環(huán)境中免疫細胞表型異質(zhì)性的分子機制，有助于解釋其在病理環(huán)境下不能正常發(fā)揮功能的原因。最近的轉(zhuǎn)錄和成像技術(shù)可解決單細胞甚至其代謝物的空間排列問題，該技術(shù)的進步對了解人體樣本和體內(nèi)環(huán)境中的免疫代謝重構(gòu)至關(guān)重要。時空異質(zhì)性是免疫代謝領(lǐng)域常被忽視的問題。多數(shù)免疫細胞在活化后糖酵解迅速增強使代謝通量增加。理解免疫代謝的時空異質(zhì)性不僅有助于更新基礎(chǔ)生物學知識，也有助于設(shè)計新的合理的治療方法。

通量的限制  

免疫代謝研究中，常用的（bulk）分析技術(shù)的局限性可解釋從體外到體內(nèi)轉(zhuǎn)化和從動物到人體的驗證難題。代謝組學和細胞外通量分析需要較高的細胞數(shù)量，在人類臨床樣本中通常難以實現(xiàn)。如Seahorse 分析XF分析儀測量每孔中數(shù)萬到數(shù)十萬個細胞的細胞外通量時只需4-5個復制孔。對于代謝組學，則通常需要測量復制的50萬個混合細胞，通過此技術(shù)獲得的代謝信息有限。細胞外通量分析和傳統(tǒng)代謝組學的另一缺點是其評估的代謝特征具有不穩(wěn)定性，結(jié)果受分析時長和熒光活化的細胞分選儀影響。因此，需要新的代謝譜分析方法及新的、優(yōu)化的細胞分離方法來測量體外特殊免疫細胞的穩(wěn)定代謝特征。

利用不同的組學方法可進行間接代謝評估  

代謝組學與轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學等技術(shù)相結(jié)合，可部分解決代謝物水平不穩(wěn)定性難題。代謝通量可視為代謝物水平和代謝酶活性的結(jié)果。轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學可為代謝途徑的調(diào)控提供一些見解，當與代謝組學數(shù)據(jù)整合時變得更加強大。利用網(wǎng)絡(luò)整合方法，結(jié)合代謝組學和轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)已證明含脂巨噬細胞中PPP與炎癥反應(yīng)程度有關(guān)。蛋白質(zhì)組學和代謝組學的整合則揭示了T細胞活化的代謝需求。

目前單細胞代謝組學的大規(guī)模應(yīng)用還為時過早，免疫代謝研究進入單細胞時代還需要尋找新的方法。先前使用群細胞轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學描述細胞代謝的成功表明，單細胞組學技術(shù)將是未來的探索方向。

單細胞RNA測序(scRNA-seq)的出現(xiàn)使得在復雜的多細胞生態(tài)系統(tǒng)中解析單個細胞轉(zhuǎn)錄譜成為可能。應(yīng)用10x基因組學管道，scRNA-seq實驗每樣本中多達1萬個細胞，可常規(guī)檢測每個細胞2到4千個基因。即使在免疫學背景下直接檢測scRNA-seq數(shù)據(jù)，也可發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)的核心代謝過程。

細胞群轉(zhuǎn)錄分析可提供細胞序列在轉(zhuǎn)錄水平內(nèi)的詳盡信息。細胞信號的缺失通常意味著相應(yīng)轉(zhuǎn)錄本的缺失。轉(zhuǎn)錄譜分析優(yōu)勢在scRNA-seq數(shù)據(jù)中并不顯著。每個細胞25000-50000次讀取的常規(guī)測序深度，可檢測3000-4000個基因。淺層測序(即檢測每個細胞大約1000個基因)能發(fā)現(xiàn)大多數(shù)普通和管家基因。然而，即使每個細胞檢測出3000 - 4000個基因，也明顯低于基于RNA-seq技術(shù)純化的細胞群中的12000-15000個基因表達提供的信息豐富。此種情況下，須使用數(shù)據(jù)歸因等技術(shù)對數(shù)據(jù)進行后處理而獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄譜。在相同的scRNA-seq數(shù)據(jù)集中，不同細胞群每個細胞RNA的含量不同使得不同細胞間信息覆蓋不均勻。用于scRNA-seq數(shù)據(jù)代謝分析的方法可大致分為兩大類:(1)基于路徑的分析方法；(2)基于通量平衡分析(FBA)的方法。

（1）基于路徑的分析方法  

使用標準生物技術(shù)直接作為基因集進行探測信息途徑富集技術(shù)可對構(gòu)成不同代謝途徑的基因進行很好的注釋，如根據(jù)已發(fā)表的大量RNA-seq數(shù)據(jù)庫中對該途徑轉(zhuǎn)錄富集的初步觀察，研究了T細胞中絲氨酸代謝的作用。 

（2）基于通量平衡的分析方法  

FBA是一種計算系統(tǒng)中代謝通量穩(wěn)態(tài)分布的方法。簡單地說，F(xiàn)BA將細胞內(nèi)的代謝視為一個輸入輸出水龍頭數(shù)量有限的管道系統(tǒng)，要求系統(tǒng)的每個節(jié)點都建立穩(wěn)態(tài)平衡。單個酶的特異性表達水平并不直接參與建模，透視圖的結(jié)果主要依賴于網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)和模型的輸入和輸出。輸入通常是最常見的底物攝取反應(yīng)(如葡萄糖，谷氨酰胺)，輸出(通常稱為目標函數(shù))與被研究的特定細胞行為相關(guān)。

基于FBA方法的優(yōu)勢在于其依賴于網(wǎng)絡(luò)分析，而不與預先定義的通路知識相關(guān)聯(lián)，這可揭示新的生物學概念以了解隨著網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)的變化而發(fā)生的代謝通量變化。此前，大量數(shù)據(jù)采用此法揭示了衣康酸作為SDH抑制劑的作用。最近，該方法被引入到scRNA-seq數(shù)據(jù)中，以研究致病性/非致病性Th17細胞的代謝差異及與Tregs的差異。

當前方法通常關(guān)注不同細胞群之間的差異。在這些情況下，更直接的方法是簡單地進行兩個種群之間的差異表達分析，并執(zhí)行通路富集分析或代謝網(wǎng)絡(luò)分析。未來的代謝scRNAseq分析方法有望揭示獨立于細胞本身分配的主要代謝變異。雖然目前在所有代謝基因的空間中簡單地進行這種聚類或使用注釋的代謝途徑作為主要成分是可行的，但最強大的聚類方法在沒有單細胞途徑先驗知識的情況下結(jié)合基于網(wǎng)絡(luò)的分析依然是困難的。

基于蛋白質(zhì)的單細胞代謝分析   通過流式細胞儀檢測單細胞代謝譜  

雖然單細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的非靶向分析仍處于初級階段且尚未應(yīng)用于免疫代謝研究，但最近文獻顯示使用大量細胞計數(shù)(CyTOF)可估計單細胞內(nèi)酶的代謝配置。

設(shè)計一個免疫代謝CyTOFpanel，根據(jù)免疫細胞譜系標記物的表達模式識別出不同的免疫細胞亞群后，可估計和比較所有免疫細胞亞群的代謝狀態(tài)，而不需要預先分類。通過流式細胞術(shù)獲得的代謝狀態(tài)譜與所描述的在特定免疫功能中的作用一致，例如在DCs中高表達葡萄糖和脂肪酸代謝相關(guān)的靶標及在中性粒細胞中高表達的PPP限速酶G6PD。已經(jīng)證明Seahorse 分析測量的T細胞代謝變化與蛋白水平上單細胞分辨率觀察到的變化高度一致，表明基于CyTOF的單細胞代謝譜可通過測量細胞群建立的代謝重構(gòu)獲得新的見解。

免疫代謝CyTOF在體外環(huán)境中的應(yīng)用  

通過比較大腸癌患者的腫瘤和健康組織及健康供者外周血單核細胞和淋巴結(jié)，發(fā)現(xiàn)腫瘤相關(guān)CD8+T細胞富集的特定代謝表型，這些細胞顯示出大型中性氨基酸轉(zhuǎn)運體1 (LAT1, CD98)表達增加，而不同代謝途徑中多種酶的表達減少。一小部分細胞亞群不表達PD1或CD39，這表明結(jié)合代謝和免疫細胞標記將在定義細胞表型和功能上與人類疾病有關(guān)的腫瘤相關(guān)免疫細胞上提供額外維度。

基于細胞因子的代謝譜在動物模型中的應(yīng)用  

除人類樣本，代謝細胞的panel可用于獲取動物模型體內(nèi)的代謝重塑信息。有研究將單核增生李斯特菌感染期間T細胞反應(yīng)的基于CyTOF代謝譜作為CD8T細胞分化的模型。事實上，效應(yīng)T細胞顯示的糖酵解活性的預期增加可通過CyTOF分析中的GLUT1和GAPDH誘導得到證實。相反，記憶T細胞表現(xiàn)出CPT1a的誘導與CD8記憶T細胞相關(guān)。這種代謝重組可在單細胞分辨率下被發(fā)現(xiàn)，其代謝特征包括活化后早期的糖酵解開關(guān)與活化的異質(zhì)GAPDH表達相關(guān)。

Met-Flow:流式細胞儀測定單細胞代謝譜  

通過使用熒光標記抗體代替重金屬耦聯(lián)抗體，可分析單細胞代謝譜。Met-Flow以流式細胞術(shù)為基礎(chǔ)，使用10種熒光染料共軛門控抗體，針對不同代謝途徑中的限速酶和關(guān)鍵蛋白，結(jié)合細胞表型標記，生成27色流式細胞術(shù)panel以檢測免疫細胞的代謝狀態(tài)。有研究表明使用針對與特定免疫效應(yīng)功能相結(jié)合的關(guān)鍵代謝酶的抗體來擴展傳統(tǒng)細胞檢測panel可能更有益。使用相對較小的細胞檢測panel包括一些代謝抗體，可為進一步分析免疫細胞的表型、功能和代謝提供大量信息。

值得注意的是，Met-Flow僅通過scRNA-seq分析識別了10種代謝蛋白，其分辨率可與500個基因的分辨率相比較，而單獨分析這10種蛋白的表達并不能解析免疫群體。此外，Met-Flow證實了T細胞激活時糖酵解、OXPHOS和FAS的上調(diào)，這種代謝重組可被細胞外通量分析所證實。新的單細胞Met-Flow分析表明，大多數(shù)細胞依賴于葡萄糖來進行代謝轉(zhuǎn)換，因此單細胞代謝圖譜能夠識別特定的代謝特征及單個T細胞亞群的需求。

與此同時，兩種方法測定的細胞數(shù)量不同，目前每個樣本的scRNA-seq被限制在大約10000個細胞，而流式細胞術(shù)可常規(guī)處理數(shù)百萬個細胞。此外，單細胞轉(zhuǎn)錄譜分析成本幾乎比流式細胞術(shù)運行的成本高一個數(shù)量級，但scRNA-seq對細胞形態(tài)變化更敏感。許多細胞類型由于細胞形狀和儀器設(shè)計的不兼容性而不能精確地描述。

另一方面，轉(zhuǎn)錄分析的顯著優(yōu)勢在基于單核RNA-seq的利用。應(yīng)用此方法可分離單細胞并繪制相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄譜。該技術(shù)避免了形態(tài)學的影響，允許對冷凍樣本進行分析，包括多年前已經(jīng)保存在生物庫中的樣本，從而開啟了從臨床樣本中研究群細胞的能力。

總之，在受控實驗設(shè)計的設(shè)置中，主張采用組合方法，在有限的規(guī)模上應(yīng)用scRNA-seq，以探索復雜的代謝變化情況，然后使用假設(shè)驅(qū)動的抗體panel在蛋白質(zhì)水平進行大規(guī)模的細胞分析驗證。

單細胞代謝組技術(shù)的優(yōu)點和缺點   流式細胞術(shù)在單細胞免疫代謝研究中的應(yīng)用  

流式細胞術(shù)是分析免疫細胞最常用的方法，但受限于熒光溢出使其可同時測試的參數(shù)數(shù)量相對有限。與熒光探測器不同，CyTOF使用mass cytometer來檢測每一種金屬的質(zhì)量，其檢測重疊和背景量(流式細胞術(shù)中的自體熒光)均很低。設(shè)計理想的CyTOFpanel以減少“熒光溢出”并考慮不同金屬信號強度的差異仍然是該技術(shù)的關(guān)鍵。雖然在流式細胞術(shù)中需要快速獲得染色細胞以防熒光漂白，但金屬標記的樣本可在低溫條件下保存數(shù)周并可在臨床試驗期間通過收集樣本獲得。

光譜分析儀正在推動流式細胞術(shù)的發(fā)展。使用5種激光來檢測64通道的全發(fā)射光譜，能夠以靈敏、快速和可訪問的方式檢測30多種顏色，可將針對代謝蛋白和免疫譜系標記的熒光標記抗體與熒光代謝工具結(jié)合起來，提供額外的代謝信息，對免疫代謝研究尤為重要。

免疫代謝的空間解決方案   MIBI-TOF作為基于蛋白質(zhì)的空間單細胞免疫代謝分析技術(shù)  

有研究將其建立的CyTOF panel轉(zhuǎn)移到多路離子束成像(MIBI-TOF)平臺，為空間代謝譜研究方面邁出了重要一步。這種最近開發(fā)的方法將單細胞代謝譜、免疫細胞表型和功能狀態(tài)結(jié)合到細胞間相互作用的微環(huán)境中，其優(yōu)勢在于通過MIBI-TOF獲得包括空間信息在內(nèi)的高維數(shù)據(jù)。

細胞群在微環(huán)境中其代謝譜具有相似的代謝特征。在表達高水平與糖酵解相關(guān)代謝因子的細胞中，線粒體呼吸或氨基酸代謝經(jīng)常被表達相同代謝目標的鄰近細胞包圍。在比較鄰近腫瘤邊界和遠離腫瘤邊界細胞的免疫代謝譜時發(fā)現(xiàn)微環(huán)境驅(qū)動的代謝極化尤為明顯。通常，代謝受抑的細胞離腫瘤邊界較遠而代謝活躍的細胞位于腫瘤免疫邊緣。MIBI-TOF方法可在從生物樣本庫獲得的FFPE材料上進行，這將提供免疫代謝譜、細胞微環(huán)境與臨床療效相聯(lián)系起來的可能。因此，單細胞代謝圖譜是將免疫代謝研究轉(zhuǎn)化為臨床診斷和治療的重要進步。

利用脫氫酶活性測定原位微環(huán)境中的代謝圖譜  

有學者提出利用脫氫酶活性可測定原位微環(huán)境中的代謝圖譜。對催化核心代謝途徑關(guān)鍵步驟的五種酶活性進行測定:PPP中的G6PD，糖酵解中的GAPDH，乳酸發(fā)酵中的LDH以及TCA循環(huán)中的IDH和SDH，當這些脫氫酶活躍時，NAD(P)H可將硝基藍四氮唑氯(NBT)還原為一種可定量的強著色狀態(tài)并與連續(xù)切片上獲得性免疫細胞標記物的表達有關(guān)。腫瘤內(nèi)產(chǎn)生IL-6和TNF的巨噬細胞與TME內(nèi)的非炎性巨噬細胞相比，糖酵解GADPH活性增加，但與健康組織的巨噬細胞相比，整體腫瘤相關(guān)巨噬細胞則表現(xiàn)出代謝抑制，因此推測腫瘤中巨噬細胞代謝適應(yīng)性受損可能會降低其抗腫瘤活性。此外，與健康組織中的Tregs相比，腫瘤環(huán)境中的Tregs則表現(xiàn)出糖酵解GAPDH活性被抑制、線粒體SDH增加等代謝特征。識別這種腫瘤特異性的免疫細胞亞群代謝特性有助于開發(fā)新的治療方法。

“論腫道麻”述評

從單細胞水平上理解免疫代謝技術(shù)轉(zhuǎn)型是研究免疫代謝的主流趨勢。如前所述，特定的細胞代謝特征可通過scRNA-seq譜技術(shù)獲得，甚至可通過混合細胞培養(yǎng)/大量體外樣本經(jīng)過特定的蛋白靶向板進行解剖分析獲取。雖然CyTOF和scRNA-seq等方法可對不同細胞亞群的代謝重構(gòu)提供重要信息，但這些方法獲取的數(shù)據(jù)仍然是間接、有限的。提高單細胞測量深度和質(zhì)量的數(shù)據(jù)分析能力及有效解決免疫細胞的時空異質(zhì)性特性是未來免疫代謝領(lǐng)域研究需要攻克的方向。

未來研究中，需要探索出對單細胞代謝物進行直接分析的方法技術(shù)，此種方法不僅要實現(xiàn)對代謝物濃度的直接測量，也需要在單細胞水平提供通量組學信息?？紤]到代謝組學的不穩(wěn)定性及分離細胞可能產(chǎn)生偏差的事實，單細胞代謝組學可能不在于測量懸浮分離細胞中的代謝物，而是利用基于MS的成像方法來從空間上解析組織微環(huán)境中單細胞的代謝配置難題。

機體細胞是高度分隔的結(jié)構(gòu)，不同亞細胞微環(huán)境中分布著不同生物學功能的代謝物，因此單細胞分辨技術(shù)不是免疫代謝領(lǐng)域研究的最終階段。提高代謝讀數(shù)的亞細胞分辨率將為免疫代謝領(lǐng)域提供一個嶄新層面。在互補組學分析背景下，通過CITE-seq方法實現(xiàn)蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄組水平的融合在免疫代謝領(lǐng)域具有重要前景。鑒于當前對免疫代謝調(diào)節(jié)的理解是通過體外高度調(diào)控的環(huán)境獲得，針對體內(nèi)表型的代謝干預設(shè)計仍依賴于現(xiàn)有知識儲備。了解群細胞免疫代謝重塑的基本原理將有助于從影響關(guān)鍵細胞代謝通路中獲取關(guān)鍵信息，為治療疾病提供新的見解及方法。

總之，免疫代謝發(fā)展為一門系統(tǒng)科學還需要多學科的專業(yè)知識及新技術(shù)來解決研究中的一些難題。為成功過渡到單細胞免疫代謝時代，提高免疫數(shù)據(jù)分析及檢驗免疫學在體內(nèi)和體外的可用性、可交互性方面都尤為重要。

編譯：石平；述評：翁梅琳   審校：張軍，繆長虹 參考文獻：   Artyomov MN, Van den Bossche J. Immunometabolism in the Single-Cell Era.    Cell Metab   . 2020;32(5):710-725.    

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