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導(dǎo)讀

鎘(Cd)是Ⅰ類致癌物質(zhì)，可引起包括腸道在內(nèi)的多種器官的損傷。滿足日益增長(zhǎng)的對(duì)Cd誘導(dǎo)損傷的有效治療需求并研究其機(jī)制具有重要意義。金針菇(Flammulina velutipes)是一種受歡迎的食用菌，盡管已知金針菇有多種健康益處，但對(duì)其多糖(FVP)對(duì)CdCl2引起的腸道損傷的作用知之甚少。本研究通過(guò)熱水提取(85℃)和乙醇沉淀法制備了FVP(糖醛酸，5.10%；甲基化程度，41.24%)。FVP含有八種主要單糖，且在低于139.73℃的溫度下表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性。FVP(100 mg/kg b.w.，灌胃4周)可減輕CdCl2(1.5 mg/kg b.w.，灌胃4周)引起的腸道炎癥和凋亡、腸道通透性改變和腸道屏障破壞。FVP增加了擬桿菌(Bacteroides)的豐度，降低了脫硫弧菌(Desulfovibrionales)和梭菌(Clostridium)的豐度。FVP還恢復(fù)了短鏈脂肪酸(SCFAs)的水平，包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸。相關(guān)性分析表明，F(xiàn)VP、腸道菌群、SCFAs、腸道屏障/細(xì)胞和腸道炎癥之間存在相互作用。FVP通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析的功能通路增強(qiáng)了腸道菌群的代謝功能。此外，F(xiàn)VP+CdCl2組小鼠的腸道微生物移植部分緩解了CdCl2引起的腸道損傷。因此，F(xiàn)VP可能是一種有效的治療劑，通過(guò)SCFA介導(dǎo)的腸道炎癥和腸道菌群相關(guān)能量代謝的調(diào)節(jié)，對(duì)抗CdCl2誘導(dǎo)的腸道損傷。該研究可能為開發(fā)預(yù)防CdCl2引起的損傷的替代策略開辟了新的途徑。  

圖文摘要    

論文ID

原名：

Flammulina velutipes polysaccharide counteracts cadmium-induced gut injury in mice via modulating gut inflammation, gut microbiota and intestinal barrier

譯名：

金針菇多糖通過(guò)調(diào)節(jié)腸道炎癥、腸道菌群和腸道屏障來(lái)抑制鎘誘導(dǎo)的小鼠腸道損傷

期刊：

Science of the Total Environment

IF：

10.753

發(fā)表時(shí)間：

2023.3

通訊作者：

李大鵬，Dongxiao Sun-Waterhouse

通訊作者單位：

山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院

DOI號(hào)：

10.1016/j.scitotenv.2023.162910

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

結(jié)果

1、FVP的理化特性

本研究首先優(yōu)化了提取FVP的條件(圖S1)。FVP提取的最佳參數(shù)為：物料-提取液比：1:35(g:L)，提取溫度91°C，提取時(shí)間2 h(表S1)。在最佳提取條件下，F(xiàn)VP的提取率為3.74%(以金針菇干基計(jì))。FVP的總糖含量為94.87%，糖醛酸含量為5.10%，DM為41.24%，蛋白質(zhì)含量為3.87%(均為干基；表S2)。

GPC色譜圖(圖1A)顯示在11分鐘和14分鐘分別有兩個(gè)陽(yáng)性峰，表明FVP含有兩個(gè)基于多糖的組分。第一個(gè)峰出現(xiàn)在大約11 min，估計(jì)分子量為663,792 Da。第二個(gè)峰出現(xiàn)在大約14 min，較窄較高，估計(jì)分子量為24,670 Da。如圖1B和1C所示，F(xiàn)VP由七種中性單糖Man、Rib、Glc、Gal、Xyl、Ara和Fuc以及一種酸性單糖GlcA組成，它們的摩爾比為7.06:0.59:72.02:14.15:1.39:0.06:4.15:0.59。Glc的比例遠(yuǎn)高于其他單糖，Man、Gal和Fuc的含量也很高，因此FVP是一種雜多糖。

圖1. FVP的色譜圖、分子量以及單糖組成：(A) FVP組分的色譜圖和分子量；(B)單糖標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜圖；(C) FVP的氣相色譜圖。

2、FVP的光譜特性及熱穩(wěn)定性分析

根據(jù)200-800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的紫外光譜(圖2A)顯示，在260 nm處只有一個(gè)非常弱的吸收峰，表明FVP可能含有微量的核酸和/或蛋白質(zhì)/肽。核酸在240-275 nm區(qū)域吸收，是由于嘧啶和嘌呤環(huán)系統(tǒng)的π→π*躍遷，而酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸在240-300 nm處表現(xiàn)出強(qiáng)烈吸收，兩個(gè)半胱氨酸分子之間形成的二硫鍵在260 nm附近也有吸收。這個(gè)結(jié)果表明，本研究中使用Sevag法去除蛋白質(zhì)和使用微孔樹脂純化過(guò)程是相當(dāng)有效的。大孔樹脂純化曲線如圖S2所示。據(jù)報(bào)道，從黃色或白色金針菇制備的多糖樣品含有糖蛋白和/或多糖-蛋白復(fù)合物。FVP的FT-IR光譜(圖2B)證明，F(xiàn)VP含有糖醛酸殘基、β-糖苷鍵(β-1,4鍵)、吡喃糖環(huán)和/或硫酸化芳香環(huán)。 TG曲線(圖2C)和DTG曲線(圖2D)顯示了FVP的熱力學(xué)特性，包括熱穩(wěn)定性。

FVP的重量損失經(jīng)歷了大約五個(gè)階段。在第一階段(30-147℃)期間，由于揮發(fā)物和水的蒸發(fā)，導(dǎo)致了10％的重量損失。第二階段(146.57-240℃)期間重量幾乎沒(méi)有變化。在第三階段(240-310℃)，重量急劇下降(重量損失：約63％)，表明FVP發(fā)生了高度熱分解。在第四階段(310-533°C)，也發(fā)生了顯著的減重(約26%)，而該減重的速率低于第三階段。在第四階段可能發(fā)生了焦炭形成及進(jìn)一步的熱分解。在最后階段(533-600°C)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)減重。如圖2D所示，峰值溫度為139.73°C，相應(yīng)的焓變?yōu)?918 J/g。綜上所述，F(xiàn)VP在低于139.73°C的溫度下表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性(圖2C和D)。

FVP的X-衍射圖顯示出相對(duì)散射的峰形，主要晶體反射區(qū)域在24.75°(2θ)左右，說(shuō)明FVP屬于非晶結(jié)構(gòu)(圖2E)，結(jié)果與以往的研究相似。通過(guò)掃描電鏡(SEM)觀察FVP的表面形態(tài)結(jié)構(gòu)(圖2F)。圖2F顯示，F(xiàn)VP的結(jié)構(gòu)是空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，由條帶和細(xì)絲交叉連接，形成相對(duì)松散的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。為了獲得盡可能清晰的圖像，在2000×放大倍數(shù)下觀察FVP，結(jié)果顯示FVP表面“模糊”光滑，且有緊密連接的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。1H NMR和13C NMR顯示于圖2G中。δ~103.43 ppm的共振峰表明存在β型連接。

圖2. FVP的特征：(A)紫外吸收光譜；(B)紅外光譜；(C)熱重(TG)曲線；(D)導(dǎo)數(shù)熱重(DTG)曲線；(E) FVP的XRD；(F) FVP的SEM(500× & 2000×)；(G) FVP的1H NMR和13C NMR分析。

3、FVP減輕了Cd暴露引起的腸道組織損傷

在動(dòng)物試驗(yàn)中，沒(méi)有觀察到死亡或異常行為，所有小鼠進(jìn)食和飲水正常。與對(duì)照組相比，CdCl2處理小鼠的體重顯著降低，而FVP處理小鼠的體重增加(圖S3)。 顯微照片(圖3A)顯示，對(duì)照組小腸橫截面結(jié)構(gòu)和上皮細(xì)胞完整正常，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)炎癥。然而，CdCl2處理組表現(xiàn)為腸道損傷，包括上皮細(xì)胞變性和胞質(zhì)空泡化(如黑色箭頭所示)，以及固有層底部輕度水腫和疏松結(jié)締組織(如黃色箭頭所示)。與CdCl2組相比，CdCl2+FVP組的腸道結(jié)構(gòu)保持完整正常，固有層底部輕度水腫，結(jié)締組織疏松(如黑色箭頭所示)。

圖3B-E顯示，與對(duì)照相比，CdCl2暴露下調(diào)了腸緊密連接蛋白(Occludin和Claudin-1)和G蛋白偶聯(lián)受體(GPR43和GPR109A)的mRNA表達(dá)，而CdCl2+FVP處理導(dǎo)致這些變化大幅降低。此外，我們檢測(cè)了小鼠腸道和糞便中Cd的含量(圖3F)。結(jié)果顯示，F(xiàn)VP處理降低了小鼠腸組織和糞便中Cd的含量，表明FVP可以減少腸組織中Cd的積累，從而減少Cd的吸收。

圖3. FVP減輕了Cd暴露引起的腸道組織損傷：(A) H&E染色圖(200×)；(B) Occludin mRNA表達(dá)；(C) Claudin-1 mRNA表達(dá)；(D) GPR43 mRNA表達(dá)；(E) GPR109A mRNA表達(dá)；(F)小鼠腸道組織和糞便中Cd含量。不同字母表示不同組之間存在顯著差異，p＜0.05。CK指對(duì)照組。

4、FVP減輕了Cd暴露引起的小鼠腸道炎癥

免疫化學(xué)分析表明，Cd暴露增加了炎癥細(xì)胞因子的水平，包括TNF-α(紅色)、IL-6(粉色)和IL-1β(綠色)；CdCl2+FVP處理導(dǎo)致這些變化大幅減少(圖4A)。TUNEL染色顯示，CdCl2處理增加了TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的比例，而FVP的存在抑制了這種CdCl2誘導(dǎo)的變化(圖4B)。上述結(jié)果表明，F(xiàn)VP可抑制CdCl2誘導(dǎo)的小鼠腸道組織炎癥和細(xì)胞凋亡。

圖4. FVP抑制了Cd引起的小鼠腸道組織炎癥：(A)炎癥指標(biāo)的免疫化學(xué)分析，包括TNF-α、IL-6和IL-1β(圖像：200×)；(B) TUNEL染色圖像(200×)。不同字母表示不同組之間的顯著差異，P < 0.05。CK指對(duì)照組。

5、FVP抑制Cd誘導(dǎo)的腸道菌群和短鏈脂肪酸變化

對(duì)16S rRNA基因擴(kuò)增子進(jìn)行高通量測(cè)序，以評(píng)估FVP對(duì)CdCl2誘導(dǎo)的小鼠腸道菌群的影響。在本研究中，分析樣本的稀疏曲線顯示了獨(dú)特序列變異的數(shù)量，并指示了高樣本覆蓋率和物種豐富度(圖S4A)。三組樣本的Good's覆蓋率幾乎達(dá)到了99％(圖S4B)。這些結(jié)果表明，測(cè)序數(shù)據(jù)量足以捕獲和揭示所有分析樣本中的大多數(shù)微生物群落。

在α-多樣性方面(圖5A)，Chao、ACE、Simpson和Shannon指數(shù)在單獨(dú)使用CdCl2處理后下降，而FVP處理減輕了α-多樣性的變化。

關(guān)于β-多樣性(圖5B)，三組的加權(quán)Unifrac PCoA圖之間存在顯著差異。為了進(jìn)一步檢驗(yàn)分析樣本中微生物物種分布的相似性和差異性，構(gòu)建了加權(quán)Unifrac層次聚類樹。所獲得的聚類樹顯示出三組之間的顯著差異。此外，Rank-Abundance曲線呈長(zhǎng)尾分布(圖S5)，表明所分析樣品的腸道菌群中只存在少數(shù)優(yōu)勢(shì)OTUs，且這些OTUs分布均勻。 

圖5C顯示了腸道菌群在綱、目、科和屬水平上的相對(duì)豐度差異。系統(tǒng)分類揭示了腸道菌群中最豐富的10個(gè)門，其中擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)是所有分析樣本中最豐富的兩個(gè)門(圖S6)。其他門也存在，但豐度較低。在綱水平上，擬桿菌(Bacteroidia)、梭菌(Clostridia)、Desulfovibrionales、Bacilli、Negativicutes、放線菌(Actinobacteria)和Saccharimonadia在三組之間表現(xiàn)出顯著差異。單獨(dú)CdCl2組的Bacteroidia豐度高于對(duì)照組或FVP+CdCl2組。FVP+CdCl2組Clostridia、Desulfovibrionales和Bacilli的豐度高于對(duì)照組或單獨(dú)使用CdCl2組。

在目水平上，三組間Bacteroidales、Clostridiales、Lactobacillales、Desulfovibrionales、Selenomonadales、Saccharimonadales、Xanthomonadales和Bifidobacteriales的豐度存在顯著差異。單獨(dú)使用CdCl2組的Bacteroidales豐度高于對(duì)照組或FVP+CdCl2組。

FVP+CdCl2組Clostridiales、Lactobacillales和Desulfovibrionales的豐度高于對(duì)照組或單獨(dú)使用CdCl2組。在科水平上，三組間Muribaculaceae、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、乳桿菌科(Lactobacillaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、Tannerellaceae和Desulfovibrionaceae、鏈球菌科(Streptococceae)、氨基酸球菌科(Acidaminococcaceae)、Marinifilaceae、Saccharmonadaceae和Peptoccaceae的豐度存在顯著差異。單獨(dú)CdCl2處理組的Muribaculaceae和Tannerellaceae豐度高于對(duì)照組或FVP+CdCl2組。單獨(dú)FVP處理組的毛螺菌科、乳桿菌科、Desulfovibrionaceae和鏈球菌科的豐度高于對(duì)照組或單獨(dú)CdCl2組。對(duì)照組的理研菌科和氨基酸球菌科的豐度高于單獨(dú)CdCl2組或FVP+CdCl2組。

在屬水平上，乳桿菌屬(Lactobacillus)、Lachnospiraceae_NK4A136_group、布勞特氏菌屬(Blautia)、另枝菌屬(Alistipes)、Eubacterium_coprostanoligenes_group、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Enterorhabdus、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、Phascolarctobacterium、Odoribacter、Ruminiclostridium_6、Eubacterium_nodatum_group、Anaerotruncus、乳球菌屬(Lactococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、Ruminococcaceae_UCG-013、Rikenella、Ruminococcaceae_NK4A214_group、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、Erysipelotrichaceae_UCG-003、Dubosiella、Coriobacteriaceae_UCG-002、Butyricicoccus、Harryflintia、Christensenellaceae_R-7_group、腸球菌屬(Enterococcus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和假單胞菌屬(Pseudomonas)的豐度在三組間存在顯著差異。

單獨(dú)CdCl2處理組的Parabacteroides、Rikenellaceae_RC9_gut_group、雙歧桿菌屬、Ruminococcaceae_UCG-013和Dubosiella的豐度高于對(duì)照組或FVP+CdCl2組。

FVP+CdCl2組中乳桿菌屬、布勞特氏菌屬、Erysipelatoclostridium、Enterorhabdus、脫硫弧菌屬、Ruminiclostridium_6、Anaerotruncus、乳球菌屬、鏈球菌屬、Rikenella、Ruminococcaceae_NK4A214_group、寡養(yǎng)單胞菌屬、Butyricicoccus和腸球菌屬的豐度高于對(duì)照組或單獨(dú)CdCl2處理組。

對(duì)照組中Lachnospiraceae_NK4A36_group、Previotellaceae_NK3B31_group、另枝菌屬、Eubacterium_coprostanoligenes_group、Phascolarctobacterium、Odoribacter、Eubacterium_nodatum_group、Ruminococcaceae_NK4A214_group、Erysipelotrichaceae_UCG-003、Coriobacteriaceae_UCG-002、Harryflintia、Christensenellaceae_R-7_group和假單胞菌屬的豐度高于單獨(dú)CdCl2組或FVP+CdCl2組。此外，圖S7和S8顯示，Cd處理導(dǎo)致變形菌門(Proteobacteria)豐度和擬桿菌門/厚壁菌門比率(與腸道穩(wěn)態(tài)相關(guān)的標(biāo)志物)顯著降低和增加，而FVP處理減輕了這些變化。

腸道菌群可能的功能途徑及其代謝功能的變化如圖5D所示。Piecrusts分析顯示了腸道菌群的代謝功能譜。Kruskal-Wallis測(cè)試顯示，對(duì)照組、單獨(dú)CdCl2處理組和FVP+CdCl2組之間共有59種KEGG代謝功能差異豐富。不同的代謝途徑包括氨基酸代謝、其他次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成、碳水化合物代謝、能量代謝、聚糖的生物合成和代謝、脂質(zhì)代謝、輔因子和維生素的代謝、其他氨基酸的代謝、萜類和聚酮的代謝、外源性物質(zhì)的生物降解和代謝、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯、復(fù)制和修復(fù)。對(duì)于大多數(shù)途徑，在單獨(dú)CdCl2組和FVP+CdCl2組之間發(fā)現(xiàn)了顯著的反向調(diào)節(jié)。

如圖5E所示，暴露于CdCl2降低了主要SCFAs的糞便濃度，包括乙酸、丁酸、戊酸、異丁酸、異戊酸和丙酸。FVP的存在抵消了CdCl2引起的這些SCFAs濃度的降低。對(duì)照組的丙酸濃度低于FVP+CdCl2組，而對(duì)照組和FVP+CdCl2組的乙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸和戊酸濃度基本相同(圖5E)。

圖5. FVP抑制Cd誘導(dǎo)的腸道菌群和SCFAs的變化：(A) CK(對(duì)照組)、CdCl2和FVP+CdCl2組微生物群的β多樣性(顯示為加權(quán)unifrac PCoA圖、加權(quán)unifrak層次聚類樹)；(C)顯著變化的腸道細(xì)菌分類群的相對(duì)豐度(按綱、目、科和屬水平分類)；(D) CK、CdCl2和FVP+CdCl2組(基因途徑按主要功能類別分組)中顯著差異表達(dá)(所有p＜0.05)的功能代謝途徑的計(jì)算Z評(píng)分的熱圖比較；(E) CK、CdCl2和FVP+CdCl2組小鼠糞便中短鏈脂肪酸的濃度。不同字母表示不同組之間的顯著差異，P<0.05。CK為對(duì)照組。

6、腸道炎癥、短鏈脂肪酸和腸道菌群之間的相關(guān)性

如圖6所示，厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、Patescobacteria與SCFAs(如丁酸)之間存在相關(guān)性。如圖6B所示，微生物種類(即厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形菌門)與炎癥標(biāo)志物(如TNF-α、IL-6和IL-1β)之間存在顯著相關(guān)性。特別是，益生菌雙歧桿菌與三種炎癥標(biāo)志物IL-1β、IL-6和TNF-α呈顯著正相關(guān)，其中以前兩種標(biāo)志物的相關(guān)性最強(qiáng)。因此，益生菌雙歧桿菌可能與腸道其他物種相互作用，調(diào)節(jié)腸細(xì)胞中SCFAs的產(chǎn)生和炎癥水平，從而對(duì)腸細(xì)胞起到保護(hù)作用。

圖6. 腸道炎癥、SCFAs和腸道菌群之間的相關(guān)性：(A) SCFAs與腸道菌群相關(guān)網(wǎng)絡(luò)的熱圖；(B)腸道炎癥與腸道菌群相關(guān)網(wǎng)絡(luò)的熱圖。熱圖分析：縱坐標(biāo)顯示33個(gè)不同的屬，圖例顯示腸道菌群和短鏈脂肪酸之間的相關(guān)系數(shù)；*表示統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的P值。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。網(wǎng)絡(luò)圖分析：通過(guò)相關(guān)熱圖獲得相關(guān)系數(shù)和P值，|r|≥0.5，P<0.05。實(shí)線表示正相關(guān)，虛線表示負(fù)相關(guān)。

7、糞菌移植減輕Cd引起的腸道損傷

抗生素處理5天后，與對(duì)照組小鼠相比，抗生素處理組小鼠的OTU數(shù)量減少了9倍，表明成功構(gòu)建了小鼠的偽無(wú)菌模型(圖S9)。 圖7A顯示對(duì)照組小鼠的腸道結(jié)構(gòu)保持完整，沒(méi)有炎癥，只有少數(shù)不規(guī)則絨毛(如黑色箭頭所示)和杯狀細(xì)胞(如藍(lán)色箭頭所示)。

然而，對(duì)于CdCl2處理組，腸道損傷，包括絨毛短而不規(guī)則(如黑色箭頭所示)、杯狀細(xì)胞數(shù)量少(如藍(lán)色箭頭所示)、固有層底部疏松的結(jié)締組織和腸腺排列不規(guī)則(如黃色箭頭所示)，并伴有炎癥(如紅色箭頭所示)。與CdCl2組相比，F(xiàn)MT組的腸道損傷減輕，僅觀察到少量炎癥細(xì)胞(如紅色箭頭所示)和杯狀細(xì)胞(如藍(lán)色箭頭所示，)、不規(guī)則和短絨毛(如黑色箭頭所示)。如圖7B和C所示，Cd組和FMT組在體重、Occludin和GPR109A mRNA水平方面沒(méi)有顯著差異。GPR43和Clandin-1 mRNA水平的升高可能與FMT減輕Cd引起的腸道屏障破壞有關(guān)。

圖7D顯示，F(xiàn)MT減輕了Cd誘導(dǎo)的Tunel陽(yáng)性細(xì)胞比例的增加。這些結(jié)果共同支持了FVP通過(guò)改變腸道菌群來(lái)減輕Cd引起的腸道損傷的假設(shè)，從而減輕Cd引起的腸組織形態(tài)學(xué)損傷、細(xì)胞凋亡、腸屏障破壞和炎癥。圖7E顯示FMT減輕了Cd引起的腸道組織炎癥。

圖7. 糞菌移植減輕了Cd誘導(dǎo)的腸道損傷：(A) H&E染色圖像(200×)；(B)體重；(C) Occludin、Claudin-1、GPR43和GPR109A mRNA表達(dá)；(D) TUNEL染色圖像(200×)；(E)炎癥指標(biāo)的免疫化學(xué)分析，包括TNF-α、IL-6和IL-1β(圖像：200×)。不同字母表示不同組之間的顯著差異，p＜0.05。CK為對(duì)照組。  

討論

Cd是一種劇毒的環(huán)境污染物和食品污染物，攝入鎘會(huì)對(duì)各種器官造成損害。作者的研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)證明了Cd對(duì)小鼠的腎臟、肝臟和脾臟的毒性和相關(guān)損傷。據(jù)報(bào)道，在小鼠中，Cd暴露會(huì)破壞腸道屏障和腸道菌群的代謝功能，引發(fā)炎癥并增加腸道通透性，并誘導(dǎo)近端腸道的炎癥反應(yīng)和組織巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2 mRNA的過(guò)度表達(dá)。與之前的研究結(jié)果類似，本研究中CdCl2暴露通過(guò)誘導(dǎo)腸道炎癥、改變腸道通透性和破壞腸道屏障而引起腸道損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，CdCl2暴露降低了緊密連接蛋白(Occludin和Claudin-1)和G蛋白偶聯(lián)受體基因(GPR43和GPR109A)的表達(dá)，增加了炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)的水平，并破壞了腸道組織結(jié)構(gòu)(如上皮細(xì)胞變性、胞質(zhì)空泡化、輕度水腫和疏松結(jié)締組織排列)。

飲食干預(yù)是對(duì)抗Cd引起的損傷的有效治療方法。來(lái)自自然資源的生物活性多糖是預(yù)防和治療Cd誘導(dǎo)的毒性和相關(guān)損傷的有吸引力的療法。姬松茸多糖具有抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性，對(duì)Cd誘導(dǎo)的雞脾臟和肝臟毒性、氧化應(yīng)激和炎癥損傷具有保護(hù)作用。黃芪多糖被發(fā)現(xiàn)通過(guò)MDA5/NF-κB途徑對(duì)Cd誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性提供保護(hù)。

蕨麻多糖通過(guò)抑制PI3K class III/Beclin-1介導(dǎo)的自噬來(lái)減弱Cd誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性，并通過(guò)改善氧化還原穩(wěn)態(tài)和緩解線粒體功能障礙來(lái)對(duì)抗Cd誘導(dǎo)的腎毒性。在本研究中，金針菇多糖產(chǎn)物也顯示出對(duì)CdCl2誘導(dǎo)的腸道損傷具有保護(hù)作用。 Wang和Zhang的研究表明，金針菇多糖(FVPs)已顯示出多種生物活性，而這些生物活性取決于提取方法以及由此產(chǎn)生的物理和化學(xué)性質(zhì)。Zhang等人發(fā)現(xiàn)，熱水提取的FVP比超聲波、微波或酶提取的FVP具有更高的抗氧化能力。Chen等人進(jìn)一步證實(shí)，與超聲波輔助提取相比，熱水提取獲得的FVP具有更高的抗氧化能力和更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用。這些作者認(rèn)為，熱水提取對(duì)FVP結(jié)構(gòu)造成的損傷較小，這是產(chǎn)生的FVP具有較高生物活性的原因。

先前研究中獲得的FVP是由各種單糖組成的雜多糖，其生物活性受分子量的影響。

在本研究中，通過(guò)熱水提取(85℃)和乙醇沉淀制備FVP，以更好地保留FVP的結(jié)構(gòu)和性能，得到的FVP是一種雜多糖，DM為41.24%，含有8種主要單糖，Man、Rib、GlcA、Glc、Gal、Xyl、Ara和Fuc。熱重分析表明，F(xiàn)VP在低于139.73°C的溫度下表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性，因此85°C的熱水提取不會(huì)導(dǎo)致FVP的熱分解。FVP能夠減輕CdCl2引發(fā)的腸道損傷，減輕CdCl2誘導(dǎo)的腸道組織炎癥和凋亡(FVP對(duì)炎癥細(xì)胞因子和TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞比例增加的抑制作用證明了這一點(diǎn))。此外，F(xiàn)VP可以抑制CdCl2誘導(dǎo)的腸道菌群變化(α-多樣性和β-多樣性的結(jié)果以及腸道菌群的相對(duì)豐度證明了這一點(diǎn))。此外，擬桿菌門和厚壁菌門是對(duì)照組、單獨(dú)CdCl2組和FVP+CdCl2組小鼠腸道菌群中最豐富的兩個(gè)門，其中擬桿菌門在單獨(dú)CdCl2組中具有更高的豐度。對(duì)照組、單獨(dú)CdCl2組和FVP+CdCl2組的擬桿菌門/厚壁菌門比例沒(méi)有差異，這與之前的研究結(jié)果相似。FVP給藥也增加了Clostridia、Desulfovibrionales和Bacilli的豐度。這些結(jié)果表明，F(xiàn)VP抑制了CdCl2誘導(dǎo)的腸道損傷，這可能是由于其能夠減輕CdCl2引發(fā)的腸道菌群變化。然而，F(xiàn)VP的確切保護(hù)機(jī)制尚不清楚，仍需進(jìn)一步探索。

腸道中產(chǎn)生的短鏈脂肪酸具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎能力，在維持腸道穩(wěn)態(tài)、控制免疫功能和腸道炎癥方面發(fā)揮重要作用。這些SCFAs有助于維持低pH值(抑制病原體的生長(zhǎng))，并刺激產(chǎn)生丁酸的細(xì)菌(增強(qiáng)腸道免疫屏障)。SCFAs可以抑制腸上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞中的組蛋白脫乙酰酶并激活細(xì)胞表面GPCR(如GPR43和GPR109A)，以發(fā)揮抗炎作用并調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。Cd暴露會(huì)顯著干擾腸道菌群的代謝功能。本研究也獲得了類似的結(jié)果，CdCl2暴露降低了SCFAs的濃度，如乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸，而FVP的存在逆轉(zhuǎn)/抵消了這些變化。

此外，比較了對(duì)照組、單獨(dú)CdCl2組和CdCl2+FVP組的能量和代謝相關(guān)基因表達(dá)和途徑。比較表明，F(xiàn)VP可能通過(guò)SCFA介導(dǎo)的腸道炎癥和腸道菌群相關(guān)能量代謝的調(diào)節(jié)來(lái)減輕CdCl2誘導(dǎo)的腸道損傷。先前的研究發(fā)現(xiàn)，腸道炎癥反應(yīng)的激活可能會(huì)因腸道菌群的變化而被破壞。在本研究中，腸道菌群與短鏈脂肪酸之間以及腸道菌群與腸道炎癥標(biāo)志物之間存在相關(guān)性：厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形菌門和Patescibacteria與幾種SCFAs相關(guān)，益生菌雙歧桿菌與IL-1β、IL-6和TNF-α三種炎癥標(biāo)志物呈正相關(guān)。本研究中獲得的FVP的糖醛酸含量為5.10%，DM為41.24%，表明FVP由于含有羧基而帶負(fù)電荷。已知LM果膠和粘蛋白分子帶負(fù)電荷，因此，F(xiàn)VP和粘蛋白不能形成FVP-粘蛋白層，相反，F(xiàn)VP分子可能進(jìn)入并穿過(guò)腸粘蛋白層到達(dá)腸上皮并與腸上皮相互作用，分泌粘液，對(duì)腸上皮屏障提供額外的保護(hù)。

此外，先前的研究報(bào)告稱，F(xiàn)VP可以調(diào)節(jié)腸道菌群以發(fā)揮其保護(hù)作用。Zhao等人發(fā)現(xiàn)，飼喂FVP小鼠的糞便上清液可以減輕小鼠的肥胖、高脂血癥和胰島素抵抗。與之前的研究類似，飼喂FVP小鼠的糞便上清液可以減輕Cd引起的腸道損傷，從而抑制腸道炎癥、細(xì)胞凋亡和腸道屏障。綜上所述，F(xiàn)VP具有良好的結(jié)構(gòu)特征，使其成為一種有效的治療CdCl2誘導(dǎo)的腸道損傷的藥物。圖8顯示了FVP、腸道菌群、短鏈脂肪酸、腸道屏障/細(xì)胞和腸道炎癥之間的相互作用。

圖8. FVP對(duì)Cd誘導(dǎo)的腸道損傷保護(hù)作用的潛在機(jī)制。  

結(jié)論

本研究證明了從金針菇中提取具有良好結(jié)構(gòu)特征的多糖以對(duì)抗Cd誘導(dǎo)的腸道損傷的可行性。在以下條件下，采用熱水提取和乙醇沉淀法制備FVP：料液比(1:20)、提取時(shí)間(2 h)和提取溫度(85°C)。FVP是一種雜多糖，糖醛酸含量為5.10%，DM為41.24%，在低于139.73°C的溫度下表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性。FVP由八個(gè)單糖(Man、Rib、Glc、Gal、Xyl、Ara、Fuc和GlcA)組成，可能含有β-糖苷鍵(β-1,4鍵)、吡喃糖環(huán)和/或硫酸化芳香環(huán)。FVP、腸道菌群、短鏈脂肪酸、腸道屏障/細(xì)胞和腸道炎癥之間存在相互作用。

FVP通過(guò)抑制腸道炎癥、調(diào)節(jié)腸道通透性和屏障來(lái)減輕Cd誘導(dǎo)的腸道損傷。FVP抑制Cd引起的緊密連接基因(Occludin和Claudin-1)和G蛋白偶聯(lián)受體基因(GPR43和GPR109A)的表達(dá)降低、炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)水平升高，以及腸道組織結(jié)構(gòu)損傷。腸道菌群分析顯示，單獨(dú)暴露于Cd會(huì)增加擬桿菌的豐度，降低脫硫弧菌和梭菌的豐度，而FVP治療緩解了這些變化。此外，F(xiàn)VP能夠抑制Cd對(duì)SCFA的影響。FVP通過(guò)調(diào)節(jié)功能途徑(包括KEGG途徑)和腸道菌群相關(guān)的能量代謝，增強(qiáng)腸道菌群的代謝功能。FVP+CdCl2組小鼠的腸道菌群移植可部分緩解Cd誘導(dǎo)的腸道損傷。

這些結(jié)果表明，F(xiàn)VP可能是一種潛在的功能性食品，通過(guò)SCFA介導(dǎo)的腸道炎癥和腸道菌群相關(guān)能量代謝的調(diào)節(jié)，減輕Cd誘導(dǎo)的腸道毒性和腸道損傷。FVP給藥是對(duì)抗重金屬引起的腸道菌群紊亂的有效干預(yù)措施。

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