編譯：微科盟聽雪齋，編輯：微科盟居居、江舜堯。

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導(dǎo)讀  

吸煙是結(jié)直腸癌(CRC)的主要風(fēng)險(xiǎn)因素。本研究旨在調(diào)查香煙煙霧是否通過改變腸道微生物群和相關(guān)代謝物來促進(jìn)CRC。經(jīng)偶氮甲烷處理的C57BL/6小鼠每天暴露于香煙煙霧或清潔空氣2小時(shí)，持續(xù)28周。同時(shí)對(duì)小鼠糞便進(jìn)行鳥槍法宏基因組測(cè)序和液相色譜-質(zhì)譜分析，以研究微生物群和代謝物的變化。用來自暴露于煙霧和無煙對(duì)照小鼠的糞便移植無菌小鼠。結(jié)果表明，與無煙對(duì)照小鼠相比，暴露于香煙煙霧的小鼠腫瘤發(fā)病率和細(xì)胞增殖顯著增加。在暴露于煙霧的小鼠中觀察到腸道菌群失調(diào)，其中細(xì)菌種類的豐度存在顯著差異，包括Eggerthella lenta的富集以及Parabacteroides distasonis和Lactobacillus spp.的減少。代謝組學(xué)分析顯示，暴露于煙霧的小鼠結(jié)腸中膽汁酸代謝物增加，尤其是牛磺脫氧膽酸(TDCA)。暴露于煙霧的小鼠中E. lenta與TDCA的相關(guān)性最強(qiáng)。此外，暴露于煙霧的小鼠表現(xiàn)出致癌MAPK/ERK(絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2)信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)(TDCA的下游靶標(biāo))和腸道屏障功能受損。此外，移植了煙霧暴露小鼠糞便的無菌小鼠(GF-AOMS)結(jié)腸細(xì)胞增殖增加。同樣，GF-AOMS顯示腸道E. lenta和TDCA的豐度增加，MAPK/ERK通路激活，結(jié)腸上皮的腸道屏障受損。綜上所述，香煙煙霧引起的腸道菌群失調(diào)在CRC中起著促腫瘤作用。煙霧引起的腸道菌群失調(diào)改變了腸道代謝物并損害腸道屏障功能，這可能會(huì)激活結(jié)腸上皮中的致癌MAPK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)。

論文ID

原名：Cigarette smoke promotes colorectal cancer through modulation of gut microbiota and related metabolites

譯名：香煙煙霧通過調(diào)節(jié)腸道菌群和相關(guān)代謝物促進(jìn)結(jié)直腸癌

期刊：Gut

IF：31.793

發(fā)表時(shí)間：2022.4

通訊作者：于君

通訊作者單位：香港中文大學(xué)

DOI號(hào)：10.1136/gutjnl-2021-325021

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

結(jié)果

1 香煙煙霧促進(jìn)小鼠結(jié)直腸腫瘤發(fā)生    

為了研究吸煙對(duì)結(jié)直腸腫瘤發(fā)生的影響，我們將經(jīng)AOM處理的C57BL/6小鼠暴露于清潔空氣或香煙煙霧中(圖1A)。香煙煙霧暴露小鼠的結(jié)直腸腫瘤數(shù)量和腫瘤大小均顯著大于無煙對(duì)照小鼠(p<0.01；圖1B)。病理學(xué)家通過顯微鏡組織學(xué)檢查證實(shí)了結(jié)腸腺瘤和腺癌的存在(圖1C)。暴露于香煙煙霧顯著增加了結(jié)腸腫瘤的發(fā)病率(p<0.05)(圖1D)。我們觀察到與無煙對(duì)照小鼠相比，香煙煙霧暴露小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖增加，表現(xiàn)為Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增加(圖1E)和細(xì)胞增殖蛋白標(biāo)志物增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)水平增加(圖1F)。

圖1. 吸煙會(huì)增加小鼠的結(jié)直腸腫瘤發(fā)生率。

(A)為香煙煙霧暴露而設(shè)計(jì)的吸煙或清潔室和AOM誘發(fā)癌癥模型的示意圖。混合的新鮮空氣和煙霧吸入吸煙室，新鮮空氣吸入潔凈室。每天2小時(shí)將小鼠放入室中，持續(xù)28周。從第0天起連續(xù)6周每周一次腹腔注射AOM(10 mg/kg)。在第28周結(jié)束時(shí)處死小鼠(AOM組，n=15；AOM+吸煙組，n=15)。(B)處死時(shí)結(jié)腸的代表性圖像。AOM和AOM+吸煙組小鼠的腫瘤數(shù)量和腫瘤大小。(C)AOM組腺瘤和AOM+吸煙組腺癌H&E染色的代表性圖像。(D) AOM處理小鼠結(jié)腸腺瘤和腺癌的發(fā)病率。統(tǒng)計(jì)顯著性由Fisher精確檢驗(yàn)確定。(E) Ki67陽性細(xì)胞免疫組化染色的代表性圖像和結(jié)腸中Ki67陽性細(xì)胞的比例。(F)通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)AOM處理小鼠結(jié)腸中PCNA的蛋白質(zhì)表達(dá)。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD。AOM，偶氮甲烷；PCNA，增殖細(xì)胞核抗原。    

2 香煙煙霧改變小鼠腸道菌群組成和微生物相互作用    

由于小鼠長期生活在一起，我們首先使用16S測(cè)序方法評(píng)估了微生物群落是否存在籠效應(yīng)，我們發(fā)現(xiàn)籠效應(yīng)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的微生物群落沒有影響(p>0.05，PERMANOVA)。然而，吸煙對(duì)微生物群落的顯著影響發(fā)生在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(結(jié)束時(shí)間點(diǎn))(在線補(bǔ)充圖1)，表明長期吸煙是影響微生物群的主要因素。然后，對(duì)糞便樣本進(jìn)行鳥槍法宏基因組測(cè)序分析，以確定香煙煙霧暴露引起的腸道微生物群的潛在改變。在基線時(shí)(初始時(shí)間點(diǎn))，在α和β多樣性方面，暴露于煙霧和無煙對(duì)照小鼠之間的微生物組沒有顯著差異(在線補(bǔ)充圖2A、B)。28周后，我們觀察到與無煙對(duì)照小鼠相比，暴露于香煙煙霧的小鼠的α多樣性顯著降低(圖2A和在線補(bǔ)充圖2C)。PCoA分析(β多樣性)顯示，與無煙對(duì)照小鼠相比，吸煙小鼠的腸道微生物群的聚類有顯著差異(p<0.01，PERMANOVA；圖2B)。20種細(xì)菌(p<0.05，F(xiàn)C>1.5)在暴露于香煙煙霧的小鼠中發(fā)生了顯著變化(圖2C)。其中，E. lenta和Staphylococcus capitis在暴露于香煙煙霧的小鼠中富集，而包括羅伊氏乳桿菌、Parabacteroides distasonis和Bacteroides dorei在內(nèi)的腸道有益細(xì)菌因暴露于香煙煙霧而減少。通過定量PCR證實(shí)暴露于香煙煙霧的小鼠中E. lenta豐度更高(p<0.01；圖2D)。我們使用我們發(fā)表的數(shù)據(jù)集進(jìn)一步評(píng)估了E. lenta與人類CRC的關(guān)聯(lián)。與正常受試者(n=204)相比，CRC患者(n=185)中E. lenta明顯更豐富。在這些CRC患者中，吸煙者(n=30)與不吸煙者(n=87)相比具有更高的E. lenta豐度(p<0.05)(在線補(bǔ)充圖3A，B)。    

微生物之間的相互作用可能有助于疾病進(jìn)展。我們調(diào)查了暴露于煙霧的小鼠和無煙對(duì)照小鼠之間差異豐度細(xì)菌之間相互作用的生態(tài)網(wǎng)絡(luò)(圖2E)。我們觀察到，在暴露于煙霧的小鼠和無煙對(duì)照小鼠之間，細(xì)菌之間的共發(fā)生和共排除相互作用存在顯著差異。在E. lenta和兩種益生菌(Lactobacillus jensenii和Lactobacillus crispatus)之間觀察到了共同的相關(guān)性(圖2D)，表明在香煙煙霧暴露的小鼠中富集的E. lenta與減少的保護(hù)性細(xì)菌之間存在拮抗關(guān)系。

圖2. 香煙煙霧調(diào)節(jié)小鼠的腸道微生物群。

(A) AOM+吸煙和AOM組的Fisher統(tǒng)計(jì)(α多樣性)和(B) PCoA分析(β多樣性)。分別通過雙尾Mann-Whitney U檢驗(yàn)和PERMANOVA獲得α和β多樣性的顯著性。(C) AOM+吸煙組和AOM組之間的細(xì)菌差異。使用多元統(tǒng)計(jì)模型檢測(cè)豐度差異(p<0.05(FDR校正)，F(xiàn)C>1.5，MaAsLin2)。(D) AOM+吸煙組和AOM組之間的Eggerthella lenta物種豐度通過定量PCR驗(yàn)證。(E) AOM+吸煙組和AOM組差異細(xì)菌的生態(tài)網(wǎng)絡(luò)。通過SparCC方法測(cè)定相關(guān)性。選擇AOM+吸煙組和AOM組之間相關(guān)性強(qiáng)度差異>0.6的相關(guān)性進(jìn)行可視化。AOM，偶氮甲烷；FC，倍數(shù)變化。    

3 香煙煙霧會(huì)改變糞便中腸道微生物相關(guān)代謝物    

通過液相色譜-質(zhì)譜(MS)/MS分析小鼠糞便確定了暴露于煙霧后糞便代謝物的變化。正交偏最小二乘判別分析表明，暴露于煙霧的小鼠的糞便代謝譜與無煙小鼠有顯著差異(圖3A)。與無煙對(duì)照小鼠相比，香煙煙霧暴露小鼠糞便中的41種代謝物(校正后p<0.05)發(fā)生了改變(圖3B)。改變的代謝物在不同的代謝組學(xué)信號(hào)通路中富集或減少(圖3C)。與無煙小鼠相比，膽汁酸生物合成是香煙煙霧暴露小鼠中最豐富的途徑。在腸道中，細(xì)菌將初級(jí)膽汁酸轉(zhuǎn)化為次級(jí)膽汁酸，后者部分被回腸末端和結(jié)腸吸收。在這些次級(jí)膽汁酸中，已知TDCA具有致癌性。暴露于煙霧的小鼠中TDCA的豐度顯著增加(圖3B)。靶向MS進(jìn)一步證實(shí)了香煙煙霧暴露小鼠的糞便TDCA升高(p=0.0094)(圖3D)。    

為了確定微生物群與代謝物的潛在關(guān)聯(lián)，我們通過partial Spearman相關(guān)性進(jìn)行了細(xì)菌和代謝物之間的相關(guān)性分析。我們觀察到E. lenta與TDCA的正相關(guān)性最強(qiáng)，而兩種益生菌(L. jensenii和L. crispatus)在香煙煙霧暴露小鼠中減少，與TDCA呈負(fù)相關(guān)(圖3E)。E. lenta具有解偶聯(lián)初級(jí)膽汁酸的能力并表達(dá)膽汁酸差向異構(gòu)酶3β-羥基類固醇脫氫酶(3β-HSDH)；因此，它參與次級(jí)膽汁酸的合成，并影響糞便中TDCA的水平。因此，我們測(cè)量了編碼3β-HSDH酶的基因豐度，并觀察到與無煙小鼠相比，吸煙小鼠的基因豐度明顯更高(在線補(bǔ)充圖3C)。與此一致，我們進(jìn)一步證實(shí)了E. lenta的豐度與糞便中TDCA的濃度呈正相關(guān)(圖3F)。因此，腸道微生物失調(diào)和代謝物改變可能共同促進(jìn)結(jié)腸腫瘤的發(fā)生。

圖3. 香煙煙霧會(huì)改變糞便中與腸道微生物群相關(guān)的代謝物。

(A)通過OPLS-DA方法，AOM+吸煙組和AOM組的糞便代謝譜顯著不同，OPLS-DA方法是一種監(jiān)督多元回歸分析，用于識(shí)別不同組間的可識(shí)別模式。x軸捕捉組之間的變化，而y軸捕捉組內(nèi)的變化。(B) AOM+吸煙組和AOM組之間的差異代謝物，p<0.05，雙尾Mann-Whitney U檢驗(yàn)。(C) AOM+吸煙組和AOM組差異代謝物的富集分析。(D)通過靶向質(zhì)譜法測(cè)定AOM+吸煙組和AOM組糞便中TDCA的濃度，p<0.05，雙尾Student’s t檢驗(yàn)。(E)通過partial Spearman相關(guān)分析細(xì)菌與差異代謝物的關(guān)聯(lián)。(F) TDCA和Eggerthella lenta之間的線性關(guān)聯(lián)，通過線性模型進(jìn)行校正(暴露煙霧/無煙霧)。AOM，偶氮甲烷；OPLS-DA，正交偏最小二乘判別分析；TDCA，?；敲撗跄懰?。    

4 香煙煙霧損害腸道屏障功能    

為了研究吸煙對(duì)腸道屏障功能的影響，我們分析了結(jié)腸緊密連接蛋白、claudin-3和Zonula occludens-1(ZO-1)的表達(dá)水平，以及血清脂多糖(LPS)的水平。通過蛋白質(zhì)印跡(圖4A)和免疫熒光染色(圖4B)顯示，香煙煙霧顯著降低了Claudin-3和ZO-1的水平。在電子顯微鏡(EM)檢查下進(jìn)一步證實(shí)了受損的緊密連接(圖4C)。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)與無煙對(duì)照小鼠相比，煙霧暴露小鼠的血清LPS水平顯著升高(圖4D)。這些結(jié)果共同表明，香煙煙霧會(huì)導(dǎo)致腸道屏障功能受損。    

圖4. 香煙煙霧會(huì)損害腸道屏障功能。

(A)通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)AOM處理小鼠結(jié)腸中claudin-3和ZO-1蛋白表達(dá)。(B)免疫熒光染色檢測(cè)AOM處理模型結(jié)腸中Claudin-3和ZO-1蛋白表達(dá)情況。(C) AOM處理小鼠結(jié)直腸腸道屏障結(jié)構(gòu)的代表性圖像。箭頭指向電子顯微鏡下的細(xì)胞-細(xì)胞連接。(a)緊密連接；(b)粘附連接；(c)橋粒；(d)間隙連接。星號(hào)表示被破壞的細(xì)胞連接。(D) AOM和AOM+吸煙組小鼠血清中LPS濃度。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD。統(tǒng)計(jì)顯著性由未配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)確定。AOM，偶氮甲烷；DAPI，4',6-二脒基-2-苯基吲哚；LPS，脂多糖。    

5 香煙煙霧增強(qiáng)結(jié)腸上皮中的致癌MAPK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)    

為了從分子角度了解吸煙的促腫瘤作用，我們使用Mouse Cancer Pathway Finder PCR Array分析了結(jié)腸上皮中癌癥相關(guān)基因的表達(dá)。與無煙對(duì)照小鼠相比，我們?cè)诒┞队跓熿F的小鼠中觀察到19個(gè)上調(diào)基因和7個(gè)下調(diào)基因(圖5A，在線補(bǔ)充表2)。富集分析表明絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路是香煙煙霧激活的最多通路(圖5B)。先前的研究報(bào)道稱，TDCA可以激活MAPK通路的ERK亞家族，因此，我們?cè)u(píng)估了暴露于香煙煙霧的小鼠結(jié)腸上皮中MAPK/ERK的激活，并與對(duì)照小鼠進(jìn)行比較。MAPK/ERK通路中的關(guān)鍵介質(zhì)蛋白phospho-ERK1/2水平升高證實(shí)了吸煙對(duì)MAPK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)的激活(圖5C)。此外，我們觀察到ERK磷酸化水平與TDCA水平呈正相關(guān)(在線補(bǔ)充圖4A)。這些結(jié)果表明，香煙煙霧誘導(dǎo)ERK1/2磷酸化，激活MAPK/ERK信號(hào)通路，促進(jìn)結(jié)腸腫瘤的發(fā)生。        

圖5. 香煙煙霧增強(qiáng)了結(jié)腸上皮中致癌MAPK/ERK通路和促炎通路的表達(dá)。

(A) Mouse Cancer Pathway Finder PCR Array分析AOM+吸煙組與AOM組結(jié)腸上皮差異表達(dá)基因(FC=AOM+吸煙/AOM，正log2(FC)=AOM+吸煙組高表達(dá)和負(fù)log2(FC)=AOM組高表達(dá))。(B)通過富集分析，與AOM組相比，AOM+吸煙組的癌癥信號(hào)通路改變。箭頭表示富集方向，通過比較通路中上調(diào)和下調(diào)的基因來計(jì)算。MAPK信號(hào)通路中差異表達(dá)的基因在網(wǎng)絡(luò)中顯示。(C)通過蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)AOM處理小鼠結(jié)腸中ρ-ERK1/2蛋白表達(dá)。(D)通過小鼠炎癥反應(yīng)和自身免疫陣列分析，與AOM小鼠相比，AOM+吸煙小鼠結(jié)腸上皮的差異表達(dá)基因。(E)通過富集分析，與AOM組相比，AOM+吸煙組炎癥信號(hào)通路的改變。TNF和IL-17信號(hào)通路中的差異表達(dá)基因在網(wǎng)絡(luò)中顯示。(F)定量RT-PCR檢測(cè)Cxcl2、Il-17a和Il-10的基因表達(dá)。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD。**p<0.01，*p<0.05；統(tǒng)計(jì)顯著性由雙側(cè)未配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)確定。AOM，偶氮甲烷；ERK，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶；FC，倍數(shù)變化；Il，白細(xì)胞介素；MAPK，絲裂原活化蛋白激酶；TNF，腫瘤壞死因子。    

6 香煙煙霧增強(qiáng)促炎信號(hào)基因的表達(dá)    

腸道細(xì)菌失調(diào)與炎癥密切相關(guān)，炎癥與致癌因素和腫瘤發(fā)生有關(guān)。因此，我們使用小鼠炎癥反應(yīng)和自身免疫PCR陣列分析了促炎基因的表達(dá)。與無煙對(duì)照小鼠相比，我們?cè)谙銦煙熿F暴露小鼠中觀察到27個(gè)上調(diào)基因和5個(gè)下調(diào)基因(圖5D，在線補(bǔ)充表3)。香煙煙霧誘導(dǎo)包括促炎白細(xì)胞介素17(IL-17)信號(hào)通路和腫瘤壞死因子(TNF)信號(hào)通路的改變(圖5E)。定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)證實(shí)，與無煙對(duì)照小鼠相比，香煙煙霧暴露小鼠體內(nèi)促炎因子Il-17a、Cxcl2的表達(dá)增加，抗炎因子Il-10的表達(dá)降低(圖5F)。此外，Il-17a的相對(duì)mRNA表達(dá)與結(jié)腸中E. lenta的豐度呈正相關(guān)(在線補(bǔ)充圖5)。這些結(jié)果表明，香煙煙霧促進(jìn)結(jié)腸腫瘤發(fā)生中的炎癥。    

7 無菌小鼠糞便菌群移植概括了暴露于煙霧的常規(guī)小鼠腸道菌群的變化    

為了證實(shí)香煙煙霧改變的腸道微生物群對(duì)結(jié)直腸腫瘤發(fā)生的直接作用，我們?cè)跓o菌小鼠中進(jìn)行了糞便微生物群移植。用暴露于香煙煙霧或無煙常規(guī)小鼠的糞便對(duì)無菌小鼠進(jìn)行灌胃。20周后收獲并檢查小鼠(圖6A)。我們進(jìn)行了鳥槍法宏基因組測(cè)序分析，以探索香煙煙霧改變的微生物群的定殖。與常規(guī)AOM小鼠模型相似，與用無煙小鼠糞便灌胃的無菌小鼠(GF-AOMS)相比，用香煙煙霧暴露小鼠糞便灌胃的無菌小鼠(GF-AOM)的α多樣性顯著降低(圖6B和在線補(bǔ)充圖2C)。β多樣性分析再次顯示這兩組無菌小鼠(GF-AOMS與GF-AOM，p<0.01，PERMANOVA)的腸道微生物群存在顯著分離(圖6C)。進(jìn)一步分析揭示了34種差異豐富的細(xì)菌(圖6D)。在GF-AOMS小鼠中，E. lenta的豐度顯著增加，而P. distasonis的豐度顯著降低(p<0.05，F(xiàn)C>1.5)。通過定量PCR證實(shí)GF-AOMS組中E. lenta的豐度顯著高于GF-AOM組(p<0.001，圖6E)。    

進(jìn)一步測(cè)試了兩種小鼠模型(無菌小鼠和常規(guī)AOM小鼠)之間微生物群變化的一致性。我們發(fā)現(xiàn)，與無煙AOM小鼠相比，暴露于煙霧的AOM小鼠中豐度增加的細(xì)菌在GF-AOMS小鼠體內(nèi)持續(xù)增加，而暴露于煙霧的AOM小鼠中豐度降低的細(xì)菌在GF-AOMS小鼠中持續(xù)減少(圖6F)。重要的是，我們觀察到暴露于煙霧的AOM小鼠和GF-AOMS小鼠中E. lenta的豐度增加，而益生菌P. distasonis的豐度降低。相關(guān)性分析顯示，與供體小鼠相比，無菌小鼠糞便移植后生態(tài)網(wǎng)絡(luò)模塊得到保存(圖6G)。此外，與GF-AOM小鼠相比，GF-AOMS小鼠的糞便TDCA水平也顯著升高(圖6H)。

圖6. 從暴露于煙霧的常規(guī)小鼠中移植糞便微生物群改變無菌小鼠的腸道微生物群。

(A)無菌小鼠模型的示意圖。無菌小鼠經(jīng)口灌胃AOM+吸煙組和AOM組(n=8/組)的糞便。在第20周結(jié)束時(shí)處死小鼠。(B) GF-AOMS和GF-AOM組的Fisher統(tǒng)計(jì)(α多樣性)和(C)PCoA分析(β多樣性)。分別通過雙尾Mann-Whitney U檢驗(yàn)和PERMANOVA檢驗(yàn)獲得α和α多樣性的顯著性。(D) GF-AOMS和GF-AOM組之間的差異細(xì)菌。(E)定量PCR驗(yàn)證GF-AOMS和GF-AOM組之間Eggerthella lenta物種豐度。(F)兩種小鼠模型(無菌小鼠和AOM小鼠)中細(xì)菌豐度的一致變化(p<0.05，暴露于煙霧的小鼠vs無煙小鼠；GF-AOMS小鼠vs GF-AOM小鼠)。計(jì)算了吸煙和不吸煙之間的豐度FC。紅點(diǎn)代表無菌小鼠模型，黃點(diǎn)代表常規(guī)小鼠模型。(G)與供體相比，無菌小鼠灌胃喂養(yǎng)后網(wǎng)絡(luò)模塊保持不變。(H)通過靶向質(zhì)譜測(cè)定法測(cè)定GF-AOMS和GF-AOM組之間糞便中TDCA的濃度，p<0.05，雙尾Mann-Whitney U檢驗(yàn)。    

8 香煙煙霧改變的微生物群增加了無菌小鼠的結(jié)腸細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生    

與GF-AOM小鼠相比，GF-AOMS小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖增加，這表現(xiàn)為Ki-67陽性細(xì)胞比例較高(圖7A)和PCNA表達(dá)水平較高(圖7B)。此外，我們對(duì)無菌小鼠進(jìn)行了AOM處理，并用暴露于香煙煙霧(GFAOM-AOMS)或無煙小鼠(GFAOM-AOM)的糞便灌胃(在線補(bǔ)充圖6A)。與GFAOM-AOM小鼠相比，GFAOM-AOMS小鼠的結(jié)腸腫瘤數(shù)量(p<0.05)和腫瘤大小(p<0.05)增加(在線補(bǔ)充圖6B)。這些在無菌小鼠中的結(jié)果與在常規(guī)小鼠中的觀察結(jié)果一致，表明香煙煙霧改變的微生物群和代謝組可以直接促進(jìn)結(jié)腸細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生。

圖7. 香煙煙霧改變的微生物群會(huì)增加結(jié)腸細(xì)胞增殖，損害腸道屏障功能，并增強(qiáng)無菌小鼠中致癌MAPK/ERK和促炎基因的表達(dá)。

(A)無菌小鼠結(jié)腸中Ki67陽性細(xì)胞的免疫組化染色代表性圖像和Ki67陽性細(xì)胞比例。(B)通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)無菌小鼠結(jié)腸中PCNA的蛋白表達(dá)。(C)通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)無菌小鼠結(jié)腸中claudin-3和ZO-1蛋白表達(dá)。(D) GF-AOM組和GF-AOMS組小鼠血清中的LPS濃度。(E)電子顯微鏡顯示無菌小鼠結(jié)腸腸道屏障的結(jié)構(gòu)。箭頭指向細(xì)胞-細(xì)胞連接。(F)通過Mouse Cancer Pathway Finder PCR Array分析，與GF-AOM組相比，GF-AOMS組結(jié)腸上皮細(xì)胞差異表達(dá)基因。(G)通過富集分析，與GF-AOM組相比，GF-AOMS組癌癥信號(hào)通路的改變。箭頭表示富集方向，通過比較通路中上調(diào)和下調(diào)的基因來計(jì)算。MAPK信號(hào)通路中差異表達(dá)基因在網(wǎng)絡(luò)中顯示。(H)通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)GF-AOM和GF-AOMS組小鼠結(jié)腸中ERK1/2蛋白表達(dá)。(I)通過小鼠炎癥反應(yīng)和自身免疫陣列分析，與GF-AOM組相比，GF-AOMS組結(jié)腸上皮細(xì)胞差異表達(dá)基因。(J)通過富集分析，與GF-AOM相比，GF-AOMS組炎癥信號(hào)通路改變。TNF和IL-17信號(hào)通路中的差異表達(dá)基因在網(wǎng)絡(luò)中顯示。(K)定量RT-PCR檢測(cè)Il-17a、Cxcl2和Cxcr2基因表達(dá)。(a)緊密連接；(b)粘附連接；(c)橋粒；(d)間隙連接。星號(hào)表示被破壞的細(xì)胞連接。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD。*p<0.05；統(tǒng)計(jì)顯著性由雙尾非配對(duì)Student’s t檢驗(yàn)確定。    

9 香煙煙霧改變的微生物群會(huì)損害無菌小鼠的腸道屏障功能    

接下來，我們研究了香煙煙霧改變的微生物群是否會(huì)影響無菌小鼠的腸道屏障功能。我們觀察到GF-AOMS小鼠中claudin-3和ZO-1的表達(dá)降低，血清LPS水平升高(圖7C，D)。EM也證實(shí)了GF-AOMS小鼠腸道屏障功能受損，其顯示結(jié)腸頂端連接復(fù)合體的細(xì)胞間連接和細(xì)胞旁間隙變寬(圖7E)。這些無菌小鼠的結(jié)果與常規(guī)小鼠一致，因此表明香煙煙霧對(duì)微生物群和代謝組的改變可能會(huì)損害腸道屏障功能，從而進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤發(fā)生。    

10 香煙煙霧改變的微生物群增強(qiáng)了無菌小鼠結(jié)腸上皮中的致癌MAPK/ERK通路    

為了確認(rèn)香煙煙霧改變的微生物群促進(jìn)結(jié)腸細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，我們對(duì)灌胃的無菌小鼠的結(jié)腸上皮細(xì)胞進(jìn)行了Cancer Pathway Finder Array分析。與GF-AOM小鼠相比，我們?cè)贕F-AOMS小鼠中鑒定出9個(gè)上調(diào)基因和3個(gè)下調(diào)基因(圖7F，在線補(bǔ)充表4)。這些差異表達(dá)基因主要富集在MAPK/ERK信號(hào)通路中。與GF-AOM小鼠相比，GF-AOMS小鼠中磷酸化ERK1/2蛋白表達(dá)升高證實(shí)了MAPK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)的激活(圖7G和H)。此外，我們觀察到ERK磷酸化水平與TDCA水平呈正相關(guān)(在線補(bǔ)充圖4B)。同樣，使用炎癥反應(yīng)和自身免疫PCR陣列，我們發(fā)現(xiàn)與GF-AOM小鼠相比，GF-AOMS中有16個(gè)促炎基因上調(diào)(圖7I，在線補(bǔ)充表5)，這些基因也主要富集在TNF和IL-17信號(hào)通路中(圖7J)。通過定量RT-PCR，與GF-AOM小鼠相比，在GF-AOMS小鼠中TNF和IL-17通路中關(guān)鍵促炎基因上調(diào)，包括Il-17a和C-X-C基序趨化因子配體2(Cxcl2)和C-X-C基序趨化因子受體2(Cxcr2)(圖7K)。常規(guī)和無菌小鼠模型的一致發(fā)現(xiàn)表明，香煙煙霧改變的微生物群直接誘導(dǎo)結(jié)腸促炎TNF和IL-17信號(hào)通路和致癌MAPK/ERK信號(hào)通路。因此，改變的腸道微生物群有助于香煙煙霧在結(jié)直腸癌發(fā)生中的促腫瘤作用。    

討論

本研究首次建立了一種新的腸道微生物群介導(dǎo)的香煙煙霧誘導(dǎo)結(jié)直腸腫瘤發(fā)生的機(jī)制。吸煙是CRC的風(fēng)險(xiǎn)因素。然而，對(duì)吸煙引起的CRC的機(jī)制理解是有限的。盡管有幾項(xiàng)研究表明腸道微生物群與吸煙之間存在關(guān)聯(lián)，但仍不清楚因吸煙而改變的微生物群是否在CRC的發(fā)生和進(jìn)展中起重要作用。為了填補(bǔ)這一關(guān)鍵空白，我們使用AOM誘導(dǎo)的CRC小鼠模型和移植了香煙煙霧改變的微生物群的無菌小鼠進(jìn)行了涉及小鼠長期暴露于香煙煙霧的實(shí)驗(yàn)。    

本研究證明了吸煙可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群的組成和誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)來促進(jìn)結(jié)腸腫瘤的發(fā)生。特別是，據(jù)報(bào)道與CRC相關(guān)的E. lenta在暴露于香煙煙霧的小鼠中顯著富集。另一方面，已證明在暴露于香煙煙霧的小鼠中減少的P. distasonis會(huì)增加結(jié)腸緊密連接蛋白的表達(dá)并減弱結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生。已知的乳桿菌(L. reuteri、L.jensenii和L. crispatus)由于其抑制病原菌感染或增殖的能力，在暴露于香煙煙霧的小鼠中豐度較低。我們進(jìn)一步證明了在暴露于香煙煙霧的小鼠中富集的E. lenta和減少的乳桿菌物種之間的拮抗關(guān)系?？偠灾虏【脑黾雍捅Ｗo(hù)性細(xì)菌的減少一起促成了吸煙誘導(dǎo)的CRC腫瘤發(fā)生。    

本研究還發(fā)現(xiàn)，膽汁酸生物合成途徑是煙霧暴露小鼠糞便中最顯著富集的代謝途徑。初級(jí)膽汁酸在肝臟中合成并通過膽管分泌到腸道中。腸道共生菌群將初級(jí)膽汁酸轉(zhuǎn)化為次級(jí)膽汁酸，然后大部分被回腸末端和結(jié)腸吸收，少數(shù)隨糞便排出。由于其促進(jìn)腫瘤的特性，膽汁酸正受到越來越多的關(guān)注。在腸道微生物群衍生的次級(jí)膽汁酸中，我們證實(shí)暴露于煙霧的小鼠糞便中TDCA顯著增加。以前的研究表明，TDCA可以促進(jìn)結(jié)直腸和食管腺癌的發(fā)生。TDCA灌注到結(jié)腸腔增加了N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)誘導(dǎo)的結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生頻率。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，糞便代謝物的變化與腸道微生物豐度的變化顯著相關(guān)，其中TDCA與E. lenta正相關(guān)最為顯著。這一結(jié)果得到了先前研究的支持，這些研究表明E. lenta具有解偶聯(lián)初級(jí)膽汁酸并表達(dá)膽汁酸差向異構(gòu)酶3β-HSDH的能力。這些特性使其能夠參與次級(jí)膽汁酸的合成，從而影響糞便中的TDCA濃度。    

進(jìn)一步評(píng)估了小鼠的腸道屏障功能，并確定暴露于香煙煙霧的小鼠腸道屏障功能受損。Claudin-3和ZO-1這兩種重要的緊密連接蛋白的表達(dá)在暴露于香煙煙霧的小鼠中降低。腸道緊密連接受損可增加結(jié)腸通透性，從而使更多腸道有害代謝物(如TDCA)進(jìn)入結(jié)腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞間隙，激活MAPK/ERK信號(hào)通路。    

接下來研究了香煙煙霧促進(jìn)結(jié)腸腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制，并揭示了香煙煙霧誘導(dǎo)的MAPK/ERK通路的顯著富集和激活。這一結(jié)果與TDCA作為配體激活MAPK/ERK通路的功能一致。MAPK/ERK通路的激活對(duì)細(xì)胞增殖很重要，并被證明參與人類CRC發(fā)病機(jī)制、進(jìn)展和腫瘤發(fā)生。此外，我們發(fā)現(xiàn)香煙煙霧誘導(dǎo)促炎IL-17和TNF通路；IL-17已被證明可促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)展。先前的研究表明E. lenta在IBD患者中富集，它可以通過心苷還原酶2誘導(dǎo)IL-17a，支持我們的結(jié)果，即E. lenta可能會(huì)激活促炎細(xì)胞因子IL-17途徑以誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生。TNF-α通路的激活誘導(dǎo)結(jié)腸炎和結(jié)直腸癌的發(fā)生。這些發(fā)現(xiàn)共同表明，由煙霧相關(guān)的腸道菌群失調(diào)和代謝物改變觸發(fā)的致癌MAPK信號(hào)通路和促炎IL-17和TNF信號(hào)通路的激活有助于香煙煙霧相關(guān)的結(jié)腸腫瘤發(fā)生。    

在進(jìn)行糞便微生物群移植的無菌小鼠中進(jìn)一步研究了煙霧改變的腸道微生物群在腫瘤發(fā)生中的直接作用。僅香煙煙霧改變的腸道微生物群就可以增加無菌小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞的增殖。受體無菌小鼠的腸道微生物組成與供體暴露于煙霧的常規(guī)小鼠的腸道微生物組成相似。特別是，E. lenta在暴露于煙霧的AOM小鼠和GF-AOMS小鼠中均顯著富集。香煙煙霧改變的腸道微生物群也增加了糞便TDCA水平，并誘導(dǎo)GF-AOM小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞中MAPK/ERK、IL-17和TNF信號(hào)通路的激活。這些發(fā)現(xiàn)共同表明，香煙煙霧改變了腸道微生物群，從而通過增加結(jié)腸中的TDCA水平并進(jìn)一步激活結(jié)腸上皮中的致癌MAPK/ERK、IL-17和TNF信號(hào)通路來促進(jìn)結(jié)腸腫瘤的發(fā)生。此外，香煙煙霧改變的腸道微生物群損害了結(jié)腸上皮細(xì)胞，這可以通過緊密連接蛋白claudin-3和ZO-1的表達(dá)減少來證明。腸道屏障功能受損可能促進(jìn)致癌的TDCA進(jìn)入結(jié)腸上皮細(xì)胞間隙，進(jìn)一步激活致癌的MAPK/ERK信號(hào)通路。    

本研究通過調(diào)節(jié)腸道微生物群的組成證明了吸煙對(duì)CRC的促進(jìn)作用。與持續(xù)吸煙者相比，戒煙與改善CRC特異性生存率相關(guān)。因此，戒煙至少是通過重建健康的腸道微生物組來預(yù)防CRC的實(shí)用方法之一。綜上所述，本研究首次證明，香煙煙霧通過誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)來促進(jìn)結(jié)腸腫瘤的發(fā)生。煙霧引起的腸道菌群失調(diào)會(huì)增加結(jié)腸中TDCA水平，進(jìn)而激活結(jié)腸上皮中的致癌MAPK/ERK、IL-17和TNF信號(hào)通路。此外，腸道菌群失調(diào)引起的腸道屏障功能受損可能進(jìn)一步促進(jìn)TDCA激活MAPK/ERK信號(hào)通路。        

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