本申請涉及臨床醫(yī)學(xué)，具體涉及人慢性胰腺炎相關(guān)的蛋白標志物。具體而言，本申請涉及利用大鼠慢性胰腺炎疾病模型和質(zhì)譜分析獲得的人慢性胰腺炎疾病診斷、病情監(jiān)測相關(guān)的蛋白標志物的用途。

背景技術(shù)：

生物標志物是與生理或病理性過程相關(guān)的可監(jiān)測的變化。疾病標志物的研宄一直是近年的研究熱點和難點。合適的標志物意味著能夠更早、更靈敏的提示疾病發(fā)生發(fā)展情況，并為疾病的診療、預(yù)后提供準確的信息，從而更有利于病人的健康。

生物標志物的本質(zhì)是變化，尿液作為機體經(jīng)由泌尿系統(tǒng)及尿路排出體外的排泄物，富集全身的變化，敏感，不受穩(wěn)態(tài)機制的調(diào)控。因此其變化早，可以反映各種疾病早期的變化。這些變化就是潛在的疾病標志物(參見youheg.canurinebethegoldmineforbiomarkerdiscovery？scichinalifesci2013；43)。尿蛋白質(zhì)組學(xué)作為一種新穎，無創(chuàng)的分析工具，可以在尿液里挖掘疾病特異的早期生物標志物，目前尿蛋白組分析深度可鑒定到6000多個蛋白(zhao,m等人acomprehensiveurinaryproteomeanalysis:potentialapplicationsindiseasebiomarkerdiscoveryandvalidation.thelancet,2015.386:p.s63)。在疾病標志物的研究中具有重大的臨床應(yīng)用前景。

慢性胰腺炎(chronicpancreatitis，cp)是由各種病因引起胰腺組織和功能不可逆改變的慢性炎癥性疾病。其臨床表現(xiàn)主要為腹痛，病理表現(xiàn)主要為胰腺實質(zhì)慢性炎癥損害和間質(zhì)纖維化(tetsuhideito等人，evidence-basedclinicalpracticeguidelinesforchronicpancreatitis.2015[j].jgastroenterol，2016)。

近年來發(fā)病率逐年增加，病因復(fù)雜，病情遷延，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。目前臨床上對該疾病的診斷尤其是早期診斷仍然面臨很多挑戰(zhàn)。慢性胰腺炎的診斷方法主要有影像學(xué)檢查，胰腺功能檢查和胰腺活檢。影像學(xué)的信息不能在疾病更早期提供有價值的診斷線索，胰腺功能檢查敏感度低，以及胰腺活檢是cp診斷的確定性標準，但活檢本身存在一定的缺陷。因此，亟需開發(fā)無創(chuàng)的生物標志物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于本領(lǐng)域的上述需求，根據(jù)本公開的一些實施方案，提供了蛋白的鑒定試劑在制備用于診斷慢性胰腺炎的試劑中的用途，其中所述鑒定試劑特異于選自以下任一項或其組合：

cd48抗原、igγ-1鏈c區(qū)、l-乳酸脫氫酶b鏈、na(+)/h(+)交換調(diào)節(jié)因子nhe-rf3、thy-1膜糖蛋白、t-激肽原2、v型質(zhì)子atp酶亞單位s1、α2-巰基糖蛋白、α-2-巰基糖蛋白、β-2-微球蛋白、氨基?；?1a、白介素-4受體α亞單位、半胱氨酸蛋白酶抑制劑-b、巢蛋白-2、淀粉樣βa4蛋白、多聚免疫球蛋白受體、二肽基肽酶2、分揀蛋白、分泌型焦磷酸蛋白24、鈣粘蛋白-2、谷氨酰胺基肽酶、谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亞單位(gclc)、核連蛋白-2、黃曲霉素b1醛還原酶3、肌動蛋白胞質(zhì)1、基質(zhì)-重構(gòu)-相關(guān)蛋白8、甲基多巴aβ亞基、膠原c-肽鏈內(nèi)切酶增強子1、聚糖蛋白-3、聚糖核心蛋白、醌氧化還原酶、磷蛋白質(zhì)分泌24、磷酸甘油酸酯變位酶1、磷酸賴氨酸磷酸組氨酸亞磷酸無機焦磷酸磷酸酶、硫酸軟骨素蛋白多糖4、氯胞內(nèi)通道蛋白1、鈉依賴的中性氨基酸載體b(0)at3、內(nèi)皮細胞選擇性粘附分子、凝血素、前列腺腺激肽釋放酶-6、線粒體犬尿氨酸/α氨基乙二酸轉(zhuǎn)氨酶、軟骨低聚物基質(zhì)蛋白、神經(jīng)細胞黏附分子1、生長抑制蛋白6、雙糖鏈蛋白多糖、碳酸酐酶1、唾液酸o-乙酰酯酶、纖連蛋白、血清淀粉樣p物質(zhì)、乙醇脫氫酶(輔酶ⅱ(+))、中性和堿性氨基酸運輸?shù)鞍踪|(zhì)rbat、組織α-左旋巖藻糖苷酶。

在具體的實施方案中，和健康對照相比較，選自以下蛋白的表達水平降低指示所述受試者患有慢性胰腺炎：cd48抗原、l-乳酸脫氫酶b鏈、na(+)/h(+)交換調(diào)節(jié)因子nhe-rf3、thy-1膜糖蛋白、v型質(zhì)子atp酶亞單位s1、α-2-巰基糖蛋白、氨基酰化酶-1a、白介素-4受體α亞單位、半胱氨酸蛋白酶抑制劑-b、巢蛋白-2、淀粉樣βa4蛋白、二肽基肽酶2、分揀蛋白、分泌型焦磷酸蛋白24、鈣粘蛋白-2、谷氨酰胺基肽酶、谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亞單位、黃曲霉素b1醛還原酶3、肌動蛋白胞質(zhì)1、基質(zhì)-重構(gòu)-相關(guān)蛋白8、甲基多巴aβ亞基、膠原c-肽鏈內(nèi)切酶增強子1、聚糖蛋白-3、聚糖核心蛋白、醌氧化還原酶、磷蛋白質(zhì)分泌24、磷酸甘油酸酯變位酶1、磷酸賴氨酸磷酸組氨酸亞磷酸無機焦磷酸磷酸酶、硫酸軟骨素蛋白多糖4、氯胞內(nèi)通道蛋白1、鈉依賴的中性氨基酸載體b(0)at3、內(nèi)皮細胞選擇性粘附分子、凝血素、線粒體犬尿氨酸/α氨基乙二酸轉(zhuǎn)氨酶、軟骨低聚物基質(zhì)蛋白、神經(jīng)細胞黏附分子1、生長抑制蛋白6、雙糖鏈蛋白多糖、唾液酸o-乙酰酯酶、纖連蛋白、血清淀粉樣p物質(zhì)、乙醇脫氫酶(輔酶ⅱ(+))、中性和堿性氨基酸運輸?shù)鞍踪|(zhì)rbat、組織α-左旋巖藻糖苷酶、及其組合。

在具體的實施方案中，和健康對照相比較，選自以下蛋白的表達水平提高指示所述受試者患有慢性胰腺炎：igγ-1鏈c區(qū)、t-激肽原2、β-2-微球蛋白、多聚免疫球蛋白受體、核連蛋白-2、前列腺腺激肽釋放酶-6、碳酸酐酶1及其組合。

在具體的實施方案中，健康對照是指未患有慢性胰腺炎的個體。

在另一個實施方案中，提供了選自以下的蛋白的鑒定試劑在制備用于受試者的慢性胰腺炎早期診斷的試劑中的用途，其中所述鑒定試劑特異于選自以下任一項或其組合：igγ-1鏈c區(qū)、核連蛋白-2、β-2-微球蛋白、白介素-4受體α亞單位、磷酸甘油酸酯變位酶1、二肽基肽酶2、分泌型焦磷酸蛋白24、聚糖核心蛋白、內(nèi)皮細胞選擇性粘附分子、巢蛋白-2、血清淀粉樣p物質(zhì)、神經(jīng)細胞黏附分子1、磷酸賴氨酸磷酸組氨酸亞磷酸無機焦磷酸磷酸酶、軟骨低聚物基質(zhì)蛋白及其組合。

在具體的實施方案中，和健康對照中的蛋白水平相比較，選自以下的蛋白的表達水平提高指示所述受試者存在慢性胰腺炎的早期損傷：igγ-1鏈c區(qū)、核連蛋白-2和β-2-微球蛋白。

在具體的實施方案中，相較于健康對照，選自以下的蛋白的表達水平降低指示所述受試者患有慢性胰腺炎：白介素-4受體α亞單位、磷酸甘油酸酯變位酶1、二肽基肽酶2、分泌型焦磷酸蛋白24、聚糖核心蛋白、內(nèi)皮細胞選擇性粘附分子、巢蛋白-2、血清淀粉樣p物質(zhì)、神經(jīng)細胞黏附分子1、磷酸賴氨酸磷酸組氨酸亞磷酸無機焦磷酸磷酸酶、軟骨低聚物基質(zhì)蛋白、及其組合。

在具體的實施方案中，健康對照是指未患有慢性胰腺炎的個體。

在另一個實施方案中，提供了鑒定試劑在制備用于受試者的慢性胰腺炎嚴重程度監(jiān)測試劑中的用途，其中所述鑒定試劑特異于選自以下的蛋白：β-2-微球蛋白、t-激肽原2、碳酸酐酶1、多聚免疫球蛋白受體、聚糖核心蛋白、磷酸甘油酸酯變位酶1、二肽基肽酶2、內(nèi)皮細胞選擇性粘附分子、巢蛋白-2、血清淀粉樣p物質(zhì)、磷蛋白質(zhì)分泌24、神經(jīng)細胞黏附分子1、磷酸賴氨酸磷酸組氨酸亞磷酸無機焦磷酸磷酸酶、軟骨低聚物基質(zhì)蛋白、cd48抗原、聚糖蛋白-3、基質(zhì)-重構(gòu)-相關(guān)蛋白8、淀粉樣βa4蛋白、硫酸軟骨素蛋白多糖4、thy-1膜糖蛋白、纖連蛋白、α2-巰基糖蛋白、組織α-左旋巖藻糖苷酶、肌動蛋白胞質(zhì)1、生長抑制蛋白6、凝血素、醌氧化還原酶、中性和堿性氨基酸運輸?shù)鞍踪|(zhì)rbat、甲基多巴aβ亞基、線粒體犬尿氨酸/a-氨基乙二酸轉(zhuǎn)氨酶、及其組合。

在具體的實施方案中，和健康對照中的蛋白水平相比較，選自以下的蛋白的表達水平提高指示所述受試者慢性胰腺炎惡化：β-2-微球蛋白和t-激肽原2、碳酸酐酶1、多聚免疫球蛋白受體；相較于健康對照，受試者中選自以下的蛋白的表達水平降低指示所述受試者慢性胰腺炎惡化：聚糖核心蛋白、磷酸甘油酸酯變位酶1、二肽基肽酶2、內(nèi)皮細胞選擇性粘附分子、巢蛋白-2、血清淀粉樣p物質(zhì)、磷蛋白質(zhì)分泌24、神經(jīng)細胞黏附分子1、磷酸賴氨酸磷酸組氨酸亞磷酸無機焦磷酸磷酸酶、軟骨低聚物基質(zhì)蛋白、cd48抗原、聚糖蛋白-3、基質(zhì)-重構(gòu)-相關(guān)蛋白8、淀粉樣βa4蛋白、硫酸軟骨素蛋白多糖4、thy-1膜糖蛋白、纖連蛋白、α2-巰基糖蛋白、組織α-左旋巖藻糖苷酶、肌動蛋白胞質(zhì)1、生長抑制蛋白6、凝血素、醌氧化還原酶、中性和堿性氨基酸運輸?shù)鞍踪|(zhì)rbat、甲基多巴aβ亞基、線粒體犬尿氨酸/a-氨基乙二酸轉(zhuǎn)氨酶、及其組合。

適用于本公開的鑒定試劑是質(zhì)譜鑒定試劑、抗體或其抗原結(jié)合片段。在具體的實施方案中，抗體是單克隆抗體。本公開對單克隆抗體的物種來源沒有限制，任何能夠結(jié)合上述蛋白的抗體均可以使用。

在具體的實施方案中，抗原結(jié)合片段包括但不限于：fab、fab'、(fab')2、fv、scfv、雙特異抗體、三特異抗體、四特異抗體、雙-scfv。任何保留了抗原結(jié)合活性的抗體片段均適用于本公開。

在具體的實施方式中，根據(jù)本公開的蛋白標記物能夠用于診斷和/或預(yù)后慢性胰腺炎。

在具體的實施方案中，表達水平選自核酸水平和蛋白質(zhì)水平，尤其是蛋白質(zhì)水平。

在具體的實施方案中，所述受試者是哺乳動物，優(yōu)選是人。

在具體的實施方案中，表達水平是在尿液樣本中測定的。

在具體的實施方案中，所述蛋白是尿液蛋白。

根據(jù)另一些實施方案，還提供了一種用于診斷慢性胰腺炎的試劑盒或芯片，其包含選自以下的蛋白的鑒定試劑、或者由選自以下的蛋白的鑒定試劑組成：cd48抗原、igγ-1鏈c區(qū)、l-乳酸脫氫酶b鏈、na(+)/h(+)交換調(diào)節(jié)因子nhe-rf3、thy-1膜糖蛋白、t-激肽原2、v型質(zhì)子atp酶亞單位s1、α2-巰基糖蛋白、α-2-巰基糖蛋白、β-2-微球蛋白、氨基酰化酶-1a、白介素-4受體α亞單位、半胱氨酸蛋白酶抑制劑-b、巢蛋白-2、淀粉樣βa4蛋白、多聚免疫球蛋白受體、二肽基肽酶2、分揀蛋白、分泌型焦磷酸蛋白24、鈣粘蛋白-2、谷氨酰胺基肽酶、谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亞單位、核連蛋白-2、黃曲霉素b1醛還原酶3、肌動蛋白胞質(zhì)1、基質(zhì)-重構(gòu)-相關(guān)蛋白8、甲基多巴aβ亞基、膠原c-肽鏈內(nèi)切酶增強子1、聚糖蛋白-3、聚糖核心蛋白、醌氧化還原酶、磷蛋白質(zhì)分泌24、磷酸甘油酸酯變位酶1、磷酸賴氨酸磷酸組氨酸亞磷酸無機焦磷酸磷酸酶、硫酸軟骨素蛋白多糖4、氯胞內(nèi)通道蛋白1、鈉依賴的中性氨基酸載體b(0)at3、內(nèi)皮細胞選擇性粘附分子、凝血素、前列腺腺激肽釋放酶-6、線粒體犬尿氨酸/α氨基乙二酸轉(zhuǎn)氨酶、軟骨低聚物基質(zhì)蛋白、神經(jīng)細胞黏附分子1、生長抑制蛋白6、雙糖鏈蛋白多糖、碳酸酐酶1、唾液酸o-乙酰酯酶、纖連蛋白、血清淀粉樣p物質(zhì)、乙醇脫氫酶(輔酶ⅱ(+))、中性和堿性氨基酸運輸?shù)鞍踪|(zhì)rbat、組織α-左旋巖藻糖苷酶及其組合。

在一些實施方案中，試劑盒中包含上述蛋白的鑒定試劑。在另一些實施方案中，芯片上固定有上述蛋白的鑒定試劑。在一些實施方案中，所述鑒定試劑是抗體或其抗原結(jié)合片段。

在具體的實施方案中，提供了一種用于慢性胰腺炎早期診斷的試劑盒或芯片，其包含選自以下的蛋白的鑒定試劑、或者由選自以下的蛋白的鑒定試劑組成：igγ-1鏈c區(qū)、核連蛋白-2、β-2-微球蛋白、白介素-4受體α亞單位、磷酸甘油酸酯變位酶1、二肽基肽酶2、分泌型焦磷酸蛋白24、聚糖核心蛋白、內(nèi)皮細胞選擇性粘附分子、巢蛋白-2、血清淀粉樣p物質(zhì)、神經(jīng)細胞黏附分子1、磷酸賴氨酸磷酸組氨酸亞磷酸無機焦磷酸磷酸酶、軟骨低聚物基質(zhì)蛋白。

在另一些具體的實施方案中，提供了一種用于監(jiān)測受試者慢性胰腺炎嚴重程度的試劑盒或芯片，其包含選自以下的蛋白的鑒定試劑、或者由選自以下的蛋白的鑒定試劑組成：β-2-微球蛋白、t-激肽原2、碳酸酐酶1、多聚免疫球蛋白受體、聚糖核心蛋白、磷酸甘油酸酯變位酶1、二肽基肽酶2、內(nèi)皮細胞選擇性粘附分子、巢蛋白-2、血清淀粉樣p物質(zhì)、磷蛋白質(zhì)分泌24、神經(jīng)細胞黏附分子1、磷酸賴氨酸磷酸組氨酸亞磷酸無機焦磷酸磷酸酶、軟骨低聚物基質(zhì)蛋白、cd48抗原、聚糖蛋白-3、基質(zhì)-重構(gòu)-相關(guān)蛋白8、淀粉樣βa4蛋白、硫酸軟骨素蛋白多糖4、thy-1膜糖蛋白、纖連蛋白、α2-巰基糖蛋白、組織α-左旋巖藻糖苷酶、肌動蛋白胞質(zhì)1、生長抑制蛋白6、凝血素、醌氧化還原酶、中性和堿性氨基酸運輸?shù)鞍踪|(zhì)rbat、甲基多巴aβ亞基、線粒體犬尿氨酸/a-氨基乙二酸轉(zhuǎn)氨酶。

根據(jù)一些實施方案，提供了一種用于診斷受試者中慢性胰腺炎的方法，包括步驟：

1)獲得受試者的尿液樣本，

2)任選地，從尿液樣本中分離尿蛋白，

3)確定受試者尿液樣本中選自以下的蛋白的表達水平：cd48抗原、igγ-1鏈c區(qū)、l-乳酸脫氫酶b鏈、na(+)/h(+)交換調(diào)節(jié)因子nhe-rf3、thy-1膜糖蛋白、t-激肽原2、v型質(zhì)子atp酶亞單位s1、α2-巰基糖蛋白、α-2-巰基糖蛋白、β-2-微球蛋白、氨基?；?1a、白介素-4受體α亞單位、半胱氨酸蛋白酶抑制劑-b、巢蛋白-2、淀粉樣βa4蛋白、多聚免疫球蛋白受體、二肽基肽酶2、分揀蛋白、分泌型焦磷酸蛋白24、鈣粘蛋白-2、谷氨酰胺基肽酶、谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亞單位、核連蛋白-2、黃曲霉素b1醛還原酶3、肌動蛋白胞質(zhì)1、基質(zhì)-重構(gòu)-相關(guān)蛋白8、甲基多巴aβ亞基、膠原c-肽鏈內(nèi)切酶增強子1、聚糖蛋白-3、聚糖核心蛋白、醌氧化還原酶、磷蛋白質(zhì)分泌24、磷酸甘油酸酯變位酶1、磷酸賴氨酸磷酸組氨酸亞磷酸無機焦磷酸磷酸酶、硫酸軟骨素蛋白多糖4、氯胞內(nèi)通道蛋白1、鈉依賴的中性氨基酸載體b(0)at3、內(nèi)皮細胞選擇性粘附分子、凝血素、前列腺腺激肽釋放酶-6、線粒體犬尿氨酸/α氨基乙二酸轉(zhuǎn)氨酶、軟骨低聚物基質(zhì)蛋白、神經(jīng)細胞黏附分子1、生長抑制蛋白6、雙糖鏈蛋白多糖、碳酸酐酶1、唾液酸o-乙酰酯酶、纖連蛋白、血清淀粉樣p物質(zhì)、乙醇脫氫酶(輔酶ⅱ(+))、中性和堿性氨基酸運輸?shù)鞍踪|(zhì)rbat、組織α-左旋巖藻糖苷酶、及其組合。

在具體的實施方案中，使用質(zhì)譜方法、elisa方法、或western方法確定表達水平。

當采用質(zhì)譜方法確定蛋白及其表達水平時，在獲得尿液樣本的步驟之后，還可以包括消化步驟。在具體的實施方式中，用蛋白酶消化尿液樣本中的蛋白。

根據(jù)一些實施方案，提供了一種用于早期診斷受試者中慢性胰腺炎的方法，包括步驟：

1)獲得受試者和健康對照的尿液樣本，

2)確定受試者和健康對照的尿液樣本中選自以下的蛋白的表達水平：igγ-1鏈c區(qū)、核連蛋白-2、β-2-微球蛋白、白介素-4受體α亞單位、磷酸甘油酸酯變位酶1、二肽基肽酶2、分泌型焦磷酸蛋白24、聚糖核心蛋白、內(nèi)皮細胞選擇性粘附分子、巢蛋白-2、血清淀粉樣p物質(zhì)、神經(jīng)細胞黏附分子1、磷酸賴氨酸磷酸組氨酸亞磷酸無機焦磷酸磷酸酶、軟骨低聚物基質(zhì)蛋白、及其組合，

3)將受試者中所述蛋白的表達水平和健康對照中所述蛋白的表達水平進行比較，

4)確定所述受試者是否患有慢性胰腺炎。

根據(jù)一些實施方案，提供了一種用于監(jiān)測受試者中慢性胰腺炎嚴重程度的方法，包括步驟：

1)獲得受試者和健康對照的尿液樣本，

2)和健康對照相比，確定受試者尿液樣本中選自以下的蛋白的表達水平：β-2-微球蛋白、t-激肽原2、碳酸酐酶1、多聚免疫球蛋白受體、聚糖核心蛋白、磷酸甘油酸酯變位酶1、二肽基肽酶2、內(nèi)皮細胞選擇性粘附分子、巢蛋白-2、血清淀粉樣p物質(zhì)、磷蛋白質(zhì)分泌24、神經(jīng)細胞黏附分子1、磷酸賴氨酸磷酸組氨酸亞磷酸無機焦磷酸磷酸酶、軟骨低聚物基質(zhì)蛋白、cd48抗原、聚糖蛋白-3、基質(zhì)-重構(gòu)-相關(guān)蛋白8、淀粉樣βa4蛋白、硫酸軟骨素蛋白多糖4、thy-1膜糖蛋白、纖連蛋白、α2-巰基糖蛋白、組織α-左旋巖藻糖苷酶、肌動蛋白胞質(zhì)1、生長抑制蛋白6、凝血素、醌氧化還原酶、中性和堿性氨基酸運輸?shù)鞍踪|(zhì)rbat、甲基多巴aβ亞基、線粒體犬尿氨酸/a-氨基乙二酸轉(zhuǎn)氨酶、及其組合，

3)將受試者所述蛋白的表達水平和健康對照所述蛋白的表達水平進行比較，

4)確定所述受試者的慢性胰腺炎是否進展或惡化。

附圖說明

圖1：慢性胰腺炎組大鼠和對照組大鼠體重監(jiān)測結(jié)果?！翊砟Ｐ徒M；■代表正常對照組。*表示p<0.05；**表示p<0.01。

圖2a至圖2e：對照組(a)、慢性胰腺炎模型第14(b)、21(c)、28(d)和42天組(e)的大鼠胰腺組織切片he染色結(jié)果。

圖3a至圖3d：對照組(a)、慢性胰腺炎模型第21(b)、28(c)和42天組(d)的大鼠胰腺組織切片馬松染色結(jié)果。

具體實施方式

下面將通過下述非限制性實施例進一步說明本申請。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在不背離本申請精神的情況下，可以對本申請做出許多修改，這樣的修改也落入本申請的范圍。如無特別說明，所使用的實驗材料均可從商業(yè)公司獲取。

實施例

實施例1：慢性胰腺炎大鼠模型的建立

二乙基二硫代氮基甲酸鈉(diethyldithiocarbamate，ddc)誘導(dǎo)的慢性胰腺炎大鼠模型纖維化可以模擬慢性胰腺炎疾病發(fā)生的過程(參見naokimatsumura等人，studyonfreeradicalsandpancreaticfibrosis-pancreaticfibrosisinducedbyrepeatedinjectionsofsuperoxidedismutaseinhibitorpanereas，2001，22；53-57)。觀察胰腺纖維化從正常、早期纖維化、纖維化進展的整體變化，其病理過程和病理特征與人類的慢性胰腺炎相似。ddc腹腔注射引起大鼠胰腺損傷呈一個漸進性過程，且具有很好的重復(fù)性。利用該動物模型模擬慢性胰腺炎的發(fā)病過程，對臨床上早期診斷、監(jiān)測病情進展有重要的指導(dǎo)意義。

在本申請中，采用二乙基二硫代氨基甲酸鈉(ddc)腹腔注射法誘導(dǎo)大鼠慢性胰腺炎動物模型，本申請收集慢性胰腺炎大鼠在早期階段(第14天)和中晚階段(第21天、28天)的尿液。利用該動物模型模擬慢性胰腺炎，對臨床上慢性胰腺炎的早期診斷、治療和預(yù)后有重要的指導(dǎo)意義。

1.材料與試劑

1)儀器：

大鼠代謝籠：購自北京佳源興業(yè)科技有限公司。thermoorbitrapfusionlumos質(zhì)譜儀：購自thermofisherscientific公司；thermoeasy-nlc1200高效液相色譜儀：購自thermofisherscientific公司；millliqrg超純水系統(tǒng)：購自millipore公司；c18反相分析柱(rp柱，0.1×150mm，3μm，)：購自michrombioresources公司。

2)主要試劑：

二乙基二硫代氨基甲酸鈉(diethyldithiocarbamate，ddc)從sigma公司購買；去離子水來源于millliqrg超純水系統(tǒng)；色譜級乙腈、甲酸和甲醇為fisher公司生產(chǎn)；碘乙酰銨(iaa)、碳酸氫銨、二硫蘇糖醇(dtt)從merck公司購買；測序級胰酶從sigma公司購買。

3)動物：

雄性wistar大鼠(體重180至200g)購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，在標準飼養(yǎng)環(huán)境中飼養(yǎng)。

2.實驗方法

1)慢性胰腺炎大鼠模型建立以及樣品收集：

慢性胰腺炎大鼠模型建立步驟：用無菌1ml注射器腹腔注射，根據(jù)大鼠體重，注射ddc量為500mg/kg。

對照組的大鼠模型建立步驟：用無菌1ml注射器腹腔注射，根據(jù)大鼠體重，注射生理鹽水量為500mg/kg。

樣品收集流程：在造模之前，將大鼠置于代謝籠中收集正常尿液，造模過程中第7天、14天、21天、28天將大鼠置于代謝籠中收集尿液樣本。

2)指標檢測：

體重監(jiān)測：每次注射ddc前測量大鼠的體重。

胰腺組織病理學(xué)：在造模第7、14、21、28、42天，將實施例1中的部分大鼠安樂死并取大鼠胰腺組織。將胰腺從每個動物中取出，并在4℃下在4％甲醛通過浸入固定。切片，后用h&e染色和masson染色觀察胰腺組織發(fā)生的變化。

實施例2

1.尿蛋白提取與保存：

尿液于4℃2000g離心30分鐘，取上清，置于新ep管內(nèi)，繼續(xù)12000g4℃離心30分鐘；取上清，-80℃保存。

乙醇沉淀尿液蛋白，用bradford法測蛋白濃度后進行膜上酶切，參見wisniewskijr,zougmana,nagarajn,mannm.universalsamplepreparationmethodforproteomeanalysis.naturemethods2009；6:359-62。bca法測量多肽濃度。

2.lc-ms/ms串聯(lián)質(zhì)譜分析：

將多肽樣本用0.1％甲酸稀釋成0.5μg/μl。多肽樣本通過thermo液相系統(tǒng)easy-nlc1200上樣系統(tǒng)分離。洗脫時間120分鐘，色譜柱流速為0.3μl/min。洗脫梯度為5％至40％流動相b(流動相a為：0.1％甲酸；流動相b為：89.9％乙腈)。洗脫下的肽段使用thermoorbitraplumos質(zhì)譜儀進行分析。采用陽離子模式，母離子和子離子的分辨率為120000。

3.數(shù)據(jù)庫檢索：

所有質(zhì)譜結(jié)果用mascot軟件進行數(shù)據(jù)庫檢索。所用數(shù)據(jù)庫為swiss-protratdatabase。檢索條件為：胰酶酶切；允許有2個漏切位點；半胱氨酸為固定修飾；蛋氨酸的氧化和蛋白質(zhì)n-末端乙酰化是可變修飾。thermoorbitrapfusionlumos數(shù)據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索容許誤差為：母離子0.05da，子離子0.05da。

4.相對定量分析結(jié)果：

所有質(zhì)譜結(jié)果通過初級lc-ms/ms軟件進行相對定量結(jié)果分析。軟件操作根據(jù)文獻中所示方法使用(參見haucksm,dietterj,kramerrl等人.decipheringmembrane-associatedmolecularprocessesintargettissueofautoimmuneuveitisbylabel-freequantitativemassspectrometry.molecular&cellularproteomics:mcp2010；9:2292-305)。

5.統(tǒng)計分析：

將不同時間點的蛋白組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，篩選出于造模前0天相比譜圖數(shù)變化倍數(shù)在2倍以上，p值小于0.05的蛋白作為差異蛋白。

6.實驗結(jié)果：

(1)體重變化

如圖1所示，從第10天起實驗組的體重低于對照組，并且實驗組與對照組體重有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(圖1)。

(2)病理檢測結(jié)果

如圖2a至2e，he染色結(jié)果顯示：對照組，顯示正常的組織結(jié)構(gòu)(圖2a)；ddc誘導(dǎo)慢性胰腺炎大鼠實驗組，問質(zhì)不同程度的水腫、增寬、炎性細胞細胞浸潤、部分出現(xiàn)胰腺實質(zhì)壞死、出血、胰腺導(dǎo)管壁增厚和細胞增多。并隨著時間的推進程度加深(圖2b至2e)。

如圖3，馬松(masson’strichromestaining)染色結(jié)果顯示，對照組，顯示正常的組織結(jié)構(gòu)(圖3a)；ddc誘導(dǎo)慢性胰腺炎大鼠實驗組在21天開始，胰腺小葉和間隔不同程度的纖維組織增生，并隨著時間的推進胰腺纖維化程度不斷進展(圖3b至3d)，說明造模成功。

(3)對照組和慢性胰腺炎組大鼠(n＝3)的尿液經(jīng)過質(zhì)譜鑒定，分別進行2次技術(shù)重復(fù)。在fdr小于1％的水平，基于兩肽以上鑒定的蛋白為557個。

與0天蛋白定量的譜圖數(shù)進行比對，篩選出其他時間點變化倍數(shù)在2倍以上及重復(fù)測量anovap值小于0.05的差異蛋白，同時使用uniprot數(shù)據(jù)庫將大鼠蛋白轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的人同源蛋白。

與對照組的相比，慢性胰腺炎14天組尿中的大鼠差異蛋白為21個、慢性胰腺炎21天組尿中的大鼠差異蛋白為32個、慢性胰腺炎28天組尿中的大鼠差異蛋白為40個。

將不同時間點的慢性胰腺炎模型與對照組大鼠尿蛋白進行比較，經(jīng)過anova統(tǒng)計學(xué)分析以及變化倍數(shù)篩選，可靠的差異蛋白人同源的有52個，分別為：cd48抗原、igγ-1鏈c區(qū)、l-乳酸脫氫酶b鏈、na(+)/h(+)交換調(diào)節(jié)因子nhe-rf3、thy-1膜糖蛋白、t-激肽原2、v型質(zhì)子atp酶亞單位s1、α2-巰基糖蛋白、β-2-微球蛋白、氨基?；?1a、白介素-4受體α亞單位、半胱氨酸蛋白酶抑制劑-b、巢蛋白-2、淀粉樣βa4蛋白、多聚免疫球蛋白受體、二肽基肽酶2、分揀蛋白、分泌型焦磷酸蛋白24、鈣粘蛋白-2、谷氨酰胺基肽酶、谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亞單位、核連蛋白-2、黃曲霉素b1醛還原酶3、肌動蛋白胞質(zhì)1、基質(zhì)-重構(gòu)-相關(guān)蛋白8、甲基多巴aβ亞基、膠原c-肽鏈內(nèi)切酶增強子1、聚糖蛋白-3、聚糖核心蛋白、醌氧化還原酶、磷蛋白質(zhì)分泌24、磷酸甘油酸酯變位酶1、磷酸賴氨酸磷酸組氨酸亞磷酸無機焦磷酸磷酸酶、硫酸軟骨素蛋白多糖4、氯胞內(nèi)通道蛋白1、鈉依賴的中性氨基酸載體b(0)at3、內(nèi)皮細胞選擇性粘附分子、凝血素、前列腺腺激肽釋放酶-6、線粒體犬尿氨酸/α氨基乙二酸轉(zhuǎn)氨酶、軟骨低聚物基質(zhì)蛋白、神經(jīng)細胞黏附分子1、生長抑制蛋白6、雙糖鏈蛋白多糖、碳酸酐酶1、唾液酸o-乙酰酯酶、纖連蛋白、血清淀粉樣p物質(zhì)、乙醇脫氫酶(輔酶ⅱ(+))、中性和堿性氨基酸運輸?shù)鞍踪|(zhì)rbat、組織α-左旋巖藻糖苷酶。

相較于健康對照，慢性胰腺炎組中表達水平提高的尿蛋白共7個，分別為igγ-1鏈c區(qū)、t-激肽原2、β-2-微球蛋白、多聚免疫球蛋白受體、核連蛋白-2、前列腺腺激肽釋放酶-6、碳酸酐酶1。

相較于健康對照，慢性胰腺炎組中表達水平降低的尿蛋白的45個，分別為cd48抗原、l-乳酸脫氫酶b鏈、na(+)/h(+)交換調(diào)節(jié)因子nhe-rf3、thy-1膜糖蛋白、v型質(zhì)子atp酶亞單位s1、α2-巰基糖蛋白、氨基?；?1a、白介素-4受體α亞單位、半胱氨酸蛋白酶抑制劑-b、巢蛋白-2、淀粉樣βa4蛋白、二肽基肽酶2、分揀蛋白、分泌型焦磷酸蛋白24、鈣粘蛋白-2、谷氨酰胺基肽酶、谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亞單位、黃曲霉素b1醛還原酶3、肌動蛋白胞質(zhì)1、基質(zhì)-重構(gòu)-相關(guān)蛋白8、甲基多巴aβ亞基、膠原c-肽鏈內(nèi)切酶增強子1、聚糖蛋白-3、聚糖核心蛋白、醌氧化還原酶、磷蛋白質(zhì)分泌24、磷酸甘油酸酯變位酶1、磷酸賴氨酸磷酸組氨酸亞磷酸無機焦磷酸磷酸酶、硫酸軟骨素蛋白多糖4、氯胞內(nèi)通道蛋白1、鈉依賴的中性氨基酸載體b(0)at3、內(nèi)皮細胞選擇性粘附分子、凝血素、線粒體犬尿氨酸/α氨基乙二酸轉(zhuǎn)氨酶、軟骨低聚物基質(zhì)蛋白、神經(jīng)細胞黏附分子1、生長抑制蛋白6、雙糖鏈蛋白多糖、唾液酸o-乙酰酯酶、纖連蛋白、血清淀粉樣p物質(zhì)、乙醇脫氫酶(輔酶ⅱ(+))、中性和堿性氨基酸運輸?shù)鞍踪|(zhì)rbat、組織α-左旋巖藻糖苷酶。

由于在建模后第14天，慢性胰腺炎組和對照組大鼠病理檢測與對照組相比未出現(xiàn)顯著差異。因此，在慢性胰腺炎早期(造模14天)篩選出差異蛋白14個(表1)。轉(zhuǎn)化為人同源蛋白后，在慢性胰腺炎早期，igγ-1鏈c區(qū)、核連蛋白-2和β-2-微球蛋白的表達水平提高；白介素-4受體α亞單位、磷酸甘油酸酯變位酶1、二肽基肽酶2、分泌型焦磷酸蛋白24、聚糖核心蛋白、內(nèi)皮細胞選擇性粘附分子、巢蛋白-2、血清淀粉樣p物質(zhì)、神經(jīng)細胞黏附分子1、磷酸賴氨酸磷酸組氨酸亞磷酸無機焦磷酸磷酸酶、軟骨低聚物基質(zhì)蛋白表達量降低。

其中，有11個差異蛋白，分別為：磷酸甘油酸酯變位酶1、二肽基肽酶2、分泌型焦磷酸蛋白24、聚糖核心蛋白、內(nèi)皮細胞選擇性粘附分子、巢蛋白-2、血清淀粉樣p物質(zhì)、神經(jīng)細胞黏附分子1、磷酸賴氨酸磷酸組氨酸亞磷酸無機焦磷酸磷酸酶、軟骨低聚物基質(zhì)蛋白、β-2-微球蛋白在慢性胰腺炎的其他階段也有明顯差異(表2)，說明了這些蛋白作為疾病早期診斷的可靠性。

表1.慢性胰腺炎早期診斷的尿液蛋白標志物

由于在建模后第21天開始，慢性胰腺炎組相比對照組大鼠病理masson染色出現(xiàn)明顯纖維化。因此，對第14、21和28天的慢性胰腺炎組被重復(fù)鑒定到質(zhì)譜差異蛋白進行匯總，可以用于檢測慢性胰腺炎的病情進展(表2)。

和健康對照中的蛋白水平相比較，β-2-微球蛋白和t-激肽原2、碳酸酐酶1、多聚免疫球蛋白受體的表達水平提高；

和健康對照中的蛋白水平相比較，聚糖核心蛋白、磷酸甘油酸酯變位酶1、二肽基肽酶2、內(nèi)皮細胞選擇性粘附分子、巢蛋白-2、血清淀粉樣p物質(zhì)、磷蛋白質(zhì)分泌24、神經(jīng)細胞黏附分子1、磷酸賴氨酸磷酸組氨酸亞磷酸無機焦磷酸磷酸酶、軟骨低聚物基質(zhì)蛋白、cd48抗原、聚糖蛋白-3、基質(zhì)-重構(gòu)-相關(guān)蛋白8、淀粉樣βa4蛋白、硫酸軟骨素蛋白多糖4、thy-1膜糖蛋白、纖連蛋白、α2-巰基糖蛋白、組織α-左旋巖藻糖苷酶、肌動蛋白胞質(zhì)1、生長抑制蛋白6、凝血素、醌氧化還原酶、中性和堿性氨基酸運輸?shù)鞍踪|(zhì)rbat、甲基多巴aβ亞基、線粒體犬尿氨酸/a-氨基乙二酸轉(zhuǎn)氨酶的表達水平降低。

表2.在慢性胰腺炎進展過程中蛋白表達水平的變化

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