本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體的說，本發(fā)明涉及一種防治胰腺炎的中藥及其總黃酮提取物。

背景技術(shù)：

胰腺炎可以為急性(新出現(xiàn)、短期)或慢性(持續(xù)、長(zhǎng)期)。

急性胰腺炎(ap)是導(dǎo)致顯著發(fā)病率和死亡率的常見疾病。其發(fā)病早期會(huì)發(fā)生器官功能衰竭和全身炎癥反應(yīng)綜合征，晚期會(huì)出現(xiàn)壞死組織的感染。目前，急性胰腺炎的治療和預(yù)后仍具有挑戰(zhàn)性，具有高病死率、高致殘率、高額費(fèi)用的特點(diǎn)。在對(duì)胰腺的損傷開始之后急性胰腺炎通常立即開始，發(fā)作通常非常輕微，輕微發(fā)作可持續(xù)較短時(shí)間，并通常在胰腺恢復(fù)其正常狀態(tài)時(shí)完全復(fù)原，急性胰腺炎的反復(fù)發(fā)作會(huì)形成慢性胰腺炎。

慢性胰腺炎(cp)，主要臨床表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的上腹部疼痛和胰腺內(nèi)、外分泌功能不全，且發(fā)病率呈逐年增高的趨勢(shì)，嚴(yán)重危害人類健康。不僅如此，臨床上反復(fù)發(fā)作、持續(xù)進(jìn)展的cp有相當(dāng)?shù)奈ｋU(xiǎn)性發(fā)展成為胰腺癌(約10％)，胰腺癌預(yù)后極差，在總癌癥死亡率中占第8位，發(fā)達(dá)國(guó)家高居第4位，且大部分病人在確診后一年內(nèi)死亡。迄今，cp的發(fā)病機(jī)理、病理生理和臨床過程仍不十分清楚，尚無理想的治療方案。研究發(fā)現(xiàn)，cp雖病因各異，但病理學(xué)改變相似，即持續(xù)進(jìn)展的慢性炎癥最終導(dǎo)致胰腺腺泡和胰島細(xì)胞出現(xiàn)不可逆性損害，并逐漸被纖維組織所取代，致使胰腺內(nèi)、外分泌功能顯著障礙。胰腺纖維化是cp的重要病理過程，可導(dǎo)致胰腺功能性組織喪失、胰管狹窄或擴(kuò)張、腺泡細(xì)胞萎縮、胰管結(jié)石以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等后果。抑制胰腺纖維化的發(fā)展可有效緩解cp癥狀并成為防止cp惡變的有效手段。但胰腺纖維化發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚無有效抑制胰腺纖維化的藥物。

中藥治療具有多層次、多靶點(diǎn)、毒副作用小等特點(diǎn)，對(duì)于防治慢性疾病有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。番石榴葉是一種抗氧化、抗痙攣、抗過敏、抗炎、抗糖尿病的中藥，提取物中主要成分為鞣質(zhì)、三萜、揮發(fā)油、多糖和酮類化合物等，其中黃酮類是主要的生物活性成分?，F(xiàn)有技術(shù)主要針對(duì)番石榴葉總黃酮的降糖作用，也有部分文獻(xiàn)報(bào)道了其抗腫瘤活性，但對(duì)于胰腺炎的防治作用尚未見相關(guān)文獻(xiàn)及專利。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明第一個(gè)目的在于公開了番石榴葉的新用途。

本發(fā)明第二個(gè)目的在于公開番石榴葉總黃酮的新用途。

番石榴葉總黃酮可以按照現(xiàn)有技術(shù)制備，本發(fā)明也同時(shí)提供了一種優(yōu)化的提取和檢測(cè)方法：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取時(shí)間、料液比、乙醇用量為自變量，金絲桃苷、槲皮素-3-o-β-d-吡喃阿拉伯糖苷、槲皮素-3-o-α-l-呋喃阿拉伯糖苷和浸出物得率的綜合評(píng)分為因變量，采用box-behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化番石榴葉總黃酮回流提取工藝并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。優(yōu)化的提取工藝穩(wěn)定可行、檢測(cè)方法穩(wěn)定、質(zhì)量可控。

經(jīng)藥理試驗(yàn)證明，番石榴葉總黃酮具有防治急慢性胰腺炎的作用。與正常組相比，雨蛙素注射后胰腺損傷加重(p＜0.001)，caspase-1、nlrp3、α-sma、il-1β、il-18水平升高(p＜0.01)。天狼星紅染色顯示胰腺組織細(xì)胞周圍膠原ⅰ(colⅰ)、膠原ⅲ(colⅲ)含量較正常組升高(p＜0.001)。與模型組相比，oxatp組及tfpgl低、高劑量組炎癥損傷及纖維化程度均減輕，表現(xiàn)為天狼星紅染色程度減輕(p＜0.05)，caspase-1、nlrp3、α-sma、il-1β、il-18水平均降低(p＜0.05)。

本發(fā)明番石榴葉總黃酮還可以按常規(guī)的制劑工藝制成藥劑學(xué)可接受的任意常規(guī)劑型，例如膠囊劑、片劑、顆粒劑、散劑、口服液、丸劑等制劑。為使上述劑型能夠?qū)崿F(xiàn)，需在制備這些劑型時(shí)加入藥學(xué)可接受的輔料，例如：填充劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、助懸劑、粘合劑、甜味劑、矯味劑、防腐劑、基質(zhì)等。填充劑包括：淀粉、預(yù)膠化淀粉、乳糖、甘露醇、甲殼素、微晶纖維素、蔗糖等；崩解劑包括：淀粉、預(yù)膠化淀粉、微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、低取代羥丙纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉等；潤(rùn)滑劑包括：硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉、滑石粉、二氧化硅等；助懸劑包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纖維素、蔗糖、瓊脂、羥丙基甲基纖維素等；粘合劑包括，淀粉漿、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素等；甜味劑包括：糖精鈉、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矯味劑包括：甜味劑及各種香精；防腐劑包括：尼泊金類、苯甲酸、苯甲酸鈉、山梨酸及其鹽類、苯扎溴銨、醋酸氯乙定、桉葉油等；基質(zhì)包括：peg6000，peg4000，蟲蠟等。

以下通過具體實(shí)施方式的描述對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但這并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。

附圖說明

圖1番石榴葉總黃酮提取物(a)和對(duì)照品(b)高效液相色譜圖

圖2番石榴葉總黃酮及oxatp治療前后胰腺損傷及纖維化組織學(xué)評(píng)價(jià)

圖3苦味酸天狼星紅染色評(píng)價(jià)胰腺纖維化(上圖為偏光鏡下視野，下圖為光鏡下視野)

圖4免疫組化檢測(cè)α-sma、nlrp3和caspase-1在胰腺組織中的表達(dá)(×200)

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1番石榴葉總黃酮的提取及含量測(cè)定

采用乙醇回流提取-減壓回收試劑-濃縮-過濾-石油醚處理-乙酸乙酯萃取等步驟提取。tfpgl含量測(cè)定以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定吸光值，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。紫外分光光度法測(cè)量被檢樣品500nm處吸光度(蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品在500nm處有強(qiáng)吸光值，設(shè)為測(cè)定波長(zhǎng))，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算得出總黃酮含量為19.8％。

實(shí)施例2番石榴葉總黃酮的急性毒性

1.實(shí)驗(yàn)方法：

試驗(yàn)設(shè)計(jì)給藥組及空白對(duì)照組，每組24只動(dòng)物，雌雄各半。給藥組給藥劑量為22.32g/kg，給藥容積40ml/kg灌胃給藥。對(duì)照組灌胃給予等體積飲用水。

每日觀察并記錄小鼠的外觀、精神狀態(tài)、呼吸、皮膚被毛、糞尿、眼、耳、鼻、口腔、生殖器等一般情況及其它中毒表現(xiàn)和死亡情況。每周測(cè)定小鼠體重、攝食量一次，連續(xù)觀察14天。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

一般狀況及死亡情況觀察：給藥后直至第14天，各動(dòng)物精神及行為活動(dòng)狀況良好、皮膚被毛清潔、大小便正常，體重增長(zhǎng)正常，攝食量未見異常，亦未見其他毒性反應(yīng)癥狀。觀察結(jié)束后大體解剖未見臟器明顯異常。

體重：雌、雄小鼠在各時(shí)間點(diǎn)體重與對(duì)照組雌、雄小鼠體重相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)，認(rèn)為番石榴葉總黃酮經(jīng)口灌胃給藥對(duì)小鼠體重?zé)o明顯影響。

實(shí)施例3多指標(biāo)效應(yīng)面法優(yōu)選番石榴葉總黃酮酶輔助提取工藝

1.色譜條件及方法：

色譜柱為安捷倫eclipsexdb-c18(4.6mm×250mm，5μm)；a(甲醇％)，b(0.2％磷酸水溶液％)；梯度洗脫，0～20.00min，37％a；20.01～35.00min，70％a；體積流量1ml/min；柱溫為35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：360nm。精密吸取供試品溶液10μl，測(cè)定供試品溶液中金絲桃苷、槲皮素-3-o-β-d-吡喃阿拉伯糖苷、槲皮素-3-o-α-l-呋喃阿拉伯糖苷峰面積，計(jì)算成分含量，結(jié)合這3個(gè)成分色譜峰面積占總峰面積的百分比例，折算出供試品溶液中番石榴葉總黃酮的含量。

總黃酮含量＝總黃酮含量(mg/g)＝3種黃酮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和/3種黃酮苷色譜峰面積百分比總和×100％

色譜圖見圖1。

2.單因素試驗(yàn)

酶用量的考察：取番石榴葉粉末1.0g，精密稱定，提取溫度為30℃，提取時(shí)間為30min，料液比為1:25(g/ml)，乙醇濃度為40％，酶用量分別為0，0.1％，0.2％，0.5％，1.0％，1.5％，2.0％條件下提取，測(cè)定總黃酮的含量，結(jié)果分別為4.17mg/g，4.39mg/g，4.86mg/g，5.24mg/g，8.48mg/g，6.48mg/g，5.92mg/g。結(jié)果可知，總黃酮含量隨酶用量的增加先升高后降低，當(dāng)酶用量為1.0％時(shí)總黃酮的含量最高。因此，選擇酶的最佳用量為1.0％。

提取溫度的考察：取番石榴葉粉末1.0g，精密稱定，酶用量為0.5％，提取時(shí)間為30min，料液比為1:25(g/ml)，乙醇濃度為40％，分別在20，30，40，50，60，70℃的條件下進(jìn)行提取，測(cè)定總黃酮的含量。結(jié)果分別為5.04mg/g，5.24mg/g，6.07mg/g，6.04mg/g，5.13mg/g，3.56mg/g。結(jié)果顯示，隨著提取溫度的升高，總黃酮含量升高明顯，在提取溫度為40℃時(shí)，總黃酮的含量達(dá)到了最大，提取溫度繼續(xù)升高，總黃酮的含量變化趨于平緩。因而選擇提取溫度為40℃。

提取時(shí)間的考察：取番石榴葉粉末1.0g，精密稱定，酶用量為0.5％，提取溫度為30℃，料液比為1:25(g/ml)，乙醇濃度為40％，分別在15，30，45，60，75min時(shí)間內(nèi)進(jìn)行提取，測(cè)定總黃酮的含量。結(jié)果分別為4.60mg/g，5.24mg/g，4.33mg/g，4.19mg/g，4.85mg/g。結(jié)果可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，總黃酮含量升高，在30min時(shí)達(dá)到最高，之后總黃酮的含量有所降低，可能是由于超聲時(shí)間過長(zhǎng)對(duì)酶的活性有所影響。故確定提取時(shí)間為30min。

乙醇體積分?jǐn)?shù)的考察：取番石榴葉粉末1.0g，精密稱定，酶用量為0.5％，酶解溫度為30℃，提取時(shí)間為30min，料液比為1:25(g/ml)，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為30％，40％，50％，60％，70％條件下進(jìn)行提取，測(cè)定總黃酮的含量。結(jié)果分別為5.48mg/g，5.24mg/g，8.47mg/g，6.27mg/g，4.83mg/g。隨著乙醇濃度的提高，總黃酮含量先升高，在乙醇體積分?jǐn)?shù)50％時(shí)總黃酮的含量最高，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的繼續(xù)升高色譜峰的峰形變差且峰面積降低。因此，選擇提取乙醇體積分?jǐn)?shù)為50％。

3.效應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)：

試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果測(cè)定：以單因素試驗(yàn)的結(jié)果為基礎(chǔ)，根據(jù)box-behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取影響較大的因素，提取時(shí)間(a/min)、酶用量(b/％)以及乙醇體積分?jǐn)?shù)(c/％)為自變量。因素與水平見表2，提取工藝參數(shù)考察試驗(yàn)安排及結(jié)果見表3。

模型擬合與效應(yīng)面分析：以金絲桃苷量(y1)、槲皮素-3-o-β-d-吡喃阿拉伯糖苷量(y2)、槲皮素-3-o-α-l-呋喃阿拉伯糖苷量(y3)，進(jìn)行加權(quán)綜合評(píng)分(od)，計(jì)算od值，od＝(1/3y1/y1max+1/3y3/y3max+1/3y2/y2max)×100，其中y1max、y2max、y3max為相應(yīng)成分量的最大值。

以綜合評(píng)分od值為響應(yīng)值，采用design-expert.v7.0.0軟件對(duì)果進(jìn)行回歸分析。結(jié)合操作的可行性，最優(yōu)工藝定為提取時(shí)間34min，酶用量0.93％，乙醇體積分?jǐn)?shù)52％。

實(shí)施例4番石榴葉總黃酮對(duì)急性胰腺炎的炎癥反應(yīng)

1.方法

首先建立雨蛙素致急性胰腺炎小鼠模型，觀察番石榴葉總黃酮對(duì)模型的治療作用，是否能改善急性胰腺炎模型動(dòng)物的胰腺炎癥反應(yīng)，降低酶活性。動(dòng)物：c57bl/6小鼠，體重大約20±2g；隨機(jī)分成三個(gè)實(shí)驗(yàn)組別：空白對(duì)照組，急性胰腺炎模型組及番石榴葉總黃酮組，每組10只(n＝10)。急性胰腺炎模型采用腹腔注射雨蛙素的方式誘導(dǎo)，雨蛙素溶于0.9％生理鹽水中，濃度為5μg/ml。向急性胰腺炎組及番石榴葉總黃酮組每小時(shí)注射一針雨蛙素，連續(xù)注射6針，每針50μg/kg體重?？瞻讓?duì)照組注射等劑量的生理鹽水。造模前三天開始番石榴葉總黃酮。最后一針雨蛙素注射完成后一小時(shí)，將所有小鼠摘眼球取血，解剖后快速收取腸道、胰腺等樣品，迅速保存到液氮中，后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱。

1.1血清淀粉酶測(cè)定

采取小鼠全血后室溫放置30min使血液凝結(jié)，隨后4℃下3000g離心10min，吸取上清并于-80℃存放。采用碘-淀粉顯色法測(cè)定血清淀粉酶水平：血清樣品與預(yù)熱的底物反應(yīng)液在37℃孵育7.5min向混合物中加入碘液和雙蒸水，使用分光光度計(jì)測(cè)量吸光度。計(jì)算血清淀粉酶活性(udl)。

1.2血清脂肪酶的測(cè)定

采用elisa法測(cè)定小鼠血清中的脂肪酶水平，與對(duì)照組相比，模型組血清脂肪酶水平顯著上升，而造模前喂飼了番石榴葉總黃酮的樣品組與模型組相比則有顯著下降，與對(duì)照組接近。

1.3胰腺組織水腫程度測(cè)定

胰腺的水腫程度通過新鮮胰腺樣本重量(濕重)跟干燥后胰腺樣本重量(干重)的比值進(jìn)行衡量。剛?cè)〕龅男迈r的胰腺組織剪取一部分，剔除脂肪，濾紙吸拭胰腺組織表面水分，分析天平稱量濕重。將胰腺組織置80℃烘箱中烘烤脫水，48h后分析天平稱量干重。計(jì)算胰腺組織濕干重比值：

胰腺組織濕干重比率＝胰腺濕重-胰腺干重胰腺濕重×100％

1.4胰腺組織髓過氧化物酶活性測(cè)定

過氧化物酶(myeloperoxidase，mpo)是中性粒細(xì)胞的激活標(biāo)志及功能標(biāo)志，在免疫學(xué)上常用mpo來表征中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。mpo在每個(gè)中性粒細(xì)胞中的量為定值，約占細(xì)胞干重的5％，該酶具有還原性，利用這一特性測(cè)定mpo酶的活性。供氫體復(fù)合物經(jīng)mpo酶還原后產(chǎn)生黃色化合物，于460nm波長(zhǎng)處通過比色測(cè)定吸光度，計(jì)算出此產(chǎn)物的產(chǎn)量，從而推算出mpo的活力。

2.結(jié)果

番石榴葉總黃酮對(duì)急性胰腺炎的炎癥反應(yīng)的結(jié)果見表1。

表1番石榴葉總黃酮對(duì)急性胰腺炎的炎癥反應(yīng)

注：與正常對(duì)照組比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；與模型組相比，#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001。

實(shí)施例5番石榴葉總黃酮對(duì)慢性胰腺炎小鼠纖維化的影響

造模：將50只c57bl/6小鼠隨機(jī)均分為正常組、模型組、oxatp組(15μg·kg-1·d-1)、tfpgl低劑量組(0.186g·kg-1·d-1)、tfpgl高劑量組(0.372·kg-1·d-1)。后四組小鼠均采用反復(fù)腹腔注射雨蛙素的方法制備慢性胰腺炎小鼠模型，單次注射劑量為50μg·kg-1，溶于200μl的生理鹽水，1次/h，6次/d，每周一、三、五注射，連續(xù)注射6周。

給藥劑量：在最后一次注射雨蛙素后，oxatp組、tfpgl低、高劑量組小鼠分別予以2周oxatp(15μg·kg-1·d-1，溶于200μl的生理鹽水)腹腔注射及tfpgl(0.186、0.372g·kg-1·d-1)灌胃。對(duì)照組動(dòng)物在8周研究期間注射等量的生理鹽水，注射時(shí)間及次數(shù)同模型組。最后一次注射完成24h后，將所有小鼠脫頸處死，剪取部分胰腺組織置于福爾馬林用于蘇木精-伊紅染色、天狼星紅苦味酸染色及免疫組化實(shí)驗(yàn)，另一部分新鮮組織用于酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)。

1.小鼠胰腺組織蘇木精-伊紅(he)染色及胰腺慢性炎癥纖維化評(píng)估：

福爾馬林溶液固定組織24h后，將組織脫水、包埋、切片后按he染色常規(guī)操作進(jìn)行脫蠟、染色、脫水、封片。晾片24h后，顯微鏡觀察胰腺組織的病理結(jié)構(gòu)變化。

與正常組相比，模型組小鼠胰腺可見明顯的慢性炎癥及纖維化(p＜0.001)，表現(xiàn)為腺體萎縮、組織纖維化、管狀復(fù)合結(jié)構(gòu)增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；而oxatp組、tfpgl低、高劑量組細(xì)胞浸潤(rùn)、腺泡萎縮及纖維化程度評(píng)分較模型組均明顯降低(均p＜0.05)。見圖2，表2。

表2各組胰腺組織炎癥損傷組織學(xué)評(píng)分(n＝10)

注：與對(duì)照組比較，1)p<0.001；與模型組比較，2)p<0.05。

2.胰腺膠原含量檢查及定量分析：

石蠟切片采用苦味酸天狼星紅染色評(píng)估胰腺組織膠原含量。切片脫蠟處理后，0.1％(w/v)天狼星紅-飽和苦味酸溶液在室溫下滴染1h，流水沖洗后蘇木精復(fù)染10min。1％鹽酸分化30s，自來水堿化后脫水透明，中性樹脂封片。對(duì)胰腺組織膠原類型及其表達(dá)程度用偏振光顯微鏡進(jìn)行分析，用image-proplus6圖像分析軟件量化colⅰ和colⅲ的含量(以視野中黃紅色及綠色膠原面積表示)和膠原容積分?jǐn)?shù)(collagenvolumefractions，cvfs)，cvfs＝(綠色膠原面積+黃紅色膠原面積)/總面積(指照片視野面積)×100％。

苦味酸天狼星紅染色在偏光顯微鏡下能特異地顯示膠原組織。在偏光鏡下，膠原ⅰ(colⅰ)呈黃或紅色，膠原ⅲ(colⅲ)呈藍(lán)綠或灰藍(lán)色。在光鏡下，可見模型組、oxatp組、tfpgl低劑量組、tfpgl高劑量組膠原特異性著色為紅色，腺泡及胰島萎縮，代之以膠原纖維。在偏光鏡下可見，與正常組相比，雨蛙素注射后形成的慢性胰腺炎纖維化以colⅰ為主，且膠原含量明顯增加(p＜0.001)；與模型組相比，tfpgl低、高劑量組colⅰ、colⅲ型膠原蛋白減少(p＜0.05)，其中tfpgl高劑量組colⅰ明顯減少(p＜0.01)。見表3、圖3。

表2各組胰腺組織膠原含量及cvfs的變化(n＝10)

注：與對(duì)照組比較，1)p<0.001；與模型組比較，2)p<0.05，3)p<0.01。

3.石蠟切片caspase-1，nlrp3，α-sma免疫組化染色

將胰腺組織石蠟切片60℃烘片30分鐘后室溫復(fù)溫30分鐘。將石蠟切片置于新鮮二甲苯脫蠟及乙醇梯度脫水后，3％h2o2室溫孵育10min。tbst漂洗5min×3次后，將切片置于edta溶液微波熱修復(fù)10min。羊血清封閉1小時(shí)，caspase-1、nlrp3或α-sma(均用羊血清工作液稀釋至1:200)孵育4℃過夜。tbst漂洗5min×3次，生物素標(biāo)記羊抗兔igg常溫孵育1h，dab顯色10min，tbst多次洗滌，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片，鏡下觀察基因表達(dá)。

與正常組相比，模型組胰腺組織中α-sma、nlrp3、caspase-1表達(dá)顯著升高(p＜0.01)；而oxatp、tfpgl作用于小鼠后，胰腺組織中α-sma、nlrp3和caspase-1表達(dá)均較模型組降低(p＜0.05)，其中tfpgl高劑量組胰腺組織中α-sma、nlrp3和caspase-1表達(dá)較模型組明顯降低(p＜0.01)。見表4、圖4。

表4各組α-sma、nlrp3和caspase-1光密度值定量分析(n＝10)

注：與對(duì)照組比較，1)p<0.01；與模型組比較，2)p<0.05，3)p＜0.01

4.酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)il-1β及il-18水平

新鮮胰腺組織用預(yù)冷pbs洗去血跡后，稱取50mg，移入2ml離心管，加入500μl預(yù)冷ptr緩沖液。利用超聲波細(xì)胞破碎儀勻漿10s，該過程在冰上進(jìn)行。將組織勻漿液在冰上孵育20分鐘后，4℃離心18000g20min，吸取上清液至新2ml離心管中。用bca法檢測(cè)蛋白濃度。測(cè)得樣品蛋白濃度為13μg·μl-1～16μg·μl-1，使用ptr緩沖液配平蛋白至相同濃度10μg·μl-1。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)試劑盒說明書方法測(cè)定il-1β及il-18水平，結(jié)果見表5.

與正常組相比，模型組小鼠胰腺組織中il-1β及il-18蛋白濃度均顯著升高(p＜0.01)。與模型組相比，oxatp、tfpgl治療后，小鼠胰腺組織中il-β及il-18蛋白濃度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(p＜0.05)。

表5胰腺組織中il-1β及il-18蛋白濃度的測(cè)定

注：與對(duì)照組比較，1)p<0.01；與模型組比較，2)p<0.05

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)所示數(shù)據(jù)至少有三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，組織切片每組10只動(dòng)物均需制作一張切片。使用spss22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)±代表標(biāo)準(zhǔn)差的值。計(jì)量資料均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間數(shù)據(jù)比較采用lsd-t法，兩組組間比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

經(jīng)過持續(xù)六周雨蛙素注射后，he染色、天狼星紅染色及α-sma免疫組化染色結(jié)果均顯示小鼠胰腺組織表現(xiàn)出明顯的胰腺纖維化及腺泡萎縮、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等炎癥表現(xiàn)。模型組colⅰ、colⅲ型膠原蛋白明顯增多，且以colⅰ型膠原蛋白為主。nlrp3和caspase-1的蛋白表達(dá)水平明顯升高，且與小鼠纖維化程度與nlrp3炎癥體信號(hào)通路中的nlrp3、caspase-1蛋白表達(dá)趨勢(shì)一致。模型組α-sma免疫組化顯示，染色部位多位于腺泡細(xì)胞周圍及近導(dǎo)管、血管區(qū)域，這與胰腺星狀細(xì)胞(pancreaticstellatecells，pscs)在胰腺組織中的分布相符。p2x7r拮抗劑及番石榴葉總黃酮治療后，與模型組相比，he染色、苦味酸天狼星紅染色及α-sma免疫組化染色均顯示小鼠胰腺纖維化程度受到了一定的抑制，且nlrp3、caspase-1、il-1β、il-18蛋白表達(dá)減少，提示番石榴葉總黃酮可能通過抑制nlrp3炎性體的活性，間接減少il-1β、il-18、il-33等促炎因子的修飾與活化，從而減少pscs激活。nlrp3炎癥體也可促進(jìn)tgfβⅰ及tgfβⅲ的表達(dá)，與tgfβ-smad信號(hào)通路之間互有影響，預(yù)示番石榴葉總黃酮可能抑制nlrp3炎癥體激活間接抑制了tgfβ1表達(dá)，從而減少細(xì)胞外基質(zhì)的生成。

綜上所述，慢性胰腺炎過程中p2x7-nlrp3信號(hào)通路激活，促炎因子il-1β、il-18活化成熟并激活pscs，這與胰腺纖維化的進(jìn)展密切相關(guān)。番石榴葉總黃酮可抑制nlrp3炎癥體的激活，并顯著改善雨蛙素誘導(dǎo)的慢性胰腺炎纖維化。

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