本發(fā)明涉及一種α-低聚半乳糖提取物及其提取方法和護膚應用，特別是從綠豆中提取的α-低聚半乳糖提取物及其提取方法和護膚應用。
背景技術：
：α-低聚半乳糖(α-Galactooligosaccharides，α-GOS)是一類含有α-半乳糖苷鍵的低分子量可溶性低聚糖，廣泛分布于豆科植物中，尤其多見于種子、根、芽等組織內(nèi)，具有重要的生理保護功能。有研究表明α-低聚半乳糖是雙歧桿菌的有效增殖因子，具有抑制病原菌、防止便秘、腹瀉、保護肝功能、降低血清膽固醇、降低血壓、降低血脂、增強免疫功能、促進營養(yǎng)和鈣離子的吸收、預防和治療乳糖消化不良、改善脂肪代謝、防癌抗癌等功能。目前，α-低聚半乳糖的來源大致分為四種：①從天然原料提??；②天然多糖酸水解；③化學合成；④酶法合成。每一種方法都有其優(yōu)點及缺點，例如，從天然原料中提取，主要是從豆科植物的種子中提取，現(xiàn)階段國內(nèi)外報道的有關提取原料主要有大豆、羽扇豆、紅豆，豌豆等，獲得的產(chǎn)物種類較多，難以分離純化，同時制備純化方法通常都會涉及醇沉純化的步驟，清除和回收溶劑困難；天然多糖水解轉(zhuǎn)化產(chǎn)品得率低，產(chǎn)物復雜，不易獲得純品；化學合成法使用大量化學試劑，毒性大，易殘留，生產(chǎn)成本高，并且需要繁瑣的羥基保護和去保護步驟，在實際生產(chǎn)中不可行；酶法合成主要以半乳糖為底物，通過半乳糖苷酶催化合成，由于逆反應即水解反應的存在，反應產(chǎn)物的產(chǎn)量往往不高，同時反應產(chǎn)物中含有多種聚合度的糖，而且同一聚合度的糖存在多種異構體，對應用存在很大的干擾。綠豆屬豆科蝶形花亞科菜豆族豇豆屬，又名青豆、交豆、青小豆。原產(chǎn)于亞洲東南部，中國也是起源中心，在溫帶、亞熱帶地區(qū)廣泛種植。在我國綠豆已有千余年的栽培史，其產(chǎn)量和出口量均居世界首位。綠豆具有藥食兩用功能。富含淀粉、蛋白質(zhì)、膳食纖維、維生素E、β-胡蘿卜素、鈣、鐵、鉀、鋅、鎂、硒等營養(yǎng)素和功能性低聚糖、黃酮類化合物等功能成分，有較高的營養(yǎng)與保健價值，有“濟世糧谷”、“食中要物”的美譽。本草綱目記載：綠豆有補氣元神，安精神，調(diào)和五臟，行十二經(jīng)脈，潤皮膚，去浮風，利腫脹，止消渴，解一切牛馬、草藥、金石諸毒等功效。綠豆具有多種保健功能，清熱解毒、潤腸通便、降血糖、降血壓、降血脂、抗腫瘤、抗過敏、提高免疫力、解暑去煩、清膽?zhàn)B胃、明目、排鉛、保護肝臟和心血管等功效。傳統(tǒng)綠豆的利用仍較為粗放，以食用為主。綠豆源低聚糖，目前已有較多文獻涉及提取或應用，但主要是水溶性低聚糖如甘露糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖等，且產(chǎn)物通常是粗多糖，純度較低。綠豆來源的α-低聚半乳糖，研究較少，主要集中在毛蕊花糖。公開的文獻大多采用在高溫下水提結合醇沉，不過由于植物多糖的生物活性作用一般與其結構有重要關系，高溫會對多糖的功能活性造成一定的影響。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種綠豆中α-低聚半乳糖提取物的提取方法，該方法克服了現(xiàn)有技術的不足，具有提取效率高、產(chǎn)品純度高等優(yōu)點。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明涉及一種從綠豆中提取α-低聚半乳糖提取物的方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)對綠豆進行除雜、粉碎、用脫脂劑脫脂，去除脫脂劑得脫脂綠豆粉；(2)將脫脂綠豆粉分散于萃取液中萃取α-低聚半乳糖，得萃取混合物；(3)將萃取混合物進行固液分離，取液體部分靜置，收集含有α-低聚半乳糖的下相液體；和(4)從含有α-低聚半乳糖的下相液體中純化得到α-低聚半乳糖提取物；其中，所述萃取液含有離子液體、無機鹽、表面活性劑和水。優(yōu)選地，綠豆為明綠豆，更優(yōu)選地，明綠豆為非轉(zhuǎn)基因明綠豆。本領域技術人員可以理解，步驟(1)中，粉碎可采用本領域已知的各種粉碎方法，包括但不限于機械粉碎、氣流粉碎、球磨等。優(yōu)選地，粉碎后的綠豆粉粒徑為10～80μm，更優(yōu)選地，粒徑為30～50μm。優(yōu)選地，步驟(1)中，在用脫脂劑脫脂之前對粉碎后的綠豆粉進行干燥。本領域技術人員可以理解，干燥可采用本領域已知的各種干燥方法，包括但不限于曬干、烘干、鼓風干燥、真空干燥等。優(yōu)選地，干燥后的綠豆粉含水量≤0.5％(以重量百分比計)，更優(yōu)選地，含水量≤0.3％。本領域技術人員可以理解，步驟(1)中，脫脂劑可采用本領域常用的各種有機溶劑，包括但不限于，鹵代烴類、芳香烴類、醇類、醚類、酮類、酯類等或其任意混合物，例如：二氯甲烷、甲苯、甲醇、乙醇、丙醇、丙二醇、乙醚、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺等或其任意混合物。優(yōu)選地，脫脂劑是無毒或無害的，例如：乙醇、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺或其任意混合物。例如，在本發(fā)明的一個實施方式中，脫脂劑為石油醚和乙酸乙酯的混合物，優(yōu)選地，石油醚沸程為60～90℃，更優(yōu)選地，該混合物中石油醚和乙酸乙酯的質(zhì)量比為(0.5～2):1，最優(yōu)選地，該混合物中石油醚和乙酸乙酯的質(zhì)量比為1:1。本領域技術人員可根據(jù)脫脂劑的種類調(diào)整脫脂劑的用量。例如，在本發(fā)明的一個實施方式中，脫脂劑的質(zhì)量為綠豆粉質(zhì)量的2～8倍，優(yōu)選地，脫脂劑的質(zhì)量為綠豆粉質(zhì)量的4～6倍。本領域技術人員可根據(jù)脫脂劑的種類、用量調(diào)整脫脂的溫度和時間。例如，在本發(fā)明的一個實施方式中，溫度為4～35℃，優(yōu)選地，溫度為20～30℃；時間為1～8h，優(yōu)選地，時間為2～4h。優(yōu)選地，步驟(1)中，脫脂在振蕩器中進行，頻率為50～300次/min，更優(yōu)選為100～200次/min。本領域技術人員可以理解，步驟(1)中，脫脂后可采用本領域已知的各種分離方法去除脫脂劑，包括但不限于離心、過濾、蒸餾等。根據(jù)本發(fā)明，步驟(1)中，去除脫脂劑后，所得脫脂綠豆粉可直接用于后續(xù)步驟，或者于0～8℃，優(yōu)選4～5℃儲存，然后再用于后續(xù)步驟。優(yōu)選在儲存前用本領域已知的各種干燥方法干燥，所述干燥方法包括但不限于鼓風干燥、冷凍干燥、真空干燥、噴霧干燥等。例如，在本發(fā)明的一個實施方式中，采用冷凍干燥，優(yōu)選在-1.5～-0.5MPa下干燥1～3h。優(yōu)選地，步驟(2)中，脫脂綠豆粉與萃取液的質(zhì)量比為1:(2～10)，更優(yōu)選為1:(5～8)；萃取溫度為4～35℃，更優(yōu)選為15～20℃；萃取時間為10-60min，更優(yōu)選為30～45min；萃取在振蕩器中進行，頻率為50～300次/min，更優(yōu)選為100～200次/min。優(yōu)選地，所述萃取液由離子液體、無機鹽、表面活性劑和水組成。優(yōu)選地，所述萃取液中離子液體、無機鹽、表面活性劑和水的質(zhì)量比為1:(0.2～0.4):(0.05～0.1):(6～8)。優(yōu)選地，離子液體為[Bmim]X，其中，X為Br-、I-、NO3-、HSO4-、[CH3COO]-、[BF3]-、[BF6]-中的至少一種，Bmim為1-丁基-3-甲基咪唑陽離子。在本發(fā)明中，離子液體可市售獲得，或通過本領域已知的方法合成。優(yōu)選地，無機鹽為磷酸鈉、焦磷酸鈉、六偏磷酸鈉、三聚磷酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀或其任意混合物；優(yōu)選地，表面活性劑為季銨鹽型陽離子表面活性劑，例如：PEG-2油酸脂基甲基氯化銨、椰油基三甲基氯化銨、十六烷基三甲基氯化銨、十六烷基三甲基溴化銨、硬脂基三甲基氯化銨、山?；谆然@、雙硬脂基二甲基氯化銨、聚季銨鹽-2、聚季銨鹽-22、聚季銨鹽-39、聚季銨鹽-47或其任意混合物；或者是含有EO、PO或EO/PO共聚結構的非離子表面活性劑，例如：C11-15鏈烷醇聚醚-7、C11-15鏈烷醇聚醚-9、C11-15仲鏈烷醇聚醚-12、C12-13鏈烷醇聚醚-3、C12-13鏈烷醇聚醚-6、C12-13鏈烷醇聚醚-9、PPG-1十三醇聚醚-6、PPG-10甘油醚、PPG-10鯨蠟基醚、PEG/PPG-10/30共聚物、PEG/PPG-17/6共聚物、PEG/PPG-18/4共聚物或其任意混合物；更優(yōu)選為季銨鹽型陽離子表面活性劑。本領域技術人員可以理解，步驟(3)中，固液分離可采用本領域已知的各種固液分離方法，包括但不限于離心、過濾等。優(yōu)選地，步驟(3)中，靜置溫度為0-35℃，更優(yōu)選為0～5℃；本領域技術人員可以理解，靜置直至上下兩相界面穩(wěn)定，在本發(fā)明的一個實施方式中，靜置時間為1～8h，優(yōu)選為2～4h。上相液體中含有離子液體，為了降低成本，可以通過例如溶劑萃取、減壓蒸餾等方法分離、提純離子液體，重復利用。優(yōu)選地，在步驟(4)中，在步驟(3)中得到的含有α-低聚半乳糖的下相液體中加入乙醇，振蕩，固液分離，收集沉淀物并用洗滌液洗滌，然后將沉淀物溶于水中，用大孔吸附樹脂進行柱層析，收集水蘇糖、毛蕊花糖、棉籽糖流出液，干燥后得到α-低聚半乳糖提取物。優(yōu)選地，在步驟(4)中，乙醇為無水乙醇；乙醇加入量為下相液體質(zhì)量的2～8，更優(yōu)選為4～6倍。優(yōu)選地，在步驟(4)中，振蕩時間為2～20min，更優(yōu)選為5～15min；振蕩溫度為0-35℃，更優(yōu)選為0～5℃；振蕩在振蕩器中進行，頻率為50～300次/min，更優(yōu)選為100～200次/min。本領域技術人員可以理解，在步驟(4)中，固液分離可采用本領域已知的各種固液分離方法，包括但不限于離心、過濾等。優(yōu)選地，在步驟(4)中，洗滌液為甲醇、乙醇、丙酮、四氫呋喃或其任意混合物；洗滌次數(shù)為1～5次，更優(yōu)選為2～3次。優(yōu)選地，水量為沉淀物質(zhì)量的2～10倍，更優(yōu)選為5～8倍。本領域技術人員可以理解，大孔吸附樹脂可以使用本領域常用的各種大孔吸附樹脂，包括但不限于非極性的D101、LX-20、LX-60，弱極性的AB-8、LX-21、XDA-6、極性的LX-17/LX-38，優(yōu)選弱極性的AB-8大孔吸附樹脂。洗脫液可以是乙醇-水體系、甲醇-水體系、乙腈-水體系，優(yōu)選乙醇-水體系，更優(yōu)選乙醇濃度0～45％梯度洗脫。本領域技術人員可以理解，可以通過HPLC跟蹤監(jiān)測確定何時對水蘇糖、毛蕊花糖、棉籽糖流出液進行收集。本領域技術人員可以理解，干燥可采用本領域已知的各種干燥方法，包括但不限于鼓風干燥、噴霧干燥、真空干燥、冷凍干燥等。例如，在本發(fā)明的一個實施方式中，采用冷凍干燥，優(yōu)選在-1.5～-0.5MPa下干燥4～8h。在本發(fā)明中，步驟(IV)中固液分離洗滌后的沉淀物，即在柱層析精制之前，α-低聚半乳糖的含量一般約為62～70％，其中除水蘇糖、毛蕊花糖、棉籽糖外，還含有葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖。柱層析時，葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖會被先洗脫出來，從而達到精制的目的。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明涉及通過如上提取方法提取得到的綠豆α-低聚半乳糖提取物。根據(jù)本發(fā)明的提取方法制備得到的綠豆α-低聚半乳糖提取物具有較強的抗氧化能力，能夠清除羥基自由基和DPPH自由基，從而具有抗氧化、抗過敏、降低刺激性、抗衰老、祛皺、保濕、增強皮膚彈性等活性，可以用在化妝品中。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明涉及一種組合物，含有本發(fā)明的提取方法制備得到的綠豆α-低聚半乳糖提取物。優(yōu)選，所述組合物為化妝品組合物。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的提取方法制備得到的綠豆α-低聚半乳糖提取物在制備化妝品中的應用。在本發(fā)明中，化妝品包括但不限于香皂、洗面奶、卸妝液、爽膚水、乳液、精華液、精華霜、精華油、潤膚油、按摩油、面霜、眼霜、面膜、浴液等。含有本發(fā)明提取方法制備得到的綠豆α-低聚半乳糖提取物的化妝品能夠抗氧化、抗過敏、降低刺激性、抗衰老、祛皺、保濕、增強皮膚彈性。本發(fā)明采用改進的離子液體雙水相體系，在體系中加入了表面活性劑，提高了α-低聚半乳糖的萃取得率。通過本發(fā)明的提取方法獲得的提取物中α-低聚半乳糖純度高，主要組分是水蘇糖、毛蕊花糖、棉籽糖，以Sugar-D色譜柱和RID檢測器分析，總α-低聚半乳糖的純度≥99.0％，其余基本上是含量≤1.0％的蛋白質(zhì)(其含量通過Folin-酚法測定)，該蛋白質(zhì)以Sevag除蛋白法并不能脫除，說明該蛋白質(zhì)是以與α-低聚半乳糖結合形式存在的糖蛋白。本發(fā)明提取方法的整個工藝在常溫或常溫以下進行，保持了α-低聚半乳糖和糖蛋白的天然構象，從而最大程度的保留了α-低聚半乳糖和糖蛋白的生物活性。綜上，本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術取得了如下的優(yōu)點及有益效果：(1)采用離子液體、無機鹽、表面活性劑和水構成的新型萃取分離體系，結合了離子液體和雙水相萃取的優(yōu)點。與傳統(tǒng)的水提醇沉、雙水相萃取等方法相比，萃取效率高，條件溫和；(2)表面活性劑的加入降低了α-低聚半乳糖與綠豆細胞組織的結合力，加速α-低聚半乳糖從固相進入溶劑的過程，具有省時、節(jié)能、提取效率高等優(yōu)點；(3)提取得到的提取物中α-低聚半乳糖純度達到99.0％，雜多糖等雜質(zhì)含量低，主要成分是水蘇糖、毛蕊花糖及棉籽糖以及少量的糖蛋白；(4)提取工藝在常溫或常溫以下進行，無高溫對α-低聚半乳糖或糖蛋白構象的破壞，保持了綠豆α-低聚半乳糖提取物的高生物活性；(5)本發(fā)明提取得到的綠豆α-低聚半乳糖提取物具有良好的抗氧化能力，優(yōu)于水蘇糖、毛蕊花糖和棉子糖，能夠抗衰老、祛皺、保濕、增強皮膚彈性，且能夠降低表面活性劑等的刺激性，并具有較好的舒敏作用，特別適用于制備化妝品。附圖說明圖1為綠豆α-低聚半乳糖提取物降低SDS刺激能力測試。具體實施方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外，應理解，在閱讀了本發(fā)明所記載的內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本發(fā)明所限定的范圍。以下實施例中所用試劑，如無特殊說明，均為可商購獲得的常規(guī)常用試劑。以下實施例中所用的實驗方法，如無特殊說明，均為本領域常規(guī)的操作方法。干燥植物的水含量測定方法參照《GB5009.3-2010食品中水分的測定第一法直接干燥法》總糖含量的測定采用苯酚-硫酸比色法測定(張青,張?zhí)烀?苯酚-硫酸比色法測定多糖含量[J].中國藥學會全國生化新藥研究與臨床應用學術會議,2004:56-56.)蛋白質(zhì)的含量采用Folin-酚試劑法測定。釆用高效液相色譜外標法測定樣品中的低聚糖含量：(1)糖標準曲線的制備。準確稱取果糖、蔗糖、棉籽糖、水蘇糖、毛蕊花糖的標準樣品，用水溶解后，加入等量的乙腈，配制成一系列不同濃度梯度的標準溶液，經(jīng)0.45μm針頭式有機系濾膜過濾后，按濃度從低到高的順序進行檢測，得到各個糖的保留時間，并記錄各個濃度對應的峰面積，以峰面積對濃度作圖，得到各個糖的標準曲線。(2)對提取的綠豆低聚糖及進行分析，通過糖的標準曲線計算糖的含量，并得到純化后的純度。(3)色譜條件。色譜柱：Sugar-D；檢測器：RID；柱溫：40℃；流動相：乙腈：水＝75:25(V/V)；流速：1.0mL/min；進樣量：20μL。實施例1(I)綠豆的前處理將100質(zhì)量份市售明綠豆剔除雜質(zhì)、雜豆、缺陷豆，球磨至粒徑為30μm，烘干至含水量0.2％，加入由200質(zhì)量份石油醚(沸程60～90℃)和200質(zhì)量份乙酸乙酯，以振蕩的方式進行脫脂，振蕩頻率100次/min，脫脂溫度為20℃，時間為2h。脫脂完畢后，離心，將濾餅在-1.5MPa下冷凍干燥1h，得到約96質(zhì)量份的脫脂綠豆粉，保存于5℃冰箱中。(II)綠豆α-低聚半乳糖的萃取1質(zhì)量份的離子液體[Bmim]BF3中，加入0.2質(zhì)量份的磷酸二氫鉀、0.05質(zhì)量份的十六烷基三甲基溴化銨、6質(zhì)量份的去離子水，攪拌溶解，得到萃取液；將100質(zhì)量份的脫脂綠豆粉分散于500質(zhì)量份的萃取液中，以頻率為100次/min的振蕩器，在15℃恒溫條件下，振蕩30min。(III)綠豆α-低聚半乳糖的分離將步驟(II)得到混合萃取體系，離心，液體部分在0℃條件下靜置2h，分離上下相，收集得到約400質(zhì)量份的下相液體。(IV)綠豆α-低聚半乳糖的純化將步驟(III)得到的下相液體，加入1600質(zhì)量份的無水乙醇，以頻率為100次/min的振蕩器在0℃振蕩5min，離心固液分離，收集沉淀物并用四氫呋喃洗滌2次，得到約4質(zhì)量份的沉淀物。最后沉淀物溶于20質(zhì)量份的水中，加入到預處理后的大孔吸附樹脂AB-8層析柱，洗脫液為0～45％的乙醇溶液，進行梯度洗脫，HPLC跟蹤監(jiān)測下收集水蘇糖、毛蕊花糖、棉籽糖流出液，在-1.5MPa下冷凍干燥4h，得到約2.78質(zhì)量份粉末狀綠豆α-低聚半乳糖提取物，折合成未脫脂的明綠豆，其得率為：2.67％。以高效液相色譜外標法檢測綠豆α-低聚半乳糖提取物的組成如下：表1綠豆α-低聚半乳糖提取物的組成水蘇糖毛蕊花糖棉籽糖α-低聚半乳糖含量蛋白質(zhì)含量32.42％51.12％16.04％99.58％0.42％實施例2(I)綠豆的前處理將100質(zhì)量份市售明綠豆剔除雜質(zhì)、雜豆、缺陷豆，球磨至粒徑為35μm，烘干至含水量0.15％，加入由200質(zhì)量份石油醚(沸程60～90℃)和200質(zhì)量份乙酸乙酯，以振蕩的方式進行脫脂，振蕩頻率150次/min，脫脂溫度為25℃，時間為3h。脫脂完畢后，離心，將濾餅在-1.0MPa下冷凍干燥2h，得到約96質(zhì)量份的脫脂綠豆粉，保存于5℃冰箱中。(II)綠豆α-低聚半乳糖的萃取1質(zhì)量份的離子液體[Bmim]BF3中，加入0.3質(zhì)量份的磷酸二氫鉀、0.06質(zhì)量份的硬脂基三甲基氯化銨、7質(zhì)量份的去離子水，攪拌溶解，得到萃取液；將100質(zhì)量份的脫脂綠豆粉分散于500質(zhì)量份的萃取液中，以頻率為150次/min的振蕩器，在16℃恒溫條件下，振蕩35min。(III)綠豆α-低聚半乳糖的分離將步驟(II)得到混合萃取體系，離心，液體部分在2℃條件下靜置2.5h，分離上下相，收集得到約400質(zhì)量份的下相液體。(IV)綠豆α-低聚半乳糖的純化將步驟(III)得到的下相液體，加入2000質(zhì)量份的無水乙醇，以頻率為150次/min的振蕩器在2℃振蕩8min，離心固液分離，收集沉淀物并用四氫呋喃洗滌3次，得到約4.8質(zhì)量份的沉淀物。最后沉淀物溶于28.8質(zhì)量份的水中，加入到預處理后的大孔吸附樹脂AB-8層析柱，洗脫液為0～45％的乙醇溶液，進行梯度洗脫，HPLC跟蹤監(jiān)測下收集水蘇糖、毛蕊花糖、棉籽糖流出液，在-1.0MPa下冷凍干燥5h，得到3.02質(zhì)量份粉末狀綠豆α-低聚半乳糖提取物，折合成未脫脂的明綠豆，其得率為：2.90％。以高效液相色譜外標法檢測綠豆α-低聚半乳糖提取物的組成如下：表2綠豆α-低聚半乳糖提取物的組成實施例3(I)綠豆的前處理將100質(zhì)量份市售明綠豆剔除雜質(zhì)、雜豆、缺陷豆，球磨至粒徑為45μm，烘干至含水量0.3％，加入由200質(zhì)量份石油醚(沸程60～90℃)和200質(zhì)量份乙酸乙酯，以振蕩的方式進行脫脂，振蕩頻率180次/min，脫脂溫度為28℃，時間為2.5h。脫脂完畢后，離心，將濾餅在-1.0MPa下冷凍干燥1.5h，得到約95質(zhì)量份的脫脂綠豆粉，保存于5℃冰箱中。(II)綠豆α-低聚半乳糖的萃取1質(zhì)量份的離子液體[Bmim]HSO4中，加入0.25質(zhì)量份的碳酸氫鉀、0.08質(zhì)量份的十六烷基三甲基溴化銨、7.5質(zhì)量份的去離子水，攪拌溶解，得到萃取液；將100質(zhì)量份的脫脂綠豆粉分散于500質(zhì)量份的萃取液中，以頻率為180次/min的振蕩器，在18℃恒溫條件下，振蕩40min。(III)綠豆α-低聚半乳糖的分離將步驟(II)得到混合萃取體系，離心，液體部分在3℃條件下靜置3h，分離上下相，收集得到約400質(zhì)量份的下相液體。(IV)綠豆α-低聚半乳糖的純化將步驟(III)得到的下相液體，加入2000質(zhì)量份的無水乙醇，以頻率為180次/min的振蕩器在4℃振蕩12min，離心固液分離，收集沉淀物并用四氫呋喃洗滌2次，得到約4.2質(zhì)量份的沉淀物。最后沉淀物溶于29.4質(zhì)量份的水中，加入到預處理后的大孔吸附樹脂AB-8層析柱，洗脫液為0～45％的乙醇溶液，進行梯度洗脫，HPLC跟蹤監(jiān)測下收集水蘇糖、毛蕊花糖、棉籽糖流出液，在-1.2MPa下冷凍干燥7h，得到2.85質(zhì)量份的粉末狀綠豆α-低聚半乳糖提取物，折合成未脫脂的明綠豆，其得率為：2.71％。以高效液相色譜外標法檢測綠豆α-低聚半乳糖提取物的組成如下：表3綠豆α-低聚半乳糖提取物的組成水蘇糖毛蕊花糖棉籽糖α-低聚半乳糖含量蛋白質(zhì)含量33.37％50.67％15.14％99.18％0.82％實施例4(I)綠豆的前處理將100質(zhì)量份市售明綠豆剔除雜質(zhì)、雜豆、缺陷豆，球磨至粒徑為50μm，烘干至含水量0.1％，加入由200質(zhì)量份石油醚(沸程60～90℃)和200質(zhì)量份乙酸乙酯，以振蕩的方式進行脫脂，振蕩頻率200次/min，脫脂溫度為30℃，時間為4h。脫脂完畢后，離心，將濾餅在-0.5MPa下冷凍干燥3h，得到約95質(zhì)量份的脫脂綠豆粉，保存于5℃冰箱中。(II)綠豆α-低聚半乳糖的萃取1質(zhì)量份的離子液體[Bmim]HSO4中，加入0.4質(zhì)量份的碳酸氫鉀、0.1質(zhì)量份的聚季銨鹽-22、8質(zhì)量份的去離子水，攪拌溶解，得到萃取液；將100質(zhì)量份的脫脂綠豆粉分散于500質(zhì)量份的萃取液中，以頻率為200次/min的振蕩器，在20℃恒溫條件下，振蕩45min。(III)綠豆α-低聚半乳糖的分離將步驟(II)得到混合萃取體系，離心，液體部分在5℃條件下靜置4h，分離上下相，收集得到約400質(zhì)量份的下相液體。(IV)綠豆α-低聚半乳糖的純化將步驟(III)得到的下相液體，加入2400質(zhì)量份的無水乙醇，以頻率為200次/min的振蕩器在5℃振蕩15min，離心固液分離，收集沉淀物并用四氫呋喃洗滌3次，得到約4.5質(zhì)量份的沉淀物。最后沉淀物溶于36質(zhì)量份的水中，加入到預處理后的大孔吸附樹脂AB-8層析柱，洗脫液為0～45％的乙醇溶液，進行梯度洗脫，HPLC跟蹤監(jiān)測下收集水蘇糖、毛蕊花糖、棉籽糖流出液，在-0.5MPa下冷凍干燥8h，得到3.13質(zhì)量份的粉末狀綠豆α-低聚半乳糖提取物，折合成未脫脂的明綠豆，其得率為：2.97％。以高效液相色譜外標法檢測綠豆α-低聚半乳糖提取物的組成如下：表4綠豆α-低聚半乳糖提取物的組成水蘇糖毛蕊花糖棉籽糖α-低聚半乳糖含量蛋白質(zhì)含量33.16％51.55％14.66％99.37％0.63％實施例5(I)綠豆的前處理將100質(zhì)量份市售明綠豆剔除雜質(zhì)、雜豆、缺陷豆，球磨至粒徑為30μm，烘干至含水量0.2％，加入由200質(zhì)量份石油醚(沸程60～90℃)和200質(zhì)量份乙酸乙酯，以振蕩的方式進行脫脂，振蕩頻率100次/min，脫脂溫度為20℃，時間為3h。脫脂完畢后，離心，將濾餅在-1.5MPa下冷凍干燥2h，得到約95質(zhì)量份的脫脂綠豆粉，保存于5℃冰箱中。(II)綠豆α-低聚半乳糖的萃取1質(zhì)量份的離子液體[Bmim]BF6中，加入0.2質(zhì)量份的磷酸二氫鉀、0.1質(zhì)量份的硬脂基三甲基溴化銨、6.5質(zhì)量份的去離子水，攪拌溶解，得到萃取液；將100質(zhì)量份的脫脂綠豆粉分散于500質(zhì)量份的萃取液中，以頻率為200次/min的振蕩器，在15～20℃恒溫條件下，振蕩40min。(III)綠豆α-低聚半乳糖的分離將步驟(II)得到混合萃取體系，離心，液體部分在0℃條件下靜置3h，分離上下相，收集得到約400質(zhì)量份的下相液體。(IV)綠豆α-低聚半乳糖的純化將步驟(III)得到的下相液體，加入1600質(zhì)量份的無水乙醇，以頻率為100次/min的振蕩器在5℃振蕩12min，離心固液分離，收集沉淀物并用四氫呋喃洗滌2次，得到約3.88質(zhì)量份的沉淀物。最后沉淀物溶于19.4倍水中，加入到預處理后的大孔吸附樹脂AB-8層析柱，洗脫液為0～45％的乙醇溶液，進行梯度洗脫，HPLC跟蹤監(jiān)測下收集水蘇糖、毛蕊花糖、棉籽糖流出液，在-0.5MPa下冷凍干燥8h，得到2.68質(zhì)量份的粉末狀綠豆α-低聚半乳糖提取物，折合成未脫脂的明綠豆，其得率為：2.55％。以高效液相色譜外標法檢測綠豆α-低聚半乳糖提取物的組成如下：表5綠豆α-低聚半乳糖提取物的組成水蘇糖毛蕊花糖棉籽糖α-低聚半乳糖含量蛋白質(zhì)含量31.37％51.18％16.61％99.16％0.84％對比例1在實施例1中，除去萃取液體中不加入十六烷基三甲基溴化銨外，其他相同。綠豆α-低聚半乳糖提取物的得率為：2.05％。以高效液相色譜外標法檢測綠豆α-低聚半乳糖提取物的組成如下：表6綠豆α-低聚半乳糖提取物的組成水蘇糖毛蕊花糖棉籽糖α-低聚半乳糖含量蛋白質(zhì)含量30.33％50.27％17.94％98.54％1.46％比較實施例1和對比例1，可以看出，不加入表面活性劑，綠豆α-低聚半乳糖提取物的得率會偏低，且其中總α-低聚半乳糖的含量稍低，糖蛋白的含量稍有增加。對比例2在實施例2中，除去萃取液體中不加入硬脂基三甲基氯化銨外，其他相同。綠豆α-低聚半乳糖提取物的得率為：2.12％。以高效液相色譜外標法檢測綠豆α-低聚半乳糖提取物的組成如下：表7綠豆α-低聚半乳糖提取物的組成比較實施例2和對比例2，同樣可以看出，不加入表面活性劑，綠豆α-低聚半乳糖提取物的得率會偏低，且其中總α-低聚半乳糖的含量稍低，糖蛋白的含量稍有增加。實施例6綠豆α-低聚半乳糖提取物抗氧化能力測試以羥基自由基、DPPH自由基為受試物質(zhì)，將實施例1～4制備的綠豆α-低聚半乳糖提取物制成相應的水溶液，考察其對自由基的清除能力。(1)羥基自由基實驗利用H2O2和Fe2+混合發(fā)生Fenton反應，生成具有很高反應活性的羥基自由基，羥基自由基能被水楊酸有效地捕捉，并生成有色物質(zhì)，若加入具有清除自由基的物質(zhì)，便會和水楊酸競爭而減少有色物生成。常溫下，取3支試管，在第一支試管中依次加入0.5ml水楊酸-乙醇溶液(濃度為9.1mmol/l)，3.5ml水，0.5ml樣品溶液，0.5mlFe2+溶液(濃度為9.0mmol/l)，搖勻靜置5min，加入H2O2(濃度為88mmol/l)溶液啟動Fenton反應，搖勻后，避光靜置10min，在510nm波長下測定吸光度，記為A1；第二支試管，取0.5ml水替代Fe2+溶液，其他與第一支試管相同，測得吸光度A2；第三支試管，取0.5ml水代替樣品溶液，其他與第一支試管相同，測得吸光度A3。羥基自由基的清除率為：表8綠豆α-低聚半乳糖提取物對羥基自由基的清除率羥基自由基實驗表明，綠豆α-低聚半乳糖提取物在極低的濃度下對羥基自由基就具有良好的清除效果，濃度越高，清除率越好。以實施例1為例，綠豆α-低聚半乳糖提取物對羥基自由基清除能力的IC50值為0.85mg/ml。(2)DPPH自由基實驗DPPH在有機溶劑中是一種穩(wěn)定自由基，在517nm處有吸收峰，呈紫色，當有自由基清除劑存在時，DPPH會被配對，顏色變淺。加入5mlDPPH溶液(1mgDPPH溶于20ml95％乙醇，超聲5min，于517nm處測吸光度，吸光度為1.2-1.3間最佳)，0.2ml樣品搖勻，于517nm處測定吸光度A1。A2為取5ml95％乙醇溶液替代DPPH溶液所得吸光度，A3為取0.2ml水替代樣品所得的吸光度。DPPH自由基的清除率為：表9綠豆α-低聚半乳糖提取物對DPPH自由基的清除率DPPH自由基實驗表明，綠豆α-低聚半乳糖提取物在極低的濃度下對DPPH自由基就具有良好的清除效果，濃度越高，清除率越好。以實施例1為例，綠豆α-低聚半乳糖提取物對DPPH自由基清除能力的IC50值為0.11mg/ml。特別是，綠豆α-低聚半乳糖提取物與維生素C等強還原劑相比穩(wěn)定性更好，加之其對羥基自由基和DPPH自由基良好的清除能力，從而特別適合在化妝品中應用。(3)以水蘇糖、毛蕊花糖、棉籽糖單個組分來進行抗氧化能力測試，結果如下：表10單個低聚糖對羥基自由基的清除率從單個低聚糖對羥基自由基的清除率來看，實施例1-4所制備的綠豆α-低聚半乳糖提取物對羥基自由基的清除率更好。表11單個低聚糖對DPPH自由基的清除率從單個低聚糖對DPPH自由基的清除率來看，實施例1-4所制備的綠豆α-低聚半乳糖提取物對DPPH自由基的清除率更好。實施例7綠豆α-低聚半乳糖提取物降低刺激性能力測試采用RedBloodCorpuscletest(RBCtest，血紅細胞溶血值)來測試實施例1制備的綠豆α-低聚半乳糖提取物的降低刺激性能力。選擇牛的新鮮血液，用SDS(十二烷基硫酸鈉)水溶液刺激其中的紅細胞，測定530nm吸光度間接判斷從紅細胞中漏出的血紅蛋白的量，基于從紅細胞中漏出的血紅蛋白的量來評價細胞膜的損傷程度，血紅蛋白漏出量越多，損傷越大。實驗方法參考：王海濤等，化妝品用抗敏抗刺激活性物質(zhì)的篩選、提取及作機理研究，北京工商大學，2010。實驗選取新鮮牛血紅細胞進行，樣品A為0.1mol/L的SDS，樣品B、C、D、E、F除含有0.1mol/L的SDS外，還分別含有0.5％的水蘇糖、毛蕊花糖、棉籽糖、實施例1制備的綠豆α-低聚半乳糖提取物和1.0％的實施例1制備的綠豆α-低聚半乳糖提取物。結果見圖1，縱坐標為溶血率，其值越高表明對應樣品刺激越高。從圖1可以看出，水蘇糖、毛蕊花糖、棉籽糖和實施例1制備的綠豆α-低聚半乳糖提取物都有降低SDS刺激性的作用，相較而言，實施例1制備的綠豆α-低聚半乳糖提取物的活性更好。同時，樣品E和F表明，綠豆α-低聚半乳糖提取物降低刺激性的能力與其加入量成正相關。因此，綠豆α-低聚半乳糖提取物添加到化妝品中，具有降低表面活性劑等的刺激性的作用。實施例8綠豆α-低聚半乳糖提取物舒緩過敏的測試以2.0％的SDS水溶液刺激兩側前臂內(nèi)側，出現(xiàn)紅腫、灼熱、瘙癢等癥狀，用1.0％實施例1制備的綠豆α-低聚半乳糖提取物水溶液涂抹5min后進行感官評價，以0.25％的甘草酸二鉀水溶液做為參照，測試人員18人。結果如下表：表12綠豆α-低聚半乳糖提取物舒緩過敏從測試結果可以看出，綠豆α-低聚半乳糖提取物具有一定的舒緩過敏的作用。本測試為感官性測試，即使考慮個體差異影響因素，仍可認為具有較好的舒敏作用，適于在化妝品中使用。以上，對本發(fā)明的實施方式進行了說明。但是，本發(fā)明不限定于上述實施方式。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁1 2 3 

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