本發(fā)明屬于中藥制備技術領域，具體涉及一種烏梅提取物的制備方法及其質量檢測方法。

背景技術：

烏梅為薔薇科植物梅prunusmume(sieb.)sieb.etzucc.的干燥近成熟果實。味酸、澀，性平。歸肝、脾、肺、大腸經(jīng)。具有斂肺，澀腸，生津，安蛔之功效。常用于肺虛久咳，久瀉久痢，虛熱消渴，蛔厥嘔吐腹痛?，F(xiàn)代研究表明，烏梅含有豐富的有機酸成分，以枸櫞酸為主，還包括蘋果酸、綠原酸、延胡索酸、酒石酸、草酸、琥珀酸等。除此之外還含有黃酮類、揮發(fā)性成分、糖類等物質，具有抗菌、消炎、抗疲勞等藥理作用。但是，目前制備的烏梅飲品質量殘差不齊，因沒有國家統(tǒng)一的質量標準，也沒有一致的行業(yè)標準，導致質量標準差異很大，有的有含量測定，有的無含量測定，含量測定的指標成分和含量測定的方法不盡相同，即使含量的指標成分和含量測定方法相同，但含量測定限度的表述不一致，有的按百分比計，有的以每克計，有的以每袋計，所測的指標絕對量更是不同的，這樣難以界定含量測定的統(tǒng)一限度。根據(jù)2010年藥典編制大綱提出中成藥及中藥材應“逐步由單一指標性成分定性定量測定，向活性、有效成分及生物測定的綜合檢測過渡，向多成分和指紋或特征圖譜整體質量控制模式轉化”。其中，在對鑒定的技術要求中指出，所采用的色譜特征圖譜，“應至少指認其中3個以上的有效成分、特征成分或主成分并對其比例作出規(guī)定，而指認峰的峰面積之和應大于總峰面積的50％?！?參見2010年版《中華人民共和國藥典》一部提取物質量標準起草技術要求)。

為此，有必要建立一種穩(wěn)定、精密度高的多成分和特征峰圖譜，用以科學、有效地檢測中藥復方制劑烏梅湯劑的質量。該特征峰圖譜應具有以下幾個特點：1、至少應指認出特征峰圖譜中3個以上的色譜峰，指認色譜峰的峰面積之和應大于總峰面積的50％；2、指認的色譜峰應能覆蓋復方中的組成中藥；3、指認的色譜峰應當覆蓋與組方(復方)功效大體相應的活性成分。

因此，為嚴格控制烏梅顆粒的質量，為烏梅提取物或顆粒的生產(chǎn)工藝提供更全面的質量控制參數(shù)，對烏梅提取物特征圖譜的特征峰相對峰面積設定限量標準，是非常必要的。

技術實現(xiàn)要素：

為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種烏梅提取物的制備方法及其質量檢測方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下的技術方案為：

一種烏梅提取物的制備方法，其包括將烏梅飲片加水煎煮1～3次，合并濾液，濾液水浴冷卻后濃縮；濾液減壓濃縮至適量，置于進行冷凍干燥，即得烏梅提取物。

優(yōu)選地，加水量為使水浸過烏梅飲片藥面的2～5cm。

如上所述的制備方法，優(yōu)選地，所述烏梅飲片加入6～10倍水浸泡20～30min，每次煎煮20～30min，選擇200目～300目標準篩趁熱過濾，合并濾液；所述水浴冷卻至60℃～70℃后濃縮。

如上所述的制備方法，優(yōu)選地，所述減壓濃縮的溫度為60℃～70℃，濃縮真空度為-0.085～-0.09mpa，濃縮后相對密度為1.04～1.07g/ml。

如上所述的制備方法，優(yōu)選地，所述冷凍干燥包括：所述冷凍干燥包括：預凍溫度為-45℃，預凍時間6h，升華干燥溫度為-35℃～0℃，時間為24h；解析干燥溫度為0℃～15℃，時間為9h，真空度為0～0.2mbar。

本發(fā)明的制備方法中采用低溫濃縮和冷凍干燥，最大限度保留中藥有效成分群，制成烏梅提取物的凍干粉。

一種烏梅提取物的質量檢測方法，為采用超高效液相色譜法對烏梅提取物的特征峰圖譜的測定，包括以下步驟：

s1、制備烏梅提取物的樣品溶液；

s4、制備枸櫞酸對照品溶液：

s3、采用超高效液相色譜儀進行色譜分析，記錄色譜圖，與參照物相應的峰為s峰。

如上所述的質量檢測方法，優(yōu)選地，所述特征峰圖譜的測定的色譜柱為島津2.1×150mm2μm色譜柱，柱長為150mm，內徑2.1mm，粒徑為2μm；以乙腈為流動相a，以0.5％ph值為2.9的磷酸二氫銨水溶液為流動相b，進行梯度洗脫；柱溫為30℃；流速為每分鐘0.2ml；檢測波長為210nm，理論板數(shù)按枸櫞酸計算應不低于5000。

如上所述的質量檢測方法，優(yōu)選地，所述烏梅提取物的樣品溶液的制備為取烏梅提取物樣品約0.23g，精密稱定，置具50ml容量瓶中，加水溶解定容，搖勻后，濾過，取續(xù)濾液，即為烏梅提取物樣品液。

如上所述的質量檢測方法，優(yōu)選地，所述梯度洗脫為：0～3min，1％→2％流動相a；3～9min，2％→8％流動相a；9～30min，8％→8％流動相a；30～40min，8％→10％流動相a；40～41min，10％→1％流動相a；41～46min，1％→1％流動相a。

進一步地，特征峰圖譜中應有6個較為明顯的共有峰，各峰的相對保留時間規(guī)定，規(guī)定范圍，相對峰面積規(guī)定范圍，及各峰對應的化合物為：

如上所述的檢測方法，優(yōu)選地，所述枸櫞酸含量的測定方法包括樣品溶液制備和枸櫞酸對照品制備，用液相色譜儀進行測定。

進一步地，所述液相色譜儀的條件為分別精密吸取對照品溶液10μl與供試品溶液各5μl，以乙腈-0.5％磷酸二氫按溶液按體積比為3:97，并用磷酸調ph值至3.0為流動相為流動相；檢測波長為210nm；理論板數(shù)按枸櫞酸計算應不低于7000。

如上所述的質量標準化測定方法，優(yōu)選地，所述樣品溶液制備方法為取烏梅提取物約0.1g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入50ml水，搖勻，溶解，濾過，取濾液作為供試品溶液；枸櫞酸對照品為含枸櫞酸0.5mg/ml的水溶液。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明提供的一種烏梅提取物的制備方法，有效提取出烏梅中有效成分，其制備工藝穩(wěn)定，使得工藝標準化，并可用于烏梅藥材、顆粒劑配方顆粒等，通過烏梅提取物進行對質量標準化測定方法的研究，使得獲得的烏梅提取物的質量能穩(wěn)定控制。本發(fā)明提供的烏梅提取物色譜特征圖譜用于中藥的質量控制，能夠提供較為豐富的信息，為產(chǎn)品提供質量控制手段。

本發(fā)明還提供了對烏梅提取物或烏梅凍干粉的特征峰圖譜在檢測烏梅提取物的質量中的應用，可用于鑒定烏梅提取物或烏梅凍干粉的質量。

附圖說明

圖1為實施例1中烏梅提取物凍干曲線；

圖2為實施例2中烏梅提取物制備工藝流程圖；

圖3為不同提取溶劑的提取效率對比圖；

圖4為不同提取方式的提取效率對比圖；

圖5為枸櫞酸對照品的紫外吸收圖；

圖6為烏梅標提取物樣品的dad-3d圖；

圖7為賽默飛色譜柱、流速為0.4ml/min下的色譜圖；

圖8為賽默飛色譜柱、流速為0.5ml/min下的色譜圖；

圖9為安捷倫色譜柱的色譜圖；

圖10為島津色譜柱的色譜圖；

圖11為有機酸優(yōu)化的色譜圖，其中，圖11(a)為0.1％磷酸的色譜圖，圖11(b)為0.1％甲酸的色譜圖；

圖12為ph的優(yōu)的色譜圖，其中，圖12(a)為ph2.8的色譜圖，圖12(b)為ph2.9的色譜圖；圖12(c)為ph3.0的色譜圖，圖13為烏梅提取物對照特征圖譜；

圖14為烏梅提取物lc-ms質譜圖；其中圖14(a)為負離子模式tic質譜圖；圖14(b)為負離子模式bpi質譜圖；圖14(c)為210nm紫外色譜圖；

圖15為烏梅提取物專屬性考察結果，其中，圖15(a)為空白溶劑，圖15(b)為烏梅提取物；

圖16為烏梅提取物整體性考察結果，其中，圖16(a)為46min，圖16(b)為90min。

具體實施方式

以下實施例用于進一步說明本發(fā)明，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質的前提下，對本發(fā)明所作的修飾或者替換，均屬于本發(fā)明的范疇。

若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。

實施例1

烏梅提取物的制備方法：s1、取烏梅100g，稱定，置砂鍋中，一煎藥液是加水量6倍量，加入煎藥壺，煎煮30min，300目標準篩趁熱過濾，濾液水浴冷卻；藥渣再加水10倍量進行二煎20min，標準篩200目趁熱過濾，合并兩次濾液，濾液水浴冷卻至65℃后濃縮；濾液減壓濃縮至適量，置于冷凍干燥機中，冷凍干燥，即得烏梅提取物。

優(yōu)選地，濃縮采用旋轉蒸發(fā)儀進行真空減壓濃縮(真空度：-0.085～-0.090mpa)，濃縮溫度為65℃，濃縮1～2小時至適宜體積，濃縮液比重為1.04～1.07(溫度65℃)，含固率為10.0～20.0％。

優(yōu)選地，取上述烏梅濃縮液，加水稀釋至含固量約為10.0-15.0％，真空冷凍干燥機共晶點測試結果為-28℃，故烏梅濃縮液預凍溫度可考慮為-45℃，升華干燥溫度為-35℃-0℃，解析干燥溫度為10℃-30℃，各階段凍干工藝參數(shù)如表1所示，凍干曲線如圖1所示。

表1烏梅冷凍干燥參數(shù)設置

優(yōu)選地，烏梅濃縮液含固量至10％-15％，量取約1ml均勻分裝至10ml西林瓶中，放入真空冷凍干燥機中進行冷凍干燥，烏梅濃縮液預凍溫度可考慮為-45℃，預凍時間為6小時，升華干燥溫度為-35℃-0℃，升華干燥時間為24小時，真空度為0.2mbar；解析干燥溫度為0℃-15℃，解析干燥時間為9小時，真空度為0.2mbar。最后，獲得質地疏松的棕褐色絮狀固體。

實施例2

烏梅提取物制備工藝，按圖2的工藝流程圖進行：(1)分別稱取3份烏梅，每份約100g，第一煎加8倍水，第二煎加6倍水，浸泡30分鐘后開始煎煮。第一煎開武火(500w)，待煮沸后，調為文火煎煮30分鐘。趁熱分別200目濾布。第二煎(200w)，待煮沸后，調為文火分別煎煮25分鐘。趁熱分別200目濾布。合并相同目數(shù)下的煎液，將煎液在65℃下濃縮后取樣測定收膏率和枸櫞酸的轉移率。結果如表：取烏梅100g，稱定，置砂鍋中，加入8倍水浸泡30min后開始煎煮。先武火(500w)煮沸，再文火(200w)煎煮30min，選擇100目標準篩趁熱過濾，濾液水浴冷卻；

(2)藥渣再加6倍水，武火(500w)煮沸后，再文火(200w)煎煮25min，300目標準篩趁熱過濾，濾液水浴冷卻；

(3)合并濾液65℃減壓濃縮，取濃縮液測定收膏率。濃縮液出膏率的計算公式：出膏率％＝濃縮液重量×濃縮液含固率/烏梅量×100％。提取物濃縮液出膏率值即為提取物出膏率。結果如表2所示。其中，烏梅濃縮液含固率測定方法：精密稱取濃縮液10g，置已恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3小時，置干燥器中冷卻30分鐘，迅速精密稱定重量，計算得到濃縮液含固率。本實施例中所用的樣品選擇為烏梅201802(含量29.29％)、烏梅201803(含量27.70％)、烏梅201804(含量25.88％)。

表2

(4)凍干前，加水調節(jié)濃縮液的固含量至10.0-15.0％左右，后進行冷凍干燥，即得烏梅提取物，提取物的收率見表3。提取物樣品指標成分轉移率計算方法:提取物樣品中指標成分轉移率(％)＝提取物凍干粉含量/飲片含量×提取物出膏率(％)。

表3

經(jīng)上述3批分別平行3次的驗證結果表明烏梅提取物的制備工藝穩(wěn)定。

實施例3枸櫞酸含量測定分析方法的建立

(1)對照品來源及純度檢查

枸櫞酸對照品(編號：100396-201603)，購于中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，含量以100％計，使用前105℃干燥2h。實驗對枸櫞酸全波長掃描，記錄其紫外吸收圖，結果由圖可知：枸櫞酸為末端吸收，選擇檢測波長為210nm。

(2)色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.5％磷酸二氫按溶液(3:97)(用磷酸調ph值至3.0)為流動相。理論板數(shù)按枸櫞酸計算應不低于7000。

(3)供試品溶液的制備

a不同提取試劑的優(yōu)化

取烏梅提取物(批號：bt201801)1.0g，研細，精密稱定0.1g，平行2份，置具塞錐形瓶中，精密加入水、稀乙醇、75％乙醇、乙醇、50％甲醇、75％甲醇、甲醇各50ml，密塞，稱定重量，分別超聲(功率250w，頻率50khz)處理30分鐘，放冷，再稱定重量，用相應的溶劑補足減失的重量，搖勻、濾過，取續(xù)濾液，即得。分別精密吸取各供試液5μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，得枸櫞酸含量。

表4不同提取溶劑的比較

由上表可以看出：采用水作為提取溶劑時，烏梅中枸櫞酸含量較高，且以水作為溶劑，有較好的溶解度和分離度，因此以水作溶劑效果最好。

b不同提取方法的優(yōu)化

取烏梅提取物(批號：bt201801)1.0g，研細，精密稱定0.1g，平行三份，置具塞錐形瓶中，精密加入水50ml，密塞，稱定重量，分別超聲(功率250w，頻率50khz)處理30分鐘、加熱回流30分鐘、直接溶解，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻、濾過，取續(xù)濾液，即得。分別精密吸取各供試液5μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，得枸櫞酸總含量，結果如見表5所示。

表5不同提取方法的比較

結果表明：超聲提取方式所得枸櫞酸含量最低，回流提取與直接溶解方式所得枸櫞酸含量相近，在考慮到操作時間及效率的條件下，直接溶解是最佳方式。

(4)含量測定分析方法的方法學驗證

1).重復性試驗：取烏梅提取物(批號：bt201801)約0.1g，平行6份，精密稱定，制備樣品供試液，分別進樣5μl，測定樣品中枸櫞酸峰面積值，計算其總量及rsd，結果表明重復性(rsd％＝0.11％)良好。

2).耐用性試驗

取樣品1份(批號：bt201801)，按上述制備供試品溶液供試液，考察0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min三個流速。結果表明：三種流速下色譜峰分離效果均較好。流速為1.0ml/min時分析所需時間適中，優(yōu)選流速為1.0ml/min。

取樣品1份(批號：bt201803-1)，按上述制備供試品溶液供試液，考察25℃、30℃、35℃三個溫度。結果表明三種柱溫下色譜峰分離效果均較好。考慮到色譜柱的耐受性及分析所需時間，因此選擇柱溫為30℃。

取樣品1份(批號：bt201803-1)，按上述前處理方法2制備供試品溶液供試液，分別采用1-diamonsil-c18(dimka，250×4.6mm，5μm)、2-inertsilods-hl(glsciences，250×4.6mm，5μm)、3-uitimatexb-c18(welch，250×4.6mm，5μm)三種色譜柱，對烏梅提取物樣品進行分析。結果顯示，三種色譜柱的分離均較好，保留時間適中，說明色譜柱對樣品的測定結果影響較小。

3).穩(wěn)定性試驗

取樣品1份(批號：bt201801)，按上述方法制備供試品溶液供試液，每隔2個小時進樣10μl，測定峰面積值，計算其rsd，共測定10小時。結果表明：樣品供試液在10小時內穩(wěn)定性良好(枸櫞酸的rsd％＝0.28％。)

4).回收率

分別取已知高含量的樣品(批號：bt201801，含量：66.29％)約0.05g，精密稱定，加入枸櫞酸對照品32.05mg，共6份，按供試品溶液制備方法制成供試品溶液，分別進樣5μl，測定枸櫞酸峰面積，計算其含量，以下列公式計算回收率，rsd，結果見表7。

表7

實驗結果顯示枸櫞酸回收率為99.07％，根據(jù)《中國藥典》2015版四部“藥品質量標準分析方法驗證指導原則”規(guī)定樣品中待測成分含量為10％時，回收率限度為95％～102％，表明回收率良好。取已知含量的樣品(批號：bt201815，含量：49.04％)0.050g，精密稱定，分別加入枸櫞酸對照品24.26mg，共6份，按供試品溶液制備方法制成供試品溶液，分別進樣5μl，測定枸櫞酸峰面積，計算其含量，并按以下列公式計算回收率及rsd，結果見表8。

表8

實施例5烏梅提取物的特征圖譜分析方法

1.超高效液相色譜條件的確定

檢測波長的確定：取烏梅提取物(批號：bt201801)適量，研細。精密稱取0.23g，加25％乙醇50ml，超聲處理30分鐘，濾過，取續(xù)濾液作為供試液，記錄210～400nm范圍內的吸收光譜。結果表明，在210nm左右，烏梅提取物樣品溶液可以檢測到的色譜峰最多，且各色譜峰的峰面積較大，因此選擇210nm為檢測波長。

流動相的優(yōu)化：采用賽默飛(hypesilgold2.1*100mm，1.9μm)色譜柱；以乙腈為流動相a，以0.5％ph值為3.0的磷酸二氫銨水溶液為流動相b，按0-20min，3％→97％流動相a，97％→3％流動相b，20-21min，97％→3％流動相a，3％→97％流動相b，21～23min，3％流動相a，97％流動相b進行梯度洗脫；柱溫為30℃；流速為每分鐘0.40ml/min；檢測波長為210nm。結果表明，烏梅提取物主要含大極性成分。通過對流速為0.5ml/min，調整梯度后試驗表明10cm柱長的短柱比較難達到理想的分離效果，因此決定換成15cm柱長的柱子，同時梯度結果也表明烏梅提取物在乙腈比例不到20％時就洗脫完全。

通過用安捷倫(zorbaxsb-c182.1×150mm，1.8μm)；以乙腈為流動相a，以0.5％ph值為3.0的磷酸二氫銨水溶液為流動相b，按不同梯度洗脫；柱溫為30℃；流速為每分鐘0.20ml/min；檢測波長為210nm。結果表明，梯度中乙腈比例可以繼續(xù)降低，而且發(fā)現(xiàn)這跟安捷倫柱子的分離效果還需優(yōu)化，考慮換根柱子。

用島津(inertsilods-3，2.1×150mm，2μm)色譜柱；以乙腈為流動相a，以0.5％ph值為2.9的磷酸二氫銨水溶液為流動相b，按下表9中的規(guī)定進行梯度洗脫；柱溫為30℃；流速為每分鐘0.20ml；檢測波長為210nm。

表9洗脫梯度

結果表明有較好的分離效果。用島津(inertsilods-32.1×150mm2μm)色譜柱，采用上述色譜條件，取烏梅凍干粉的供試品溶液，先后比較使用0.1％磷酸與0.1％甲酸的情況。結果表明，使用0.1％磷酸與0.1％甲酸都沒有很好的分離情況，因此不考慮使用這兩種有機酸。

用島津(inertsilods-32.1×150mm2μm)色譜柱，采用上述色譜條件，取烏梅凍干粉的供試品溶液，先后比較使用ph2.8，ph2.9，ph3.0磷酸二氫銨水溶液-乙腈為流動相的出峰情況。結果表明，ph值為2.9為時基線更平穩(wěn)，分離效果最好。

色譜條件的確定：最終確定了如下色譜條件：島津(inertsilods-32.1×150mm2μm)色譜柱(柱長為150mm，內徑2.1mm，粒徑為2μm)；以乙腈為流動相a，以0.5％ph值為2.9的磷酸二氫銨水溶液為流動相b，按表9中的規(guī)定進行梯度洗脫；柱溫為30℃；流速為每分鐘0.20ml；檢測波長為210nm。理論板數(shù)按枸櫞酸計算應不低于5000。

2.供試品溶液的制備

提取溶劑優(yōu)化：取烏梅提取物(批號：bt201801)適量，研細。取約0.23g，精密稱定，精密加入25％甲醇、50％甲醇、75％甲醇、甲醇、25％乙醇、稀乙醇、75％乙醇、乙醇、和水各50ml，密塞，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，再稱定重量，用不同的溶劑補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，按最終確定的色譜條件進行液相色譜。結果如圖3所示，結果表明：25％甲醇和水的提取效果最好，而用含有乙醇的溶劑提取，枸櫞酸峰位的情況比較差，初步懷疑是溶劑效應所引起。

為了驗證以上的推測，進行一下試驗：精密量取25％乙醇、稀乙醇、75％乙醇、乙醇提取的樣品10ml于蒸發(fā)皿中，待溶劑揮干后加水復溶，轉移至10ml容量瓶中，用水定容，過濾，取續(xù)濾液進樣，同時取枸櫞酸對照溶液分別用稀乙醇、乙醇、水稀釋進樣，比較樣品出峰情況，試驗結果如下：結果表明，用含乙醇的溶液提取烏梅提取物樣品，其進樣結果會出現(xiàn)嚴重的溶劑效應，綜合考慮選水作為提取溶液。

提取方式優(yōu)化：取烏梅提取物(批號：bt201801)適量，研細。取約0.23g，精密稱定，加入水溶液50ml，稱定重量，分別加熱回流、振搖提取、超聲處理30分鐘，放冷，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，濾過，取過濾液，進行液相色譜。結果如圖4所示，結果表明這幾種提取方式差別不大，綜合考慮，選擇加水直接溶解的提取方式。

最后確定供試品溶液的制備：取本品約0.23g，精密稱定，置具50ml容量瓶中，加水溶解定容，搖勻后，濾過，取過濾液，按上述確定的色譜條件進行液相色譜儀，分別精密吸取對照品溶液10μl與供試品溶液5μl，注入液相色譜儀，測定。

結果表明烏梅提取物的特征圖譜中由6個較為明顯的共有峰。積分參數(shù)：峰寬為0.1；最小峰面積為0.1；基線噪音范圍：自動。

驗證方法的重復性：取同一批號樣品(批號：bt201801)共6份，按供試品溶液制備方法制備成供試液，進樣1μl分析，考察特征峰相對保留時間和相對峰面積的一致性，結果見表10、表11。

表10重復性實驗結果(相對保留時間)

表11重復性實驗結果(相對峰面積)

結果表明：各特征峰的相對保留時間及相對峰面積值的rsd均小于3％，該方法的重復性良好。

驗證方法的精密度：取同一批號樣品(批號：bt201801)，按供試品溶液制備方法制備成供試液，進樣6次，每次1μl，考察特征峰相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果表明：各特征峰相對保留時間及相對峰面積值rsd均小于3％，儀器精密度良好。

驗證方法的穩(wěn)定性：取同一批號樣品(批號：bt201801)，按供試品溶液制備方法制備成供試液，每隔2小時進樣一次，共測定12小時，分別進樣1μl，考察特征峰相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果表明：各特征峰的相對保留時間及相對峰面積的rsd均小于3％，供試液在12小時內穩(wěn)定性良好。

實施例6特征圖譜分析方法的優(yōu)化條件及結果

為了控制烏梅配方顆粒的質量并為其生產(chǎn)工藝提供較全面的質量控制參數(shù)，建立的烏梅提取物特征圖譜，并對其特征峰的相對峰面積設定限量標準。具體方法如下：

參照物溶液的制備：取枸櫞酸對照品對照品適量，精密稱定，加水制成每1ml含枸櫞酸0.5mg即得。

1.色譜條件的確定

檢測波長的確定，取枸櫞酸對照品的水溶液，進樣1μl進行分析，記錄其紫外吸收圖。結果如圖5所示，結果表明，枸櫞酸為末端吸收。

取烏梅標準湯劑(批號：bt201801)適量，研細。精密稱取0.23g，加25％乙醇50ml，超聲處理30分鐘，濾過，取續(xù)濾液作為供試液，記錄210～400nm范圍內的吸收光譜。結果如圖6所示，結果表明，在210nm左右，烏梅標準湯劑樣品溶液可以檢測到的色譜峰最多，且各色譜峰的峰面積較大，因此選擇210nm為檢測波長。

流動相梯度考察：采用賽默飛(hypesilgold2.1*100mm，1.9μm)色譜柱；以乙腈為流動相a，以0.5％ph3.0的磷酸二氫銨水溶液為流動相b，按下表12中的規(guī)定進行梯度洗脫；柱溫為30℃；流速為每分鐘0.40ml/min；檢測波長為210nm。

表12

結果見圖7，結果表明，烏梅提取物主要含大極性成分。

同樣的色譜條件，流速為0.5ml/min，調整梯度并按下表13中的規(guī)定進行梯度洗脫。

表13

試驗結果見圖8所示，結果表明10cm柱長的短柱比較難達到理想的分離效果，因此決定換成15cm柱長的柱子，同時梯度結果也表明烏梅提取物在乙腈比例不到20％時就洗脫完全。

用安捷倫(zorbaxsb-c182.1*150mm，1.8μm)；以乙腈為流動相a，以0.5％ph3.0的磷酸二氫銨水溶液為流動相b，按下表14中的規(guī)定進行梯度洗脫；柱溫為30℃；流速為每分鐘0.20ml/min；檢測波長為210nm。

表14

結果如圖9所示，結果表明，梯度中乙腈比例可以繼續(xù)降低，而且發(fā)現(xiàn)這跟安捷倫柱子的分離效果還需優(yōu)化，考慮換根柱子。

用島津(inertsilods-3，2.1×150mm，2μm)色譜柱；以乙腈為流動相a，以0.5％ph2.9的磷酸二氫銨水溶液為流動相b，按下表15中的規(guī)定進行梯度洗脫；柱溫為30℃；流速為每分鐘0.20ml；檢測波長為210nm。

表15

結果如圖10所示。結果表明能很好的分離。

2.有機酸的確定

用島津(inertsilods-32.1×150mm2μm)色譜柱，采用上述色譜條件，取烏梅凍干粉的供試品溶液，先后比較使用0.1％磷酸與0.1％甲酸的情況。

結果如圖11所示，其中圖11(a)為0.1％磷酸的色譜圖，圖11(b)為0.1％甲酸的色譜圖，結果表明，使用0.1％磷酸與0.1％甲酸都沒有很好的分離情況，因此不考慮使用這兩只有機酸。

3.ph的優(yōu)化

用島津(inertsilods-32.1×150mm2μm)色譜柱，采用上述色譜條件，取烏梅凍干粉的供試品溶液，先后比較使用ph2.8，ph2.9，ph3.0磷酸二氫銨水溶液-乙腈為流動相的出峰情況。結果如圖12所示，其中，圖12(a)為ph2.8的色譜圖，圖12(b)為ph2.9的色譜圖；圖12(c)為ph3.0的色譜圖，結果表明，ph為2.9為時基線更平穩(wěn)，分離效果最好。

色譜條件的確定：

供試品溶液的制備：取本品約0.23g，精密稱定，置具50ml容量瓶中，加水溶解定容，搖勻后，濾過，取過濾液進樣。

最終確定了如下色譜條件：島津(inertsilods-32.1×150mm2μm)色譜柱(柱長為150mm，內徑2.1mm，粒徑為2μm)；以乙腈為流動相a，以0.5％ph2.9的磷酸二氫銨水溶液為流動相b，按如下梯度洗脫：0～3min，1％→2％流動相a；3～9min，2％→8％流動相a；9～30min，8％→8％流動相a；30～40min，8％→10％流動相a；40～41min，10％→1％流動相a；41～46min，1％→1％流動相a；

柱溫為30℃；流速為每分鐘0.20ml；檢測波長為210nm。理論板數(shù)按枸櫞酸計算應不低于5000。

參照物溶液的制備取枸櫞酸對照品適量，精密稱定，加水制成每1ml含枸櫞酸0.5mg即得。

對于烏梅取樣地點為福建龍巖、云南玉溪、云南大理、云南保山、四川成都、四川雅安、四川達州實地取樣，每個產(chǎn)區(qū)選擇不同的鄉(xiāng)鎮(zhèn)、村分別取樣3批以上，確保各地區(qū)樣品的代表性，累計取樣18批。按照實施例2中烏梅提取物制備方法進行，最終確定了烏梅提取物中出膏率上、下限范圍為15.7％～29.2％?；趯?8批次烏梅提取物按照上述供試品溶液制備方法進行，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各1μl，注入液上述條件液相色譜儀，測定，結果共得到6個共有峰。

枸櫞酸(峰1)為烏梅中的活性成分，且色譜峰分離度好，周圍沒有其它色譜峰干擾，因此選為參照峰。同時，枸櫞酸為含量測定的指標成分之一，以枸櫞酸峰作為參照峰并規(guī)定其他各特征峰的相對峰面積范圍，使得各特征峰相對峰面積范圍具有的定量意義?；?8批次烏梅提取物的測定結果，每個特征峰取其18批次中的最小值和最大值，作為峰面積范圍的下限和上限，兼顧了烏梅的品種特性，能避免大生產(chǎn)部分合格批次的誤判，又能對大生產(chǎn)工藝提供重要質量控制參數(shù)，從而提高了產(chǎn)品質量及質量控制水平。

結果表明，供試品特征圖譜中應有6個特征峰，與參照物相應的峰為s峰，如圖13所示為例。計算各特征峰與s峰的相對保留時間，其相對保留時間應在規(guī)定值的±5％之內；計算各特征峰與s峰的相對峰面積，結果如表16所示。積分參數(shù)：峰寬為0.1；最小峰面積為0.1；基線噪音范圍：自動。

表16烏梅提取物特征圖譜相對峰面積

實施例7特征峰的指認

采用lc-ms技術，取烏梅標準湯凍干粉，約50mg，精密加入去離子水50ml，超聲處理(功率100w，頻率30khz)30分鐘，使溶解，搖勻，過濾(0.22μm)。

uplc條件：

watersacquityuplc色譜儀；

色譜柱：watershsst3uplc色譜柱(2.1*100mm,1.8μm)；

流動相系統(tǒng)：0.1％甲酸水(a)：甲醇(b)；按照下表17梯度程序洗脫；

流速：0.4ml/min；

檢測波長270，254，210nm；柱溫：30℃；進樣量：3μl；0.8μl(對照品)

表17.梯度提取程序

質譜條件：watersxevog2-xsqtof質譜儀，esi離子源正負離子檢測；源電壓：2.5kv，n2流速：800l/h,碰撞氣體為氮氣；毛細管溫度400℃；錐孔氣體流速：100l/h；氣源溫度：120℃；采用全掃描方式，分子量掃描范圍50～1500；碰撞誘導解離電壓：6v(低能量)、30～60v(高能量)。同時對標準品：苦杏仁苷；綠原酸；枸櫞酸做為對照做超高效液相圖譜。

烏梅標準湯lc-ms質譜圖結果表明，如圖14所示，其中(a:負離子模式tic質譜圖；b：負離子模式bpi質譜圖；c:210nm紫外色譜圖)。通過針對下圖中的6個特征峰進行鑒定，從各峰的紫外吸收和質譜分子量來看，峰1即為枸櫞酸，峰5為綠原酸；此外，標準湯中含有微量的苦杏仁苷。峰2(5.96min):dad圖譜顯示最大紫外吸收在254nm，提示結構中含有苯環(huán)；質譜：329.08722(m-h)；167.03393(m-glu)；152.01033(m-glu-ch3)；123.04430(m-glu-coo)，提示結構中含有羧基，葡萄糖單元。初步推測結構如下所示。

峰3(7.53min):dad顯示最大紫外吸收為323nm；從紫外掃描圖可推測該成分具有咖啡酸類似結構；質譜：707.18261(2m-h)；353.08674(m-h)；191.05502碎片提示具有奎尼酸單元；135.04392碎片進一步證實具有咖啡酸單元；因此色譜峰3初步鑒定為綠原酸的同分異構體，新綠原酸(c16h18o9,cas:906-33-2)。峰4(11.60min):dad圖譜顯示最大吸收在308nm處；質譜：487.14524(m-h)。峰a(14.15min)：dad顯示最大紫外吸收為327nm；從紫外掃描圖可推測該成分具有咖啡酸類似結構；質譜：707.18252(2m-h)；353.08709(m-h)；191.05495碎片提示具有奎尼酸單元；135.04402碎片進一步證實具有咖啡酸單元；因此色譜峰4初步鑒定為綠原酸和新綠原酸的同分異構體，隱綠原酸(c16h18o9,cas:905-99-7)。峰6(15.77min)：dad顯示峰6具有紫外末端吸收；質譜：447.15033(m+hcoo)，401.14462(m-h)。

通過對對照品a.綠原酸；b.隱綠原酸；c.新綠原酸的指認，鑒定色譜峰1、3、5和a分為1.枸櫞酸；3.新綠原酸；5.綠原酸；4.隱綠原酸。

實施例8特征圖譜分析方法的方法學驗證

1、專屬性

對烏梅提取物和空白溶劑分別采用實施例6中確定的圖譜條件進行高效液相色譜特征圖譜的測定，結果見圖15，圖15(a)為空白溶劑，圖15(b)為烏梅提取物，由結果可知，溶劑對烏梅標準湯劑圖譜中的特征峰沒有干擾。

2、整體性

對烏梅提取物進行特征峰圖譜的測定46min和90min，結果如圖16所示，圖16(a)為46min，圖16(b)為92min。結果表明，烏梅標準湯劑在40min后無明顯的色譜峰，整體性較好。

3、精密度

取同一批號樣品(批號：bt201801)，按供試品溶液制備方法制備成供試液，進樣6次，每次1μl，考察特征峰相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果如表18和19所示。

表18精密度實驗結果(相對保留時間)

表19精密度實驗結果(相對峰面積)

結果表明：各特征峰相對保留時間及相對峰面積值rsd均小于3％，儀器精密度良好。

4、重復性

取同一批號樣品(批號：bt201801)共6份，按供試品溶液制備方法制備成供試液，進樣1μl分析，考察特征峰相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果見表20、表21。

表20重復性實驗結果(相對保留時間)

表21重復性實驗結果(相對峰面積)

結果表明：各特征峰的相對保留時間及相對峰面積值的rsd均小于3％，該方法的重復性良好。

5、耐用性

(1)柱溫的考察：用島津(inertsilods-3，2.1×150mm，2μm)色譜柱，取烏梅凍干粉的供試品溶液，分別考察了柱溫為25℃、30℃、35℃時的樣品分離效果。結果表明，柱溫對烏梅提取物的出峰情況影響比較明顯，其中柱溫為30℃時的分離效果最好。

(2)流速的考察：用島津(inertsilods-32.1×150mm2μm)色譜柱，取烏梅凍干粉的供試品溶液，分別考察了流速為0.25ml/min、0.20ml/min、0.15ml/min時的樣品分離效果。結果表明，流速對烏梅提取物物質的出峰時間影響較大，但對分離效果影響較小，綜合考慮選擇0.20ml/min。

(3)色譜柱的考察：取烏梅凍干粉的供試品溶液，先后比較三種不同填料的色譜柱的分離效果，3支色譜柱分別為：1-安捷倫(zorbaxsb-c182.1*150mm，1.8μm)、2-迪馬(endeavorsil2.1×150mm，1.8μm)、3-島津(inertsilods-32.1×150mm2μm)。結果表明，使用島津(inertsilods-32.1×150mm2μm)的分離度最好，因此選擇島津(inertsilods-32.1×150mm2μm)進行。

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