Extraction technology and inhibitory effects in vitro of substances inhibiting pancreatic lipase activities from fruiting body of Auricaria heimuer

HUANG Lin-Xiang1, SHI Le-Le2, CAI Zhi-Ying3, JI Peng-Wei4, WANG Chen-Li1, CHEN Bing-Zhi ,1,*, JIANG Yu-Ji ,1,*, XIE Bao-Gui5

1 College of Food Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China

2 Fujian Edible Fungi Technical Popularized Station, Fuzhou, Fujian 350003, China

3 Agriculture Bureau of Longhai City, Longhai, Fujian 363101, China

4 Xinfa Biotechnology Co. Ltd., Zhangzhou, Fujian 363107, China

5 Mycological Research Center, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China

肥胖正成為本世紀(jì)全球最大的健康威脅之一,目前肥胖的高患病率是大眾健康的主要威脅（Rishi et al. 2017）。肥胖引發(fā)的并發(fā)癥包括：高血壓、心腦血管疾病和Ⅱ型糖尿病等（Kopelman 2000）。研究發(fā)現(xiàn),食物中的脂肪在腸道內(nèi)被胰脂肪酶水解成為甘油、脂肪酸后才能被小腸吸收,而后在體內(nèi)重新組合成為脂肪,胰脂肪酶在此過(guò)程中起著重要的作用（Birari & Bhutani 2007）。如能有效控制胰脂肪酶的活性,可以減少食物中脂肪的吸收。近年來(lái),半合成的胰脂肪酶的抑制劑Orlistat已經(jīng)應(yīng)用到臨床,但患者服用后容易產(chǎn)生頭痛、腹瀉等副作用（Garza et al. 2011）,因此,研究一種天然的胰脂肪酶抑制劑在控制肥胖方面具有重要意義。

3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞是目前進(jìn)行脂肪代謝研究中廣泛使用的一種細(xì)胞,其誘導(dǎo)分化成為成熟脂肪細(xì)胞的過(guò)程中,伴隨著細(xì)胞形態(tài)的變化、脂質(zhì)的積累等,能夠充分體現(xiàn)體脂肪細(xì)胞的特色（Haugen et al. 2005）。本研究以黑木耳提取物作用于3T3-L1脂肪細(xì)胞,觀察提取物對(duì)細(xì)胞活性和分化方面的影響,以期為黑木耳提取物在減肥降脂方面的應(yīng)用及相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 材料：黑木耳子實(shí)體由北大荒營(yíng)銷(xiāo)股份有限公司提供,新鮮黑木耳經(jīng)公司清洗曬干,未經(jīng)化學(xué)處理。豬胰脂肪酶：上海源葉生物科技有限公司。阿拉伯樹(shù)膠、異丙醇、二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide,DMSO）（分析純）、4-硝基苯棕櫚酸酯（p-nitrophenyl butyrate,PNPP）、4-硝基苯酚（p-nitrophenyl,PNP）、三羥甲基氨基甲烷脫氧膽酸鹽：上海麥克林生化科技有限公司。細(xì)胞株,3T3-L1前脂肪細(xì)胞,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)。DMEM高糖培養(yǎng)基：Hyclone公司。胰島素、IBMX、地塞米松、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液（PBS 1x）,MTT、青霉素鏈霉素雙抗溶液（100x）：北京Solarbio科技有限公司。胎牛血清：Gibco南美（10270-106）。

1.1.2 儀器與設(shè)備：酶標(biāo)儀,上海巴玖SAF680T;真空冷凍干燥機(jī),松源LGJ-12;-80℃冰箱,美菱超低溫冷凍儲(chǔ)存箱DW-HL528;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠RE52-99;離心機(jī),Thermo Scientific ST40;CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司BPN-50CH;倒置顯微鏡,NIKON TS100-F;超凈工作臺(tái),上海博迅實(shí)業(yè)有限公司BJ-1CD。

1.1.3 溶液的配制：（1）Tris-HCl緩沖液：6.05g Tris置于1L燒杯中,去離子水溶解,加入0.1%阿拉伯樹(shù)膠粉（1g）、0.2%脫氧膽酸鈉（2g）,配置成50mmol/L pH 8.0的Tris-HCl緩沖液。（2）胰脂肪酶溶液：Tris-HCl緩沖液溶解0.25g胰脂肪酶,混勻靜置,5 000r/min離心5min,取上清液,配成1.2mg/mL胰脂肪酶溶液（PPL）,-20℃保存。（3）底物溶液：4-硝基苯棕櫚酸酯（PNPP）20mg溶于5mL異丙醇,再用Tris-HCl緩沖液定容到100mL。（4）DMEM完全培養(yǎng)液：10%胎牛血清+1%雙抗+89% DMEM高糖培養(yǎng)基,4℃保存。（5）誘導(dǎo)分化液Ⅰ：含有10μg/mL胰島素、1μmol/L地塞米松（Dexamethasone,DEX）、0.5mmol/L3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methyl-7H- xanthine,IBMX）的DMEM完全培養(yǎng)液。（6）誘導(dǎo)分化液Ⅱ：10μg/mL胰島素的DMEM完全培養(yǎng)液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑木耳提取物的制備：（1）黑木耳水提物（Auricularia heimuer water extract,AHW）的制備：將黑木耳粉碎過(guò)60目篩,稱(chēng)取14g黑木耳粉,加入一定量的水,在熱水浴中浸提,過(guò)濾收集濾液,將濾液4 000r/min離心10min,取上清液,殘?jiān)儆脽崴?次,合并兩次所得上清液。加入3倍體積的無(wú)水乙醇4℃冰箱靜置過(guò)夜,然后4 000r/min離心10min,棄上清得沉淀,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)到一定的體積,最后進(jìn)行冷凍干燥得黑木耳水提物。（2）黑木耳醇提物（Auricularia heimuer alcohol extract,AHA）的制備：將黑木耳進(jìn)行粉碎過(guò)60目篩,稱(chēng)取14g黑木耳粉,加入一定量的乙醇,超聲處理30min后,再進(jìn)行水浴浸提,抽濾得濾液,濾渣加入乙醇重復(fù)上述操作,合并2次濾液并進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),待乙醇全部揮發(fā)掉,再用適量的水溶解后進(jìn)行冷凍干燥,最后得黑木耳醇提物。

1.2.2 PNP標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確稱(chēng)取4-硝基苯酚（PNP）標(biāo)準(zhǔn)品7.0mg,溶于二硝基亞砜（DMSO）,定容到10mL,制成濃度為5mmol/L母液。用Tris緩沖液稀釋母液,將PNP溶液稀釋至0.05mmol/L、0.25mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L,測(cè)定不同濃度的PNP在405nm下的吸光值。以不同PNP的濃度為橫坐標(biāo),以吸光值為縱坐標(biāo),得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 胰脂肪酶反應(yīng)體系的建立：準(zhǔn)確稱(chēng)取黑木耳提取物0.1g,用10mL的Tris-HCl緩沖液配置成濃度為10mg/mL的提取物溶液（醇提物用0.5mL的DMSO進(jìn)行助溶）。測(cè)定方法參照Liang et al.（2014）的條件,并做調(diào)整。實(shí)驗(yàn)分為空白組、對(duì)照組、樣品空白組和樣品組,各反應(yīng)物劑量見(jiàn)表1,在96孔板中進(jìn)行加樣,每組5個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)條件模擬人體環(huán)境（尚渤程和黎一葦 2009）進(jìn)行設(shè)計(jì),依次加入pH 8.0的Tris-HCl緩沖液、抑制劑溶液和酶溶液,混合均勻,于37℃水浴保溫10min,結(jié)束后,取出96孔板,加入底物溶液,充分混勻,于37℃水浴反應(yīng)20min。由于PNPP在胰脂肪酶的作用下能水解產(chǎn)生PNP,PNP在405nm處有最大吸光值,測(cè)定其吸光值,計(jì)算各樣品對(duì)胰脂肪酶的抑制率及IC50值,計(jì)算公式如下：

抑制率(%)=$lgroup 1-frac{B_{1}-B_{0}}{A_{1}-A_{0}} rgroup$×100

式中：A1為空白組,A0為對(duì)照組,B1為樣品空白組,B0為樣品組。

表1  反應(yīng)體系各溶液加入量

Table 1  Addition quantity of solutions in reaction system

實(shí)驗(yàn)組
Test groupTris-HCl
(μL)PPL
(μL)PNPP
(μL)Inhibitor
(μL)A150501000A010001000B1305010020B080010020

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1.2.4 提取工藝優(yōu)化：為了比較AHA和AHW兩種提取物對(duì)胰脂肪酶的抑制效果,以抑制率為指標(biāo)對(duì)提取工藝進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)。根據(jù)張煥麗等（2016）的研究,AHA單因素試驗(yàn)時(shí),設(shè)計(jì)的浸提溫度為60℃、70℃、80℃、90℃;浸提時(shí)間為0.5h、1h、2h、4h;乙醇濃度為60%、70%、80%、90%;料液比為1:10、1:20、1:30、1:40。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,進(jìn)行4因素3水平正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

根據(jù)陸雯等（2010）的研究,AHW單因素實(shí)驗(yàn)時(shí),浸提溫度為60℃、70℃、80℃、90℃;浸提時(shí)間為0.5h、1h、1.5h、2h;料液比為1:25、1:30、1:35、1:40,根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,進(jìn)行了3因素3水平正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 不同濃度的黑木耳提取物對(duì)胰脂肪酶抑制作用的影響：按照1.2.3確定的反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以黑木耳醇提物和水提物質(zhì)量濃度（800μg/mL、400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL）為橫坐標(biāo),胰脂肪酶的抑制率為縱坐標(biāo),建立回歸曲線,比較兩種提取物不同濃度對(duì)胰脂肪酶抑制率大小的影響并計(jì)算半抑制濃度IC50。

1.2.6 抑制類(lèi)型的確定：根據(jù)上述1.2.5實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,選取抑制率最高的黑木耳醇提物進(jìn)行抑制類(lèi)型的分析。在PNPP底物的濃度為0.1mmol/L和0.3mmol/L的條件下,分別測(cè)定0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL黑木耳醇提物的酶促反應(yīng)速度,以提取物的濃度為橫坐標(biāo),以反應(yīng)速度的倒數(shù)為縱坐標(biāo),按Dixon法作圖,求得抑制常數(shù)Ki。

在黑木耳醇提物溶液濃度為0mg/mL、2mg/mL、8mg/mL時(shí),測(cè)定底物濃度分別為0.38mg/mL、0.76mg/mL、1.13mg/mL、1.89mg/mL的反應(yīng)速度。對(duì)照組以Tris-HCl緩沖液代替提取物溶液,以反應(yīng)速度的倒數(shù)為縱坐標(biāo),底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo),作Lineweaver-Burk圖,確定黑木耳醇提物對(duì)胰脂肪酶的抑制類(lèi)型。

1.2.7 黑木耳醇提物對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞活性的影響：將3T3-L1前脂肪細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種至96孔板中,每孔加180μL DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24h,棄培養(yǎng)液加入新鮮的培養(yǎng)液180μL,同時(shí)加入20μL黑木耳醇提物溶液使最終濃度分別為100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL、1 000μg/mL,繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h,以不加提取物的培養(yǎng)組為對(duì)照,每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔。培養(yǎng)結(jié)束后吸棄培養(yǎng)液,加入新鮮完全培養(yǎng)液180μL,避光加入MTT溶液20μL,培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4h后吸棄培養(yǎng)液和MTT,加入180μL DMSO振蕩10min,充分溶解后在570nm下測(cè)定吸光值。細(xì)胞活性計(jì)算公式：細(xì)胞活性(%)=藥物處理組OD值/對(duì)照組OD值×100。

1.2.8 黑木耳醇提物抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的測(cè)定：根據(jù)細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,選擇對(duì)細(xì)胞活性無(wú)影響的提取物濃度進(jìn)行細(xì)胞分化抑制實(shí)驗(yàn)。誘導(dǎo)方法采用經(jīng)典的“雞尾酒”誘導(dǎo)法（Vishwanath et al. 2013）。將3T3-L1前脂肪細(xì)胞以3×104個(gè)/孔接種至24孔板中,用DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞,待細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿至80%-90%以后,接觸抑制2d,即細(xì)胞退出生長(zhǎng)周期,加入誘導(dǎo)分化液Ⅰ,再加入提取物使其濃度為50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL、1 000μg/mL,同時(shí)以不加黑木耳醇提物,加入相應(yīng)體積DMEM完全培養(yǎng)液作為對(duì)照組,誘導(dǎo)過(guò)程中使各孔的提取物濃度保持不變。每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)重復(fù)孔,剛加入誘導(dǎo)液Ⅰ時(shí)為誘導(dǎo)分化D0,培養(yǎng)2d后換誘導(dǎo)分化液Ⅱ（D2）,2d后換DMEM完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)（D4）,以后每2d換一次培養(yǎng)液,分化至D10結(jié)束。用油紅O染色試劑盒進(jìn)行染色,對(duì)染色后的細(xì)胞拍照。隨后每孔加入1mL的異丙醇進(jìn)行甘油三酯的萃取,30min后在510nm下測(cè)定萃取液的吸光值,得分化脂質(zhì)積累量。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,各組測(cè)定值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間差異按方差分析進(jìn)行檢驗(yàn),并用最小顯著差法檢驗(yàn)作兩兩比較,以P<0.05為顯著差異,以P<0.01為極顯著差異。做圖軟件使用origin8.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 PNP的標(biāo)準(zhǔn)曲線

將PNP稀釋成不同濃度,利用酶標(biāo)儀在405nm處測(cè)定吸光值,以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）,建立回歸方程為y=8.3623x-0.0087,R2=0.9998,說(shuō)明兩者在0.05-0.3mmol/L之間有良好的線性關(guān)系。

圖1

圖1  PNP與吸光值的關(guān)系

Fig. 1  The relationship between PNP and absorbance.

2.2 黑木耳醇提單因素試驗(yàn)

AHA提取工藝單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,隨著乙醇濃度的增大,對(duì)胰脂肪酶的抑制率呈現(xiàn)逐步上升的趨勢(shì),乙醇濃度為70%、80%、90%時(shí)的抑制率均顯著高于乙醇濃度為60%時(shí)的抑制率,乙醇濃度80%與90%的抑制率較高,但兩者之間無(wú)明顯差異;隨著提取溫度的升高,AHA對(duì)胰脂肪酶的抑制率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),提取溫度80℃、90℃提取物的抑制率顯著高于60℃提取物的抑制率,但兩者間的抑制率無(wú)顯著差異;隨著料液比的增加,提取物對(duì)胰脂肪酶的抑制率逐漸減少,料液比1:10時(shí)抑制率最高,各組的抑制率沒(méi)有顯著性差異;提取時(shí)間2h和4h的抑制率顯著高于0.5h和1h的抑制率,2h與4h之間的抑制率無(wú)顯著性差異,因此,最適提取條件為乙醇濃度80%,溫度80℃,料液比1:10,時(shí)間2h（圖2）。

圖2

圖2  AHA提取工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

其中*P<0.05;**P<0.01

Fig. 2  Single factor experiment of extraction process of Auricularia heimuer alcohol extract (AHA).

*P<0.05; **P<0.01. The same below.

2.3 黑木耳醇提正交實(shí)驗(yàn)

綜合AHA單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取正交實(shí)驗(yàn)的條件為乙醇濃度：70%、80%、90%;提取溫度：70℃、80℃、90℃;料液比：1:30、1:20、1:10;提取時(shí)間：1h、2h、4h;對(duì)提取工藝進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)優(yōu)化。由極差分析可知影響胰脂肪酶抑制率的因素順序是A>C>D>B,即提取溫度>提取時(shí)間>料液比>乙醇濃度,并通過(guò)方差分析可得AHA對(duì)胰脂肪酶抑制率的最優(yōu)組合為：提取溫度70℃、提取時(shí)間1h、乙醇濃度90%、料液比1:20。通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)得到該組合的抑制率達(dá)到63.21%,與其他的因素組合相比達(dá)到最高抑制率,證明此條件下為AHA抑制胰脂肪酶的最優(yōu)組合（表2）。

表2  AHA提取工藝正交試驗(yàn)

Table 2  Orthogonal experiments of AHA extraction process

試驗(yàn)號(hào)
Test number因素Factor抑制率
Inhibition rate of pancreatic
lipase activity of the extract (%)A-提取溫度
Extraction
temperature (°C)B-乙醇濃度
Alcohol
concentration (V/V)C-提取時(shí)間
Extraction
duration (h)D-料液比
Solid material
-liquid ratio (g/mL)1707011:3049.46±0.232708021:2050.40±0.643709041:1040.74±1.314807021:1033.03±0.955808041:3031.05±0.976809011:2050.77±2.317907041:2033.80±1.678908011:1034.16±1.649909021:3043.32±0.89k1140.60116.29134.39123.83k2114.85115.61126.75134.97k3111.28134.83105.59107.93K146.8638.7644.7941.28K238.2838.5442.2544.99K337.0944.9435.2035.98R9.776.49.599.01主次順序RA>RC>RD>RBPrimary and secondary sequence最優(yōu)組合A1B3C1D2Optimal combination

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2.4 黑木耳水提單因素實(shí)驗(yàn)

AHW提取工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果表明,料液比低于1:30時(shí),隨著料液比的增加,抑制率有上升趨勢(shì),料液比1:30與1:25的抑制率無(wú)顯著性差異,且與料液比1:40、1:35相比呈顯著性差異;隨著溫度的升高,AHW對(duì)胰脂肪酶的抑制率有上升趨勢(shì),溫度80℃、90℃的抑制率較高,與60℃相比呈顯著性差異;時(shí)間分析表明1、1.5、2h 3個(gè)時(shí)間的胰脂肪酶抑制率無(wú)顯著性差異,與提取時(shí)間為0.5h的AHW相比三者抑制率較高且有顯著性差異,因此,最適提取條件為料液比1:35、提取溫度80℃、時(shí)間1h（圖3）。

圖3

圖3  AHW提取工藝的單因素實(shí)驗(yàn)

Fig. 3  Single factor experiment of extraction process of Auricularia heimuer water extract (AHW). *P<0.05; **P<0.01.

2.5 黑木耳水提正交實(shí)驗(yàn)

綜合AHW單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,選取正交實(shí)驗(yàn)的條件為提取溫度：70℃、80℃、90℃;料液比：1:30、1:35、1:40;提取時(shí)間：1h、1.5h、2h;對(duì)提取工藝進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)優(yōu)化。由極差分析可知影響胰脂肪酶抑制率的因素順序是B>A>C,即提取溫度>料液比>提取時(shí)間,并通過(guò)方差分析可得AHW對(duì)胰脂肪酶抑制率的最優(yōu)組合為：提取溫度70℃、提取時(shí)間2h、料液比1:40。通過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)得到該組合的抑制率達(dá)到54.28%,與其他的因素組合相比達(dá)到最高抑制率,證明此條件下為AHW抑制胰脂肪酶的最優(yōu)組合（表3）。

表3  AHW提取工藝正交試驗(yàn)的優(yōu)化

Table 3  Orthogonal experiments of AHW extraction process

試驗(yàn)號(hào)
Test number因素Factor抑制率
Inhibition rate of pancreatic lipase
activity of the extract (%)料液比
Solid material
-liquid ratio (g/mL)B-提取溫度
Extraction
temperature (°C)C-提取時(shí)間
Extraction
duration (h)11:3070145.90±1.32221:30801.528.53±2.34131:3090229.67±0.13941:35701.537.67±0.94351:3580245.56±2.13661:3590133.01±1.34571:4070243.27±0.29781:4080133.81±3.00191:40901.539.59±1.064k1104.1126.84112.72k2116.24107.9105.79k3116.67102.27118.5K134.742.2837.57K238.7535.9735.26K338.8934.0939.5R4.198.193.93主次順序RB>RA>RCPrimary and secondary sequence最優(yōu)組合A3B1C3Optimal combination

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2.6 不同濃度黑木耳提取物對(duì)胰脂肪酶抑制作用的影響及比較

隨著黑木耳提取物的濃度的增大,對(duì)胰脂肪酶的抑制率呈增加趨勢(shì),這說(shuō)明提取物對(duì)胰脂肪酶有一定的抑制作用,當(dāng)提取物濃度達(dá)到800μg/mL時(shí),抑制率的增加趨勢(shì)逐漸處于平緩。通過(guò)觀察可得AHA的抑制率始終大于AHW,并通過(guò)計(jì)算,得出AHA的IC50=850.59μg/mL,AHW的IC50=681.56μg/mL,進(jìn)一步驗(yàn)證AHA對(duì)胰脂肪酶的抑制率大于AHW對(duì)胰脂肪酶的抑制率（圖4）。

圖4

圖4  黑木耳提取物質(zhì)量濃度對(duì)抑制作用的影響

Fig. 4  Effects of AHFB extract concentration on inhibition rate of pancreatic lipase activity.

2.7 黑木耳醇提物對(duì)胰脂肪酶的抑制作用類(lèi)型

由于AHA對(duì)胰脂肪酶的抑制作用強(qiáng)于AHW,故以AHA為抑制劑研究其抑制作用類(lèi)型。兩條直線相交于（-4.69,0）（圖5）,故抑制常數(shù)Ki=4.69mg/mL。三條直線相交于一點(diǎn)（圖6）,AHA的加入并未改變酶促反應(yīng)Km,而Vmax則有所降低,結(jié)合Dixon圖和Lineweaver-Burk圖的特征可以看出AHA對(duì)胰脂肪酶的抑制類(lèi)型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。黑木耳醇提物和底物可以同時(shí)與胰脂肪酶結(jié)合,兩者沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)性。

圖5

圖5  AHA對(duì)胰脂肪酶抑制作用的Dixon圖

Fig. 5  Dixon picture of inhibitory effect of AHA on pancreatic lipase activity.

圖6

圖6  AHA對(duì)胰脂肪酶抑制作用的Lineweaver-Burk圖

Fig. 6  Lineweaver-Burk plot of inhibitory effect of AHA on pancreatic lipase activity.

2.8 黑木耳醇提物對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞活性的影響

不同濃度的AHA在24h、48h、72h下對(duì)3T3-L1細(xì)胞活性的影響,與對(duì)照組相比,10個(gè)濃度下的AHA在3個(gè)不同時(shí)間下對(duì)細(xì)胞的活性無(wú)顯著性差異,證明AHA對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性（圖7）。

圖7

圖7  不同濃度的AHA對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞活性的影響

Fig. 7  Effects of different AHA concentrations on the viability of 3T3-L1 preadipocytes.

2.9 黑木耳醇提物對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響

細(xì)胞油紅O染色結(jié)果見(jiàn)圖8、圖9。隨著AHA的濃度增大,對(duì)細(xì)胞脂質(zhì)積累抑制作用增大,即抑制前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞。當(dāng)AHA的濃度達(dá)到200μg/mL時(shí),處理細(xì)胞脂質(zhì)積累量與空白組相比顯著性差異（P<0.05）,當(dāng)AHA的濃度達(dá)到400μg/mL時(shí),處理細(xì)胞脂質(zhì)積累量與空白組相比呈極顯著性差異（P<0.01）。且隨著AHA的濃度增大對(duì)細(xì)胞的分化抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。

圖8

圖8  3T3-L1前脂肪細(xì)胞各試驗(yàn)組油紅O染色后照片（400×）

A：空白組;B：AHA濃度50μg/mL;C：AHA濃度200μg/mL;D：AHA濃度400μg/mL;E：AHA濃度600μg/mL;F：AHA濃度800μg/mL

Fig. 8  3T3-L1 preadipocytes of experimental groups stained by oil red O (400×).

A: Blank control group; B: 50μg/mL AHA; C: 200μg/mL AHA; D: 400μg/mL AHA; E: 600μg/mL AHA; F: 800μg/mL AHA.

圖9

圖9  不同濃度AHA處理對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞脂質(zhì)積累量的影響

Fig. 9  Effects of different concentrations of AHA on lipid accumulation in 3T3-L1 preadipocytes.

3 討論

肥胖是一種能量攝入和支出之間不平衡引起的慢性代謝紊亂,曾經(jīng)被認(rèn)為只存在于一些發(fā)達(dá)國(guó)家,但隨著經(jīng)濟(jì)全球化的發(fā)展,這些問(wèn)題現(xiàn)在普遍出現(xiàn)在低收入和中等收入國(guó)家,尤其是在大城市當(dāng)中的發(fā)病率較高（Damsgaard et al. 2016）。

本研究對(duì)黑木耳水提物和醇提物的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化,并比較了黑木耳醇提物、水提物對(duì)胰脂肪酶的不同抑制效果,結(jié)果表明：黑木耳醇提物對(duì)胰脂肪酶活性的抑制性較強(qiáng),對(duì)胰脂肪酶的抑制類(lèi)型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。黑木耳醇提物對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞生長(zhǎng)活性無(wú)明顯的影響,并能夠顯著地降低細(xì)胞分化過(guò)程中的脂質(zhì)積累量,抑制細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞,說(shuō)明醇提物在肥胖治療方面有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

[1]

Birari RB, Bhutani KK , 2007.

Pancreatic lipase inhibitors from natural sources: unexplored potential

Drug Discovery Today, 12(19-20):879-889

[本文引用: 1]

[2]

Cheung PC , 1996.

The hypocholesterolemic effect of two edible mushrooms: Auricularia auricula (tree-ear) and Tremella fuciformis (white jelly-leaf) in hypercholesterolemic rats

Nutrition Research, 16(10):1721-1725

[本文引用: 1]

[3]

Damsgaard CT, Michaelsen KF, Molbo D , 2016.

Trends in adult body-mass index in 200 countries from 1975 to 2014: a pooled analysis of 1698 population-based measurement studies with 19.2 million participants

International Journal of Epidemiology, 46(5):1421-1432

[本文引用: 1]

[4]

Fang YJ, Xia DZ, Wang SW, Ji SS , 2015.

Study on anti-obese and hypolipidemic effects of total flavonoids from Alpinia Officinarum Hance in rats with nutritive obesity combined with hyperlipidemia

China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy, 30(4):2097-2910 (in Chinese)

[5]

Garza AD, Milagro FI, Boque N, Campion J, Martinez JF , 2011.

Natural inhibitors of pancreatic lipase as new players in obesity treatment

Planta Medica, 77(8):773-785

[本文引用: 1]

[6]

Haugen F, Zahid N, Dalen KT, Hollung K, Nebb HI, Drevon CA , 2005.

Resistin expression in 3T3-L1 adipocytes is reduced by arachidonic acid

Journal of Lipid Research, 46(1):143-153

[本文引用: 1]

[7]

Hua B , 2015.

Study the antihyperlipidemic effect of the licorice flavonids and related mechanism.

Master Thesis, Ningxia Medical University, Yinchuan. 1-56 (in Chinese)

[8]

Kopelman PG , 2000.

Obesity as a medical problem

Nature, 404(6778):635-643

[本文引用: 1]

[9]

Li XT, Gao MB , 2004.

Effects of Auricularia auricula polysaccharide on scavenging reactive oxygen species and protecting mitochondria

Food Science, 2004(1):171-173 (in Chinese)

[10]

Lian LN, Meng XJ, Liu Y, Ji SJ, Mei XG , 2006.

Preventive and weight loss effects of tea polyphenols on nutritional obesity in mice

Modern Agricultural Science and Technology, 2006(6):75-76 (in Chinese)

[11]

Liang LF, Wang T, Cai YS, He WF, Sun P, Li YF, Huang Q, Wang HY, Guo YW , 2014.

Brominated polyunsaturated lipids from the Chinese sponge Xestospongia testudinaria as a new class of pancreatic lipase inhibitors

European Journal of Medicinal Chemistry, 2014(79):290-297

[本文引用: 1]

[12]

Liu YC, Liu YH , 2005.

Nutritional and health care function and deep processing of Auricularia auricula

Edible Fungi of China, 2005(6):51-52 (in Chinese)

[13]

Lu W, Cai ZY, Xian Q, Zhang YJ , 2010.

Optimization of extraction conditions of Auricularia auricula polysaccharides

China Food Additives, 2010(6):99-102 (in Chinese)

[14]

Murcia MA, Martinez-Tome M, Jimenez AM, Vera A, Honrubia M, Parras P , 2002.

Antioxidant activity of edible fungi (truffles and mushrooms): losses during industrial processing

Journal of Food Protection, 65(10):1614-1622

[本文引用: 1]

[15]

Shang BC, Li YW , 2009.

Common pH value in human body

Biology Teaching, 34(12):66 (in Chinese)

[16]

Song CY, Huang JY, Feng JF, Tan WY , 2013.

A review of biological activities of bioflavones

Chemical Engineering & Equipment, 2013(4):128-130 (in Chinese)

[17]

Vishwanath D, Srinivasan H, Patil MS, Seetarama S, Agrawal SK, Dixit MN, Dhar K , 2013.

Novel method to differentiate 3T3-L1 cells in vitro to produce highly sensitive adipocytes for a GLUT4 mediated glucose uptake using fluorescent glucose analog

Journal of Cell Communication and Signaling, 7(2):129-140

[本文引用: 1]

[18]

Wu F, Dai YC , 2015.

Notes on the nomenclature of the Auricularia auricula-judae complex

Mycosystema, 34(4):604-611 (in Chinese)

[19]

Wu F, Yuan Y, He SH, Bandara AR, Hyde KD, Malysheva VF, Li DW, Dai YC , 2015.

Global diversity and taxonomy of the Auricularia auricula-judae complex (Auriculariales, Basidiomycota)

Mycological Progress, 14(10):95

[本文引用: 1]

[20]

Wu F, Yuan Y, Malysheva V, Du P, Dai YC , 2014.

Species clarification of the most important and cultivated Auricularia mushroom “heimuer”: evidence from morphological and molecular data

Phytotaxa, 186(5):241-253

[本文引用: 1]

[21]

Wu F, Zhou LW, Yang ZL, Bau T, Li TH, Dai YC , 2019.

Resource diversity of Chinese macrofungi: edible, medicinal and poisonous species

Fungal Diversity, 98(1):1-76

[本文引用: 1]

[22]

Yang XJ , 2014.

Study on antioxidation and weight loss of phenolic compounds. Master Thesis,

Peking Union Medical College, Beijing. 1-74 (in Chinese)

[23]

Zhang HL, Li FS, Ma H, Cui XT, Wang X, Liu D, Zhai H, Xiao ZG , 2016,

Process of ultrasound- assisted hot water extraction of Auricularia auricula polysaccharides and flavonoids

Farm Products Processing, 2016(9):1-4 (in Chinese)

[24]

Zhang PQ, Kong XH, Liu JN, Zhang JC, Yu DS , 2010.

Extraction and content determination of total flavonoids from Auricularia auricula

Edible Fungi, 32(4):71-72 (in Chinese)

[25]

Zhou GH, Yu GP , 2005.

Effect study of Auricularia polysaccharide on reducing blood lipid

Modern Food Science and Technology, 2005(1):46-48 (in Chinese)

[26]

Zhou HP, Chen QH, Wang SR , 1989.

Anti-aging effect of the polysaccharides from Auricularia auricula and Tremella fuciformis

Journal of China Pharmaceutical University, 1989(5):303-306 (in Chinese)

[27]

方月娟, 夏道宗, 王思為, 季市市 , 2015.

高良姜總黃酮對(duì)營(yíng)養(yǎng)性肥胖合并高脂血癥大鼠減肥降脂作用研究

中華中醫(yī)藥雜志, 30(8):2097-2910

[本文引用: 1]

[28]

華冰 , 2015.

甘草總黃酮的降血脂作用及機(jī)制的研究

寧夏醫(yī)科大學(xué)碩士論文,銀川. 1-56

[本文引用: 1]

[29]

李興泰, 高明波 , 2004.

黑木耳多糖清除活性氧及保護(hù)線粒體

食品科學(xué), 2004(1):171-173

[本文引用: 1]

[30]

連麗娜, 孟憲軍, 劉燕, 紀(jì)淑娟, 梅興國(guó) , 2006.

茶多酚對(duì)小鼠營(yíng)養(yǎng)性肥胖的預(yù)防及減肥作用研究

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2006(6):75-76

[本文引用: 1]

[31]

劉永昶, 劉永宏 , 2005.

黑木耳的營(yíng)養(yǎng)保健作用及深加工

中國(guó)食用菌, 2005(6):51-52

[本文引用: 1]

[32]

陸雯, 蔡振優(yōu), 鮮喬, 張擁軍 , 2010.

黑木耳多糖提取工藝條件的研究

中國(guó)食品添加劑, 2010(6):99-102

[本文引用: 1]

[33]

尚渤程, 黎一葦 , 2009.

人體常見(jiàn)的pH值

生物學(xué)教學(xué), 34(12):66

[本文引用: 1]

[34]

宋成英, 黃俊懿, 封加福, 談文毅 , 2013.

對(duì)生物黃酮生物活性的綜述

化學(xué)工程與裝備, 2013(4):128-130

[本文引用: 1]

[35]

吳芳, 戴玉成 , 2015.

黑木耳復(fù)合群中種類(lèi)學(xué)名說(shuō)明

菌物學(xué)報(bào), 2015(34):604-611

[本文引用: 1]

[36]

楊曉姣 , 2014.

酚類(lèi)化合物抗氧化及減肥作用的研究

北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院碩士論文,北京. 1-74

[本文引用: 1]

[37]

張煥麗, 李凡姝, 馬慧, 崔曉彤, 王霞, 劉娣, 翟歡, 肖志剛 , 2016.

超聲波輔助熱水浸提黑木耳多糖和黃酮的研究

農(nóng)產(chǎn)品加工, 2016(18):1-4

[本文引用: 1]

[38]

張丕奇, 孔祥輝, 劉佳寧, 張介馳, 于德水 , 2010.

黑木耳中總黃酮提取及含量測(cè)定

食用菌, 32(4):71-72

[本文引用: 1]

[39]

周?chē)?guó)華, 于國(guó)萍 , 2005.

黑木耳多糖降血脂作用的研究

現(xiàn)代食品科技, 2005(1):46-48

[本文引用: 1]

[40]

周慧萍, 陳瓊?cè)A, 王淑如 , 1989.

黑木耳多糖和銀耳多糖的抗衰老作用

中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 1989(5):303-306

[本文引用: 1]

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網(wǎng)址: 黑木耳中抑制胰脂肪酶活性物質(zhì)的提取工藝及體外抑制效果 http://m.u1s5d6.cn/newsview626948.html