本發(fā)明涉及一種測(cè)定方法，具體涉及一種抑制麥芽糖化過(guò)程中脂肪氧合酶活性的測(cè)定方法。

背景技術(shù)：

脂肪氧合酶(Lipoxygenase，LOX)屬于氧化還原酶類，是一種蛋白酶內(nèi)含非血紅素鐵、對(duì)于具有順，順-戊二烯構(gòu)型的多不飽和脂肪酸可以發(fā)生特定的催化作用、產(chǎn)物是一種具有共軛雙鍵的氫過(guò)氧化合物。脂肪氧合酶廣泛存在于動(dòng)植物界，研究發(fā)現(xiàn)在大麥麥芽中同時(shí)存在LOX1酶和LOX2酶兩種類型的同工酶，LOX1酶主要存在于大麥的胚芽中，而LOX2酶是在大麥發(fā)芽后才生成的。

研究認(rèn)為L(zhǎng)OX1在麥芽糖化過(guò)程中，作用于不飽和脂肪酸9-HPOD(9-脂肪酸氫過(guò)氧化物)，然后在裂解酶的作用下最終生成反-2-壬烯醛(T2N)；LOX2作用于不飽和脂肪酸生成13-HPOD(13-脂肪酸氫過(guò)氧化物)，然后在裂解酶的作用下生成己醛。LOX酶作為脂質(zhì)氧化途徑的關(guān)鍵性酶和限速性酶，已經(jīng)成為全球啤酒研究的焦點(diǎn)。

然而，對(duì)于LOX酶抑制劑的研究表明，除了已研究清楚的四種抑制機(jī)理-與底物競(jìng)爭(zhēng)酶的活性部位、螯合作用、還原作用和競(jìng)爭(zhēng)脂質(zhì)自由基外，尚還有一些抑制機(jī)理并未研究清楚。

綜上，基于脂肪氧合酶在脂質(zhì)氧化途徑中的關(guān)鍵性以及其抑制機(jī)理的尚不完全清楚性，如何能夠有效地控制脂肪氧合酶的活性，進(jìn)而控制啤酒老化以提高啤酒的可飲性，將是本領(lǐng)域研究的重要課題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種抑制麥芽糖化過(guò)程中脂肪氧合酶活性的測(cè)定方法，能夠有效地控制脂肪氧合酶的活性，有利于控制啤酒老化，提高啤酒的可飲性。

本發(fā)明提供了一種抑制麥芽糖化過(guò)程中脂肪氧合酶活性的測(cè)定方法，包括如下步驟：

將麥芽粉加入到水中，按照協(xié)定麥汁法對(duì)其進(jìn)行糖化；

移取糖化過(guò)程中不同反應(yīng)時(shí)間段的發(fā)酵液，離心取上清液，得到粗脂肪氧合酶；

向磷酸鹽緩沖液中依次加入亞油酸、抑制劑和粗脂肪氧合酶，得到抑制劑抑制的粗脂肪氧合酶；

以含有亞油酸、抑制劑的磷酸鹽緩沖液作為空白，測(cè)定抑制劑抑制的粗脂肪氧合酶在不同時(shí)間段的吸光度，得到抑制劑作用的脂肪氧合酶活性。

作為可選方案，移取糖化過(guò)程中不同反應(yīng)時(shí)間段的發(fā)酵液50-100ml，10000-14000rpm離心8-12分鐘，移取1-2ml上清液，得到粗脂肪氧合酶。

作為優(yōu)選方案，向磷酸鹽緩沖液中依次加入的亞油酸、抑制劑和粗脂肪氧合酶的體積比為1:1:1-1:3:1。

作為優(yōu)選方案，所述抑制劑選自奎諾二甲基丙烯酸酯、去甲二氫愈創(chuàng)木酸和水楊羥肟酸中的至少一種。

作為可選方案，測(cè)定的吸光度的范圍為220nm-240nm。

作為可選方案，糖化過(guò)程中不同反應(yīng)時(shí)間段分為糖化過(guò)程的早期、中期、末期反應(yīng)時(shí)間段，其中，所述早期為反應(yīng)開(kāi)始0分鐘時(shí)，所述中期為反應(yīng)開(kāi)始0-15分鐘時(shí)，所述末期為反應(yīng)開(kāi)始15-30分鐘時(shí)。

本發(fā)明提供了一種抑制麥芽糖化過(guò)程中脂肪氧合酶活性的測(cè)定方法，相比于現(xiàn)有方法而言，本申請(qǐng)所提供的方法主要是利用化學(xué)試劑來(lái)測(cè)定麥芽糖化過(guò)程中受到抑制劑作用的脂肪氧合酶活性。相對(duì)于利用轉(zhuǎn)基因手段，更易于操作，且不會(huì)受到轉(zhuǎn)基因食品的影響，更容易被人們接受。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例所提供的不添加抑制劑的脂肪氧合酶吸光度變化圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例所提供的添加喹諾二甲基丙烯酸酯后脂肪氧合酶吸光度變化圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例所提供的添加水楊羥肟酸后脂肪氧合酶吸光度變化圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例所提供的添加去甲二氫愈創(chuàng)木酸后脂肪氧合酶吸光度變化圖。

具體實(shí)施方式

下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種抑制麥芽糖化過(guò)程中脂肪氧合酶活性的測(cè)定方法，包括如下步驟：

S1：將麥芽粉加入到水中，按照協(xié)定麥汁法對(duì)其進(jìn)行糖化；

S2：移取糖化過(guò)程中不同反應(yīng)時(shí)間段的發(fā)酵液，離心取上清液，得到粗脂肪氧合酶。

本步驟主要是為了獲得可用于后續(xù)處理分析的粗脂肪氧合酶，在本步驟中，提取了不同反應(yīng)時(shí)間段的糖化過(guò)程中的發(fā)酵液以進(jìn)行平行性分析，從而有利于明確獲知在哪個(gè)反應(yīng)時(shí)間段，抑制劑對(duì)脂肪氧合酶作用更強(qiáng)。

S3：向磷酸鹽緩沖液中依次加入亞油酸、抑制劑和粗脂肪氧合酶，得到抑制劑抑制的粗脂肪氧合酶。

在本步驟中，對(duì)上述得到的粗脂肪氧合酶進(jìn)行進(jìn)一步處理，主要是通過(guò)向磷酸鹽緩沖體系中依次加入亞油酸、抑制劑與粗脂肪氧合酶。其中，加入亞油酸是為了給粗脂肪氧合酶提供反應(yīng)底物，加入抑制劑是為了抑制脂肪氧合酶活性。

S4：以含有亞油酸、抑制劑的磷酸鹽緩沖液作為空白，測(cè)定抑制劑抑制的粗脂肪氧合酶在不同時(shí)間段的吸光度，得到抑制劑作用的脂肪氧合酶活性。

在本步驟中，根據(jù)吸光度的變化，從而確定不同抑制劑對(duì)脂肪氧合酶的抑制程度。

在一可選實(shí)施例中，移取糖化的不同反應(yīng)時(shí)間段的發(fā)酵液50-100ml，10000-14000rpm離心8-12分鐘，移取1-2ml離心后得到的上清液，得到粗脂肪氧合酶。在本實(shí)施例中，主要是對(duì)發(fā)酵液的處理，具體為獲得粗脂肪氧合酶，以用于后續(xù)的進(jìn)一步處理中。可以理解的是，本實(shí)施例并不局限于上述所列舉的具體參數(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可依據(jù)實(shí)際反應(yīng)情況進(jìn)行調(diào)整，例如對(duì)于發(fā)酵液的體積還可以為60、70、80、90ml、離心的轉(zhuǎn)速還可以為11000、12000、13000rpm，離心時(shí)間還可以為9、10、11分鐘等，可移取1、1.5、2ml上清液，只要能夠獲得有利于后續(xù)分析的粗脂肪氧合酶干燥粉末即可。

在一優(yōu)選實(shí)施例中，作為優(yōu)選方案，向磷酸鹽緩沖液中依次加入亞油酸、抑制劑和粗脂肪氧合酶的體積比為1:1:1-1:3:1。在本實(shí)施例中，說(shuō)明了加入亞油酸、抑制劑、粗脂肪氧合酶的具體體積以及相應(yīng)的具體步驟?？梢岳斫獾氖?，本實(shí)施例中的亞油酸、抑制劑和粗脂肪氧合酶的體積比還可以為1:2.5:1、1:2:1、1:1.5:1等，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實(shí)際反應(yīng)情況進(jìn)行調(diào)整。

在一優(yōu)選實(shí)施例中，所述抑制劑選自奎諾二甲基丙烯酸酯、去甲二氫愈創(chuàng)木酸、水楊羥肟酸中的至少一種?？梢岳斫獾氖牵緦?shí)施例并不局限于上述所列舉的抑制劑，還可以是本領(lǐng)域所常用的其他類似抑制劑。

在一優(yōu)選實(shí)施例中，測(cè)定的吸光度的范圍為220nm-240nm。本實(shí)施例具體說(shuō)明了測(cè)定脂肪酶活性的條件，所選用的條件參數(shù)為分析脂肪酶活性的優(yōu)化參數(shù)，所使用的分光光度計(jì)為Cary-100紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)。

在一可選實(shí)施例中，糖化過(guò)程中不同反應(yīng)時(shí)間段分為糖化過(guò)程的早期、中期、末期反應(yīng)時(shí)間段，其中，所述早期為反應(yīng)開(kāi)始0分鐘時(shí)，所述中期為反應(yīng)開(kāi)始0-15分鐘時(shí)，所述末期為反應(yīng)開(kāi)始15-30分鐘時(shí)。在本實(shí)施例中，對(duì)糖化過(guò)程中的不同反應(yīng)時(shí)間段進(jìn)行了限定，具體的，可根據(jù)整個(gè)反應(yīng)周期、以及不同反應(yīng)階段中抑制劑對(duì)粗脂肪氧合酶作用的程度確定時(shí)間段的劃分，例如可劃分為反應(yīng)沒(méi)有開(kāi)始抑制的階段、反應(yīng)進(jìn)行了一段時(shí)間已部分抑制的階段、反應(yīng)后期已全部抑制的階段，根據(jù)上述階段，可將時(shí)間段劃分為0分鐘、0-15分鐘、15-30分鐘?？梢岳斫獾氖?，在不同的反應(yīng)條件、外界因素影響下，反應(yīng)程度會(huì)有所不同，在這種情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)上述劃分依據(jù)優(yōu)化時(shí)間段的劃分，以清楚明確哪個(gè)階段對(duì)粗脂肪氧合酶作用的抑制性更強(qiáng)。

為了更清楚詳細(xì)地介紹本發(fā)明實(shí)施例所提供的抑制麥芽糖化過(guò)程中粗脂肪氧合酶活性的測(cè)定方法，現(xiàn)將結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1

將5g麥芽粉加入20mL蒸餾水，于47℃下按照協(xié)定麥汁法對(duì)其進(jìn)行糖化；在40℃下，分別移取糖化過(guò)程中早期0分鐘、中期0-15分鐘、末期15-30分鐘的發(fā)酵液2ml，12000rpm、4℃條件下離心8分鐘，取1mL上清液，制得粗脂肪氧合酶；按照表1的量在磷酸鹽緩沖液中先后加入亞油酸、抑制劑、粗脂肪氧合酶；將磷酸鹽緩沖液、亞油酸底物、抑制劑混合物作為空白，調(diào)零后加入50μL的粗脂肪氧合酶提取液，在235nm下測(cè)量吸光度，分別計(jì)時(shí)1分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘，得到抑制劑作用的粗脂肪氧合酶的吸光度變化曲線，以對(duì)照A組為例，參見(jiàn)圖1-4。

表1 測(cè)試中的各種試劑加入量

由對(duì)比文件A組(圖1-4)、以及對(duì)比文件B組和C組的吸光度值變化規(guī)律可以看出，三種抑制劑對(duì)脂肪氧合酶的活性均起到了一定的抑制作用，其中，水楊羥肟酸與去甲二氫愈創(chuàng)木酸的抑制作用明顯優(yōu)于奎諾二甲基丙烯酸酯。

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