利用斑馬魚評價供試品舒緩功效

【實驗原理】

暴露于生活環(huán)境中的皮膚，接觸到有毒有害物質(zhì)后可能引起一定程度的皮膚炎癥，出現(xiàn)皮膚紅腫、瘙癢等現(xiàn)象。一些醫(yī)美類化妝品除具有常規(guī)護膚功效外還能起到舒緩作用。通過斑馬魚技術(shù)能有效評價供試品舒緩功效。

1、化妝品對皮膚的刺激表型主要表現(xiàn)為皮膚炎癥，炎癥早期主要表現(xiàn)為毛細(xì)血管擴張、通透性亢進和水腫。十二烷基磺酸鈉（SLS）是人體皮膚刺激物模型斑貼試驗常見的陽性對照物，SLS刺激后能誘發(fā)表皮炎癥細(xì)胞浸潤，刺激物進入斑馬魚體內(nèi)，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，中性粒細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答，向皮膚表皮遷移并聚集。

2、TNF-α在機體受到刺激時會大量產(chǎn)生,主要來自于活化的巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞；IL-6 能夠促進中性粒細(xì)胞功能上調(diào)，促進和調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、黏附分子以及一氧化氮等炎癥介質(zhì)分泌；IL-8 由單核細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌生成，炎癥發(fā)生時其水平迅速升高。IL-1 在炎癥反應(yīng)中傳遞信息、激活以及調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞、增殖與分化炎癥其關(guān)鍵作用。若供試品具有能夠降低TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8 等炎癥因子水平的作用，則說明其具有舒緩的功效。

3、肥大細(xì)胞是類過敏反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，激活的肥大細(xì)胞數(shù)量與過敏程度相關(guān)，激活的肥大細(xì)胞越多，過敏程度越嚴(yán)重。類胰蛋白酶(Tryptase )是肥大細(xì)胞內(nèi)預(yù)先合成的中性蛋白酶，是含量最多的介質(zhì)，在肥大細(xì)胞中的儲存和表達(dá)有高度的選擇性。肥大細(xì)胞脫顆粒后，類胰蛋白酶會轉(zhuǎn)化成具有活性的構(gòu)象并被釋放到細(xì)胞外，Tryptase可作為肥大細(xì)胞脫顆粒的標(biāo)志。

4、斑馬魚受到疼痛時會產(chǎn)生運動軌跡上的變化。通過測定斑馬魚運動軌跡作為傷害性感受閾的測量指標(biāo)。

【實驗方法】

將受測試斑馬魚分成三組，分別是正常對照組、模型對照組和供試品組。正常對照組不做處理，模型對照組僅用SLS處理，供試品組在用SLS的同時添加受試化妝品。孵育一段時間后：

1、將斑馬魚整體放到熒光顯微鏡下拍照，統(tǒng)計皮膚表面中性粒細(xì)胞數(shù)量

2、利用Q-PCR檢測IL-6等基因相對表達(dá)量

3、利用酶標(biāo)儀檢測各組吸光度值（OD值），以O(shè)D值分析類胰蛋白酶含量、過敏程度

4、利用斑馬魚行為分析儀檢測斑馬魚的運動距離，定量評價供試品的神經(jīng)舒緩的效果

【評價指標(biāo)】

1、皮膚中性粒細(xì)胞數(shù)量

2、炎癥因子IL-1α、IL-6、IL-8、TNFα分泌量

3、過敏反應(yīng)標(biāo)志物（類胰蛋白酶）含量

4、神經(jīng)舒緩-總運動距離

【結(jié)果展示】

（*展示圖片僅供參考，實際實驗組別依據(jù)合同而定）

1、皮膚中性粒細(xì)胞數(shù)量

圖1.皮膚中性粒細(xì)胞表型圖 

黃色虛線區(qū)域為計算區(qū)域，綠色熒光點為中性粒細(xì)胞

2、炎癥因子表達(dá)水平：提供柱狀圖

圖2.斑馬魚IL-6基因相對表達(dá)量

3、類胰蛋白酶含量：提供柱狀圖

圖3.類胰蛋白含量柱形圖 

4、神經(jīng)舒緩（鎮(zhèn)痛）-總運動距離（軌跡圖、柱狀圖，略）

圖4.斑馬魚運動軌跡圖 

【評價結(jié)論】

供試品斑馬魚中性粒細(xì)胞數(shù)量、炎癥因子表達(dá)量、類胰蛋白酶的量與模型對照組相比，明顯減少；斑馬魚運動距離與模型對照組相比，明顯減少；本實驗證明該供試品具有舒緩功效。

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