本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種山荷葉提取物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

山荷葉(astilboidestabularis(hemsl.)engler)是虎耳草科大葉子屬多年生草本植物，又名大葉子、佛傘子、大脖梗子。主要分布于我國東北地區(qū)(朝鮮半島也有分布)，生于山坡、溝谷林下，產(chǎn)于吉林省吉林，撫松、長白、渾江等市縣。性澀、平、微苦，具有收澀、固腸、止瀉等功效，常用于治療腹瀉。但是，迄今為止，從未報道過山荷葉的抗癌作用相關(guān)研究。

惡性腫瘤是危害人類生命與健康的重要疾病，已成為僅次于心腦血管疾病的全球第二大死亡原因，國際癌癥研究中心(iarc)的數(shù)據(jù)顯示，2012年全球惡性腫瘤新發(fā)病1410萬例，并導致820萬例死亡。近年來，隨著人口老齡化加劇、城市化及工業(yè)化進程的加快以及居民生活環(huán)境等因素的不斷變化，我國惡性腫瘤譜不斷變化，對居民健康造成了嚴重的危害，防控形勢不容樂觀，國家癌癥中心全國范圍的研究結(jié)果顯示，2015年我國新發(fā)惡性腫瘤病例429萬，居民因惡性腫瘤死亡281萬。在腫瘤治療中，傳統(tǒng)的放，化療在殺傷腫瘤細胞的同時，也造成機體骨髓抑制和免疫功能低下，毒副作用大。天然藥物無論在減輕臨床癥狀，提高生存質(zhì)量，防止復發(fā)轉(zhuǎn)移，延長生存期，還是在與放化療配合增效減毒方面都有很好的效果。

本發(fā)明人在尋找中草藥抗癌活性成分的過程中，發(fā)現(xiàn)山荷葉提取物具有良好的抗腫瘤活性。這為后期這種植物提取物的抗癌或輔助治療作用研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種山荷葉提取物及其制備方法和應(yīng)用。該山荷葉提取物抗癌活性好，制備工藝簡單，為山荷葉在抗癌藥物研究中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種山荷葉提取物的制備方法，包括以下步驟：取山荷葉，加甲醇溶液提取，濾過，合并濾液，回收甲醇至濾液無醇味，即得。

進一步地，包括以下步驟：取山荷葉，加甲醇溶液提取2-3次，每次加甲醇溶液的量為山荷葉原料質(zhì)量的3～10倍，濾過，合并濾液，回收甲醇至濾液無醇味，即得，整個制備過程溫度不超50℃。

優(yōu)選地，包括以下步驟：取山荷葉，加甲醇溶液，在超聲波輔助下提取3次，每次0.5～1.5小時，每次加甲醇溶液的量為山荷葉原料質(zhì)量的5倍，濾過，合并濾液，回收甲醇至濾液無醇味，即得，整個制備過程溫度不超50℃。

本發(fā)明中，所述甲醇溶液為質(zhì)量百分比濃度為55％～95％的甲醇溶液。

本發(fā)明中，所述回收甲醇在43℃～48℃、真空度0.04～0.06mpa條件下進行。

本發(fā)明中，所述山荷葉為虎耳草科大葉子屬多年生草本植物山荷葉astilboidestabularis(hemsl.)engler的干燥葉。

本發(fā)明提供了上述制備方法制備得到的山荷葉提取物。

本發(fā)明還提供了上述山荷葉提取物在制備治療癌癥藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種抗癌藥物制劑，由有效量的上述山荷葉提取物和藥學上可接受的載體組成。本領(lǐng)域技術(shù)人員可將所述山荷葉提取物直接或間接加入制備不同劑型時所需的藥學上可接受的各種常用載體，如崩解劑、潤滑劑、乳化劑、粘合劑等，以常規(guī)藥物制劑方法，制成常用劑型如口服液、膠囊劑、涂劑、巴布劑、噴霧劑、注射劑、注射用凍干制劑、顆粒劑、片劑、丸劑、散劑或滴丸劑。所述制劑可以通過以下方式中的適合方式給藥：口服、噴霧吸入、直腸給藥、鼻腔給藥、陰道給藥、局部給藥、非腸道給藥如皮下、靜脈、肌肉、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、胸骨內(nèi)或顱內(nèi)注射或輸入，或借助一種外植的儲器用藥，其中優(yōu)選口服、肌注、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)用藥方式。

綜上所述，由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明山荷葉提取物的制備工藝簡單實用，制得的提取物抗癌活性好；實驗結(jié)果顯示：山荷葉提取物對colon205細胞抑制作用明顯，為后期這種植物提取物的抗癌或輔助治療作用研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

【附圖說明】

圖1：實施例1制備得到的山荷葉提取物對colo205細胞生長的抑制作用。

圖2：實施例2制備得到的山荷葉提取物對colo205細胞生長的抑制作用。

圖3：實施例3制備得到的山荷葉提取物對colo205細胞生長的抑制作用。

a為5-fu，b為山荷葉提取物。

【具體實施方式】

實施例1山荷葉提取物的制備

(1)將干燥后山荷葉40g浸入200g質(zhì)量百分比濃度為95％的甲醇溶液中40-50℃超聲提取(功率550w，頻率25khz)1h，濾過，濾渣中再添加200g質(zhì)量百分比濃度為95％的甲醇溶液超聲提取(功率550w，頻率25khz)1h，濾過，濾渣中再添加200g質(zhì)量百分比濃度為95％的甲醇溶液超聲提取(功率550w，頻率25khz)1h，濾過，合并三次濾液得到提取液；

(2)步驟(1)的提取液在43℃-48℃、真空度0.04～0.06mpa條件下減壓回收甲醇至濾液無醇味，即得。

實施例2山荷葉提取物的制備

(1)將干燥后山荷葉40g浸入400g質(zhì)量百分比濃度為75％的甲醇溶液中40-50℃超聲提取(功率550w，頻率25khz)1.5h，濾過，濾渣中再添加320g質(zhì)量百分比濃度為75％的甲醇溶液超聲提取(功率550w，頻率25khz)1.5h，濾過，合并兩次濾液得到提取液；

(2)步驟(1)的提取液在43℃-48℃、真空度0.04～0.06mpa條件下減壓回收甲醇至濾液無醇味，即得。

實施例3山荷葉提取物的制備

(1)將干燥后山荷葉40g浸入320g質(zhì)量百分比濃度為55％的甲醇溶液中40-50℃超聲提取(功率550w，頻率25khz)1h，濾過，濾渣中再添加200g質(zhì)量百分比濃度為55％的甲醇溶液超聲提取(功率550w，頻率25khz)1h，濾過，濾渣中再添加120g質(zhì)量百分比濃度為95％的甲醇溶液超聲提取(功率550w，頻率25khz)1h，濾過，合并三次濾液得到提取液；

(2)步驟(1)的提取液在43℃-48℃、真空度0.04～0.06mpa條件下減壓回收甲醇至濾液無醇味，即得。

實施例4山荷葉提取物的體外抗癌實驗

1.細胞株，試劑以及儀器

人惡性結(jié)腸癌細胞系colon205，rpmi1640培養(yǎng)基(美國gibico公司)，胎牛血清(天津市灝陽生物制品科技有限公司)，胰蛋白酶(美國sigma公司)，dmso(分析純，amresco)，青霉素(sigma)，鏈霉素(sigma)，mtt(amresco)，96孔板，co2培養(yǎng)箱(日本sanyo公司)，96孔板酶標儀bio-rad680(美國bio-rad公司)，生物操作臺(吳江市綠島凈化設(shè)備廠)。

2.腫瘤細胞培養(yǎng)方法

基礎(chǔ)培養(yǎng)基1640+10％fbs(胎牛血清)+1％雙抗青鏈霉素，培養(yǎng)條件為37℃，5％co2濃度及飽和濕度；當細胞生長至對數(shù)期時，用胰蛋白酶消化細胞，洗滌吹散細胞，以每孔1×104個細胞100μl接種于96孔板，以備mtt實驗。

3.細胞增殖實驗(mtt法)

3.1將處于對數(shù)生長期的人惡性結(jié)腸癌細胞系colon205細胞，鋪板于96孔板，每組設(shè)3個平行孔。實驗組加入實施例1制得的不同濃度的山荷葉提取物樣品。對照組加入培養(yǎng)液，另設(shè)空白組，分別處理24h后，采用mtt法檢測癌細胞增殖抑制率，增殖抑制率(％)＝(1－實驗組od值/對照組od值)×100％；從圖1中可以看出：低濃度山荷葉提取物(50μg/ml)對細胞抑制增殖作用不明顯，較高濃度(100μg/ml、200μg/ml)山荷葉提取物對colo205細胞有明顯的抑制增殖作用，且呈量效關(guān)系，特別對colo205細胞抑制率高于陽性藥物氟尿嘧啶(5-fu)。

3.2將處于對數(shù)生長期的人惡性結(jié)腸癌細胞系colon205細胞，鋪板于96孔板，每組設(shè)3個平行孔。實驗組加入實施例2制得的不同濃度的山荷葉提取物樣品。對照組加入培養(yǎng)液，另設(shè)空白組，分別處理24h后，采用mtt法檢測癌細胞增殖抑制率，增殖抑制率(％)＝(1－實驗組od值/對照組od值)×100％；從圖2中可以看出：低濃度山荷葉提取物(50μg/ml)對細胞抑制增殖作用不明顯，較高濃度(100μg/ml、200μg/ml)山荷葉提取物對colo205細胞有明顯的抑制增殖作用，且呈量效關(guān)系，特別對colo205細胞抑制率高于陽性藥物氟尿嘧啶(5-fu)。

3.3將處于對數(shù)生長期的人惡性結(jié)腸癌細胞系colon205細胞，鋪板于96孔板，每組設(shè)3個平行孔。實驗組加入實施例3制得的不同濃度的山荷葉提取物樣品。對照組加入培養(yǎng)液，另設(shè)空白組，分別處理24h后，采用mtt法檢測癌細胞增殖抑制率，增殖抑制率(％)＝(1－實驗組od值/對照組od值)×100％；從圖3中可以看出：低濃度山荷葉提取物(50μg/ml)對細胞抑制增殖作用不明顯，較高濃度(100μg/ml、200μg/ml)山荷葉提取物對colo205細胞有明顯的抑制增殖作用，且呈量效關(guān)系，特別對colo205細胞抑制率高于陽性藥物氟尿嘧啶(5-fu)。

以上結(jié)果表明本發(fā)明的山荷葉提取物具有較好的抗癌生物活性，可以用于制備抗癌制劑。

上述說明是針對本發(fā)明較佳可行實施例的詳細說明，但實施例并非用以限定本發(fā)明的專利申請范圍，凡本發(fā)明所提示的技術(shù)精神下所完成的同等變化或修飾變更，均應(yīng)屬于本發(fā)明所涵蓋專利范圍。

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