1.本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及元寶楓葉提取物作為抗炎藥物或護(hù)膚產(chǎn)品的用途，并提供了一種制備該提取物的方法。

背景技術(shù)：

2.元寶楓（acer truncatumbunge）為無患子科（sapindaceae）槭屬的落葉喬木，因其翅果酷似我國(guó)古代的金元寶而得名元寶楓。元寶楓自然分布于吉林、遼寧、陜西、北京、內(nèi)蒙古、甘肅、河北、河南、山東、江蘇。該植物在我國(guó)民間具有多種傳統(tǒng)用途，包括食用、藥用、觀賞和文化價(jià)值等。民族植物學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，蒙古族將元寶楓葉當(dāng)茶葉長(zhǎng)期泡水喝，來治療高血壓、高血脂。朝鮮族將元寶楓葉煮水服用來治療咳嗽，去火。吉林、內(nèi)蒙古、陜西和甘肅地區(qū)還有直接將元寶楓果實(shí)炒熟食用的傳統(tǒng)，方法與炒食瓜子或豆子相似，炒熟后，剝?nèi)ス麣?，食其種子。
3.元寶楓葉、花、種子、種皮及種子油等不同植物部位的提取物或單體化合物具有多種生物活性，如抗菌、抗氧化、抗腫瘤、乙酰膽堿酯酶抑制及脂肪酸合成酶抑制等多種生物活性，活性化合物主要為黃酮類、單寧類、有機(jī)酸及生物源揮發(fā)性化合物等，尤其是延緩大腦衰老的重要成分神經(jīng)酸，因此該植物在制藥、食品、保健品和化妝品等領(lǐng)域具備較大開發(fā)潛力。
4.雖然元寶楓具有多種利用價(jià)值和較好的生物活性，但人們大量利用的卻是其觀賞價(jià)值，對(duì)其食用價(jià)值、藥用價(jià)值的關(guān)注仍十分有限。且隨著現(xiàn)代醫(yī)療事業(yè)的發(fā)展，民間與元寶楓相關(guān)的醫(yī)藥知識(shí)也瀕臨喪失，因此亟待對(duì)該植物資源的藥用價(jià)值進(jìn)行深度挖掘。
5.十二烷基硫酸鈉（sds），也稱為十二烷基硫酸鈉鹽，是一種具有強(qiáng)清潔能力和強(qiáng)脫脂能力的表面活性劑。它也是最刺激的表面活性劑成分之一，廣泛用于清潔、洗發(fā)水和沐浴露。然而，由于其強(qiáng)大的脫脂能力，很容易對(duì)敏感皮膚造成損害，因此，sds也是人體皮膚刺激模型貼片試驗(yàn)的常見陽性對(duì)照。sds刺激可誘導(dǎo)表皮炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，中性粒細(xì)胞遷移至皮膚表皮，并誘導(dǎo)皮膚炎癥。
6.hacat細(xì)胞約占人類表皮細(xì)胞的95%。皮膚被細(xì)菌和真菌感染后，導(dǎo)致炎癥，hacat細(xì)胞將首先做出反應(yīng)，然后在皮膚表面表現(xiàn)出各類癥狀。
7.皮炎是一種慢性皮膚炎性疾病，表現(xiàn)為嚴(yán)重瘙癢、反復(fù)發(fā)作和持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。內(nèi)部或外部因素均可通過破壞皮膚表皮引起皮炎。目前，皮炎的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。免疫系統(tǒng)功能異常被廣泛認(rèn)為是主要原因。臨床上使用激素藥物和抗組胺藥物進(jìn)行治療。然而，這些藥物副作用大且無法根治。與西醫(yī)相比，各種傳統(tǒng)醫(yī)療系統(tǒng)，如中醫(yī)藥，具有長(zhǎng)期實(shí)踐、副作用小以及從根本上調(diào)節(jié)和治療疾病的特點(diǎn)。傳統(tǒng)藥物中尋找治療皮炎的可靠藥物成為一個(gè)熱門研究課題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

8.目前關(guān)于元寶楓葉的抗炎活性研究或相關(guān)專利仍然未見報(bào)道。為充分挖掘元寶楓
的價(jià)值，服務(wù)人類健康產(chǎn)業(yè)，本發(fā)明首次證明元寶楓葉提取物作為抗炎藥物或護(hù)膚產(chǎn)品使用的可能性，由此完成本發(fā)明。
9.本發(fā)明因此提供一種具有抗炎活性的組合物，其特征在于，其包括下式所示化合物為活性成分：其中上述結(jié)構(gòu)式的化合物名稱為：（a）山奈酚-3-o-α-l-吡喃鼠李糖苷，（b）槲皮素-3-o-α-l-吡喃鼠李糖苷，（c）山奈酚-3,7-di-o-α-l-吡喃鼠李糖苷，（d）1,2,3,4,6-penta-o-galloyl-β-d-glucose。優(yōu)選地，各化合物的重量配比為式a: b: c: d =10-15: 3-6: 4-8: 7-10。任選地，還包括其他藥學(xué)上可接受的輔料等其他成分。優(yōu)選地，各化合物的重量配比為式a: b: c: d=11-13: 4-5: 5-6: 8-9。
10.本發(fā)明提供一種具有抗炎活性的元寶楓葉提取物的制備方法，包括以下步驟：（1）葉子清洗：采摘新鮮的元寶楓葉片，清洗后陰干；（2）葉子粉碎：將陰干的葉子用電動(dòng)粉碎機(jī)粉碎，粉碎后的葉子粉末過篩備用；（3）粉末浸提：加入有機(jī)溶劑對(duì)葉子粉末進(jìn)行常溫浸提，并用超聲輔助提取；（4）浸提液過濾：將上清液用聚四氟乙烯膜過濾，得到濾液；
（5）減壓濃縮：對(duì)得到的濾液進(jìn)行減壓濃縮，獲得元寶楓葉提取物。
11.優(yōu)選地，第（1）步中的葉子是取自7-8月份處于生長(zhǎng)旺季的元寶楓的新鮮葉子，清水洗凈后，再用去離子水沖洗，然后置于陰涼通風(fēng)處陰干；第（2）步的葉片用電動(dòng)粉碎機(jī)粉碎后，過40目篩得到葉子粉末，將粉末放置于陰涼干燥處；第（3）步中的有機(jī)溶劑是95%乙醇，重復(fù)浸提3次，每次24小時(shí)；第（3）步中的超聲輔助提取時(shí)間為15-30分鐘，具體操作條件是：頻率為20-50 khz，功率為50-500 w，并確保溫度不超過40℃；第（4）過濾方法為：用孔徑為0.45/0.22 μ m的聚四氟乙烯膜或尼龍膜過濾，或用孔徑為10-25μm的濾紙過濾，除去雜質(zhì)；第（5）步中采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行于45-50℃條件進(jìn)行減壓濃縮，減壓真空度為8-600 mbar。
12.更優(yōu)選地，，得到的元寶楓葉提取物控制化合物的重量配比為a: b: c: d=10-15: 3-6: 4-8: 7-10；所述各化合物的分子式如下：。
13.進(jìn)一步優(yōu)選地，還包括將得到元寶楓葉提取物于-20℃封口儲(chǔ)存的步驟。
14.本發(fā)明進(jìn)一步提供所述的制備方法得到的具有抗炎活性的元寶楓葉提取物。
15.本發(fā)明尤其提供所述具有抗炎活性的組合物或所述的具有抗炎活性的元寶楓葉提取物制備抗炎產(chǎn)品中的應(yīng)用。
16.具體地，所述抗炎產(chǎn)品是醫(yī)藥品、保健品、食品或日化用品。優(yōu)選地，所述應(yīng)用是指
用于十二烷基硫酸鈉導(dǎo)致的皮膚炎癥。
17.本發(fā)明采用sds誘導(dǎo)hacat細(xì)胞建立皮膚炎癥模型對(duì)上述提取物進(jìn)行抗炎活性研究。研究結(jié)果證明，該提取物對(duì)sds所致炎癥的抑制作用明顯強(qiáng)于空白對(duì)照?；瘜W(xué)成分研究表明元寶楓種子中具有多種活性成分，例如雙黃酮類和單寧類化合物，為闡明其抗炎活性奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，因此有望進(jìn)一步開發(fā)為抗炎藥劑。本發(fā)明提供了一種具有顯著抗炎活性的元寶楓葉提取物及其制備方法，能為治療sds導(dǎo)致的皮膚炎癥提供了一種天然來源，也能夠使元寶楓葉子“變廢為寶”，進(jìn)一步挖掘該植物的價(jià)值，進(jìn)而促進(jìn)該植物的保護(hù)和可持續(xù)利用。
18.本發(fā)明對(duì)儀器設(shè)備要求低，操作方法簡(jiǎn)易，提取物得率高，所用試劑污染小，對(duì)人體毒性小，回收率高，制備成本低。
附圖說明
19.圖1元寶楓葉子提取物的制備方法示意圖。
20.圖2 化合物a的hspectrum圖譜。
21.圖3 化合物a的cspectrum圖譜。
22.圖4 化合物b的hspectrum圖譜。
23.圖5 化合物b的cspectrum圖譜。
[0024] 圖6 化合物c的hspectrum圖譜。
[0025] 圖7 化合物c的cspectrum圖譜。
[0026]
圖8 化合物d的hspectrum圖譜。
[0027] 圖9 化合物d的cspectrum圖譜。
具體實(shí)施方式
[0028]
下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0029]
實(shí)施例一：提取物的制備實(shí)施例一種具有抗炎活性的元寶楓葉提取物的制備方法（流程示意圖見圖1）包括以下詳細(xì)步驟：（1）葉子清洗：將新鮮采摘的元寶楓葉片用清水沖洗除去灰塵和雜質(zhì)，之后用去離子水再次沖洗，然后將葉片置于陰涼通風(fēng)處陰干。
[0030]
（2）葉子粉碎：陰干的元寶楓葉片用電動(dòng)粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，得到的粉末過40目篩后自封袋封存，置于陰涼干燥處。
[0031]
（3）常溫浸提：過篩后的粉末用95%的乙醇溶液常溫浸提（按1：10的比例，即1g粉末用10 ml溶劑浸泡），２天/次，每5h攪拌10 min。重復(fù)提?。炒?。
[0032]
（4）過濾、濃縮：浸提液用聚四氟乙烯膜過濾，或用孔徑為10-25μm的濾紙過濾進(jìn)行過濾并合并，將合并后的濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮。
[0033]
（5）冷凍干燥：濃縮的浸膏用冷凍干燥機(jī)干燥，干燥條件為：溫度為-80℃，真空壓力小于0 . 140 mbar，干燥時(shí)間為48 h，干燥后的的元寶楓葉提取物，即為本發(fā)明的元寶楓葉提取物，提取物于-20℃封口儲(chǔ)存。
[0034]
實(shí)施例二：提取物的活性驗(yàn)證實(shí)施例
采用sds誘導(dǎo)hacat細(xì)胞炎癥模型對(duì)元寶楓葉 95％乙醇提取物進(jìn)行抗炎活性評(píng)價(jià)。
[0035]
采用cck-8法測(cè)定上述實(shí)施例一中得到的對(duì)元寶楓葉提取物對(duì)sds誘導(dǎo)hacat細(xì)胞炎癥抑制活性，具體包括以下步驟：（1）細(xì)胞培養(yǎng)：由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫提供的hacat細(xì)胞在25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中于恒溫培養(yǎng)箱（37
°
c，5%co2）中培養(yǎng)24小時(shí)，其中含有1%雙抗10%胎牛血清的dmem作為培養(yǎng)基。24小時(shí)后更換培養(yǎng)基以除去未貼壁細(xì)胞，并每1至2天更換培養(yǎng)基，直到細(xì)胞貼壁達(dá)到70%至80%時(shí)，用0.25%edta胰蛋白酶消化液消化細(xì)胞并傳代。
[0036]
（2）藥物配置：由于元寶楓葉提取物為水溶性，可直接溶解在dmem培養(yǎng)基中，故可用dmem培養(yǎng)基將提取物進(jìn)行稀釋得到一系列不同濃度的提取物溶液，濃度范圍在2-0.1 mg/ml。
[0037]
（3）細(xì)胞種板：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的hacat細(xì)胞，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)后，將hacat細(xì)胞懸液調(diào)整至8
×
104個(gè)/ml的濃度按每孔100μl接種在96孔板中，以含有不同濃度提取物溶液作為培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，不含提取物的dmem培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，每個(gè)處理五個(gè)重復(fù)。
[0038]
（4）將96孔板上清液吸出后，每孔加入100 μl含有適當(dāng)建模濃度sds（0.1 mg/ml）的dmem培養(yǎng)hacat細(xì)胞24小時(shí)，檢測(cè)細(xì)胞活力，不含sds的dmem培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，每個(gè)處理五個(gè)重復(fù)。
[0039]
（5）吸光值測(cè)定：24小時(shí)后，在96孔板中每孔加入10μl cck-8溶液，并將其置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-2小時(shí)。使用多功能酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下的檢測(cè)吸光度（od），以計(jì)算細(xì)胞存活率。
[0040]
細(xì)胞存活率 (%) = od給藥/od對(duì)照
×
100%計(jì)算結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，見表1。
[0041]
表1. 元寶楓葉95％乙醇提取物對(duì)sds誘導(dǎo)hacat細(xì)胞炎癥的影響組別sds95％乙醇提取物+sdsdmem細(xì)胞存活率(%)38.8%51.7%
*
62.0%注：95％乙醇提取物+sds表明先用含提取物的對(duì)hacat細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理在用適當(dāng)含量的sds對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激。與空白對(duì)照組相比，*p ＜ 0.05。
[0042]
實(shí)施例三：提取物的化學(xué)成分分析為了測(cè)定元寶楓葉的主要化學(xué)成分，將元寶楓葉95%乙醇提取物溶于水中。在攪拌和溶解過程中，盡可能少的加入乙醇以增加溶解度，乙醇的最終濃度小于10%。將樣品溶液加入預(yù)活化的d101大孔樹脂，樣品1 g∶10 g大孔樹脂，然后依次用純水、20%、40%、60%、80%和95%乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫。得到六個(gè)餾分a-f。用聚酰胺柱（200-300目）分離餾分c樣品，并用甲醇-水溶液（v/v為l:1；2:1；4:1）進(jìn)行梯度洗脫，以獲得c
l-c3組分。用凝膠sephadex lh-20（甲醇∶水為1:1）進(jìn)一步分離和洗脫組分c2，得到frc
2-1-frc
2-20
，frc
2-7
通過薄層硅膠板刮板制備，然后用凝膠sehadex lh-20在溶劑甲醇中純化和洗滌，分別獲得化合物a和化合物b。使用凝膠sephadex lh-20分離并用溶劑（甲醇∶水為1:1）洗脫組分c1，以獲得frc
1-1-frc
1-20
，通過高效液相色譜（hplc）循環(huán)制備分離frc
1-2
后獲得的主要點(diǎn)（90%甲醇）繼續(xù)通過刮板純化，獲得化合物c。此外，將級(jí)分c3分離并用凝膠sephadex lh-20（甲醇∶水為1:1）洗
脫以獲得frc
3-1-frc
3-20
；通過hplc（80%甲醇）的循環(huán)制備分離frc
3-6
，得到化合物d。
[0043]
通過波譜數(shù)據(jù)分析和高分辨質(zhì)譜分析對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。圖2和圖3分別顯示化合物a的hspectrum圖譜和cspectrum圖譜。圖4和圖5分別顯示 化合物b的hspectrum圖譜和cspectrum圖譜。圖6和圖7分別顯示化合物c的hspectrum圖譜和cspectrum圖譜。圖8和圖9分別顯示化合物d的hspectrum圖譜和cspectrum圖譜。結(jié)果表明，化合物a為山奈酚-3-o-α-l-吡喃鼠李糖苷，化合物b為槲皮素-3-o-α-l-吡喃鼠李糖苷，化合物c為山奈酚-3,7-di-o-α-l-吡喃鼠李糖苷，化合物d為1,2,3,4,6-penta-o-galloyl-β-d-glucose。其中化合物a的質(zhì)量為12 mg，b為4.8 mg，c為5.3 mg，d為8.2 mg。
[0044]
據(jù)報(bào)道，化合物a可顯著降低支氣管肺泡灌洗液（balf）和肺組織中升高的炎性細(xì)胞數(shù)量，并顯著抑制肺和balf中th2細(xì)胞因子的增加，從而完全維持其抗炎和抗哮喘作用?；衔颾作為槲皮素衍生物已顯示出抗炎和抗氧化作用。例如，化合物b可抑制tnf-α刺激的hacat細(xì)胞中細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，還可減弱tnf-β誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)的形成和nf-κb和eric的激活。在卡拉膠誘導(dǎo)的小鼠后爪水腫模型中，化合物c也顯示出顯著的抗炎作用，在50 mg/kg劑量下，化合物3顯示出具有強(qiáng)大的抗傷害和抗炎活性，并且沒有誘導(dǎo)任何明顯的急性毒性和胃損傷。作為具有強(qiáng)抗炎、抗氧化和抗菌活性的多酚化合物，化合物d不僅通過調(diào)節(jié)細(xì)胞活性在單核細(xì)胞中顯示出抗炎潛力，而且已被證明對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏
陽性細(xì)菌具有廣譜生長(zhǎng)抑制作用，mic在16-32μg/ml之間。綜上所述，元寶楓葉片中的活性成分為闡明本發(fā)明提取物的抗炎藥效奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

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