金屬離子鉻和鎂參與NAFLD脂代謝調(diào)控研究
【摘要】: 隨著非酒精性脂肪肝病(NAFLD)發(fā)病率逐年上升,已成為21世紀(jì)全球重要的公共健康問題之一,探究其病理機(jī)制和發(fā)掘潛在治療靶點(diǎn)是目前相關(guān)研究的重心。金屬離子在細(xì)胞功能、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和能量代謝中起到重要作用,參與多種生理活動(dòng)和疾病發(fā)展,是許多脂代謝關(guān)鍵酶的輔基,但它們?cè)贜AFLD脂代謝中的調(diào)控作用并不完全清楚。三價(jià)鉻離子是哺乳動(dòng)物必需微量元素之一,在維持血糖平衡和脂質(zhì)代謝中起著重要作用,廣泛應(yīng)用于保健品、飼料添加劑和醫(yī)藥行業(yè)。有報(bào)道其對(duì)預(yù)防和緩解NAFLD有潛在作用,但分子機(jī)制仍不清晰。首先選取SMMC-7721細(xì)胞和BALB/c小鼠作為研究對(duì)象,用油酸(OA)作為單一外源脂肪酸誘導(dǎo)構(gòu)建NAFLD細(xì)胞模型和小鼠模型,并對(duì)NAFLD模型補(bǔ)充三價(jià)鉻離子。結(jié)果顯示三價(jià)鉻離子可以有效改善NAFLD性狀。三價(jià)鉻離子可以有效降低肝細(xì)胞和肝臟內(nèi)甘油三酯和脂肪酸的過量累積,降低肝重、體重和轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST含量,降低CD36和DGAT2的過表達(dá),同時(shí)穩(wěn)定小鼠血清中紊亂的炎癥因子。在和DGAT2抑制劑、激動(dòng)劑聯(lián)合作用時(shí),三價(jià)鉻離子依然對(duì)DGAT2的表達(dá)水平起負(fù)調(diào)控效應(yīng),抑制甘油三酯的合成,說明DGAT2可能是三價(jià)鉻離子參與NAFLD脂代謝調(diào)控的重要靶分子。對(duì)OA誘導(dǎo)的NAFLD細(xì)胞模型和小鼠模型進(jìn)行金屬組分析發(fā)現(xiàn),脂變性的同時(shí)均伴隨著鎂缺乏,外源補(bǔ)充鎂離子NAFLD脂代謝紊亂能否得到改善有待證實(shí)。鎂離子是人體內(nèi)第二大陽離子,作為輔酶因子參與細(xì)胞內(nèi)600多種酶系統(tǒng),在能量代謝、細(xì)胞增殖和神經(jīng)傳導(dǎo)中有著重要作用,而鎂缺乏會(huì)造成痙攣、抑郁、高血脂和肥胖等疾病。本文結(jié)果顯示補(bǔ)充鎂離子可以有效緩解NAFLD模型的脂變性:通過油紅O染色、TLC和GCMS等方法檢測(cè)脂類變化發(fā)現(xiàn)外源鎂離子可以緩解NAFLD模型中甘油三酯以及脂肪酸的過量累積;且外源鎂離子可以抑制NAFLD小鼠血清中過高的轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST;進(jìn)一步通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot分析相關(guān)脂代謝基因發(fā)現(xiàn)外源鎂離子可以降低OA引起的CD36和DGAT2過量表達(dá),推測(cè)鎂離子通過降低脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CD36表達(dá)來降低肝臟攝取OA,同時(shí)通過降低甘油三酯合成限速酶DGAT2表達(dá)來降低肝臟內(nèi)甘油三酯合成。已有研究發(fā)現(xiàn)炎癥因子紊亂可以導(dǎo)致并加重NAFLD發(fā)病程度,促炎因子和抗炎因子之間的平衡,可能決定了 NAFLD的進(jìn)展,本文通過ELISA分析NAFLD小鼠血清炎癥因子變化,結(jié)果顯示鎂離子可以降低促炎因子(IL-1β、TNF-α和IL-12)含量并升高抗炎因子(IL-10)含量,改善NAFLD小鼠炎癥反應(yīng)。此外,用ICP-AES檢測(cè)NAFLD細(xì)胞和小鼠模型金屬組,結(jié)果顯示外源鎂離子可以有效緩解NAFLD模型鐵負(fù)載癥狀,說明鎂離子可以通過改善鐵負(fù)載進(jìn)而起到改善NAFLD的性狀。鎂離子對(duì)NAFLD緩解作用機(jī)制研究表明,外源OA下調(diào)了 NAFLD細(xì)胞模型鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)基因PRL3和CNNM3的表達(dá)水平,同時(shí)降低肝細(xì)胞內(nèi)鎂離子濃度;相反,通過重組質(zhì)粒超表達(dá)PRL3和CNNM3可以恢復(fù)胞內(nèi)鎂離子含量,且PRL3響應(yīng)鎂離子對(duì)DGAT2的調(diào)控。鎂離子響應(yīng)基因PRL3是否可以通過調(diào)控DGAT2的表達(dá)影響甘油三醋合成?本文利用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和siRNA干擾技術(shù)對(duì)通路上各信號(hào)蛋白進(jìn)行超表達(dá)或沉默,結(jié)果表明PRL3作為上游基因作用于PI3K/AKT/mTOR和mTOR/Lipin1/SREBP1信號(hào)通路,且SREBP1調(diào)控DGAT2的表達(dá)。在鎂離子緩解NAFLD細(xì)胞模型脂積累同時(shí),添加PRL3抑制劑和mTOR抑制劑進(jìn)行驗(yàn)證,Western blot結(jié)果表明鎂離子經(jīng)由PRL3/AKT/mTOR和mTOR/Lipin1/SREBP1作用于DGAT2的表達(dá),并經(jīng)由此通路影響甘油三酯的合成。SREBP1作為脂代謝基因調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子,其轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域克隆超表達(dá)載體可以下調(diào)DGAT2表達(dá),且siRNA-SREBP1上調(diào)DGAT2表達(dá)。啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)DGAT2啟動(dòng)子區(qū)域存在SREBP1結(jié)合位點(diǎn)(5'-ATCACCCCAC-3'),熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SREBP1負(fù)調(diào)控DGAT2基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性,EMSA和ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)SREBP1蛋白和DGAT2啟動(dòng)子DNA在細(xì)胞外和內(nèi)存在結(jié)合作用。同時(shí)鎂離子作為輔助因子參與SREBP1蛋白和DGAT2啟動(dòng)子的結(jié)合過程。綜上所述,三價(jià)鉻離子和鎂離子均可以降低OA誘導(dǎo)的NAFLD小鼠模型中的脂累積、肝重、體重和轉(zhuǎn)氨酶,并穩(wěn)定紊亂的脂代謝基因和炎癥因子;鎂離子還起到改善鐵負(fù)載和鎂缺乏的作用。鎂離子參與NAFLD脂代謝細(xì)胞調(diào)控機(jī)制結(jié)果顯示:鎂離子經(jīng)由PRL3/AKT/mTOR 和 mTOR/Lipin1/SREBP1 通路作用于 DGAT2 的表達(dá)且參與 SREBP1對(duì)DGAT2轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程??傊?通過本論文的研究,證實(shí)了金屬離子在NAFLD脂代謝的重要調(diào)控作用,并提出了DGAT2作為NAFLD潛在治療靶點(diǎn)的可能性。
【學(xué)位授予單位】:華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:博士
【學(xué)位授予年份】:2018
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網(wǎng)址: 金屬離子鉻和鎂參與NAFLD脂代謝調(diào)控研究 http://m.u1s5d6.cn/newsview236027.html
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