【摘要】： 隨著非酒精性脂肪肝病(NAFLD)發(fā)病率逐年上升,已成為21世紀全球重要的公共健康問題之一,探究其病理機制和發(fā)掘潛在治療靶點是目前相關研究的重心。金屬離子在細胞功能、信號轉(zhuǎn)導和能量代謝中起到重要作用,參與多種生理活動和疾病發(fā)展,是許多脂代謝關鍵酶的輔基,但它們在NAFLD脂代謝中的調(diào)控作用并不完全清楚。三價鉻離子是哺乳動物必需微量元素之一,在維持血糖平衡和脂質(zhì)代謝中起著重要作用,廣泛應用于保健品、飼料添加劑和醫(yī)藥行業(yè)。有報道其對預防和緩解NAFLD有潛在作用,但分子機制仍不清晰。首先選取SMMC-7721細胞和BALB/c小鼠作為研究對象,用油酸(OA)作為單一外源脂肪酸誘導構(gòu)建NAFLD細胞模型和小鼠模型,并對NAFLD模型補充三價鉻離子。結(jié)果顯示三價鉻離子可以有效改善NAFLD性狀。三價鉻離子可以有效降低肝細胞和肝臟內(nèi)甘油三酯和脂肪酸的過量累積,降低肝重、體重和轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST含量,降低CD36和DGAT2的過表達,同時穩(wěn)定小鼠血清中紊亂的炎癥因子。在和DGAT2抑制劑、激動劑聯(lián)合作用時,三價鉻離子依然對DGAT2的表達水平起負調(diào)控效應,抑制甘油三酯的合成,說明DGAT2可能是三價鉻離子參與NAFLD脂代謝調(diào)控的重要靶分子。對OA誘導的NAFLD細胞模型和小鼠模型進行金屬組分析發(fā)現(xiàn),脂變性的同時均伴隨著鎂缺乏,外源補充鎂離子NAFLD脂代謝紊亂能否得到改善有待證實。鎂離子是人體內(nèi)第二大陽離子,作為輔酶因子參與細胞內(nèi)600多種酶系統(tǒng),在能量代謝、細胞增殖和神經(jīng)傳導中有著重要作用,而鎂缺乏會造成痙攣、抑郁、高血脂和肥胖等疾病。本文結(jié)果顯示補充鎂離子可以有效緩解NAFLD模型的脂變性:通過油紅O染色、TLC和GCMS等方法檢測脂類變化發(fā)現(xiàn)外源鎂離子可以緩解NAFLD模型中甘油三酯以及脂肪酸的過量累積;且外源鎂離子可以抑制NAFLD小鼠血清中過高的轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST;進一步通過實時熒光定量PCR和Western blot分析相關脂代謝基因發(fā)現(xiàn)外源鎂離子可以降低OA引起的CD36和DGAT2過量表達,推測鎂離子通過降低脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白CD36表達來降低肝臟攝取OA,同時通過降低甘油三酯合成限速酶DGAT2表達來降低肝臟內(nèi)甘油三酯合成。已有研究發(fā)現(xiàn)炎癥因子紊亂可以導致并加重NAFLD發(fā)病程度,促炎因子和抗炎因子之間的平衡,可能決定了 NAFLD的進展,本文通過ELISA分析NAFLD小鼠血清炎癥因子變化,結(jié)果顯示鎂離子可以降低促炎因子(IL-1β、TNF-α和IL-12)含量并升高抗炎因子(IL-10)含量,改善NAFLD小鼠炎癥反應。此外,用ICP-AES檢測NAFLD細胞和小鼠模型金屬組,結(jié)果顯示外源鎂離子可以有效緩解NAFLD模型鐵負載癥狀,說明鎂離子可以通過改善鐵負載進而起到改善NAFLD的性狀。鎂離子對NAFLD緩解作用機制研究表明,外源OA下調(diào)了 NAFLD細胞模型鎂離子轉(zhuǎn)運基因PRL3和CNNM3的表達水平,同時降低肝細胞內(nèi)鎂離子濃度;相反,通過重組質(zhì)粒超表達PRL3和CNNM3可以恢復胞內(nèi)鎂離子含量,且PRL3響應鎂離子對DGAT2的調(diào)控。鎂離子響應基因PRL3是否可以通過調(diào)控DGAT2的表達影響甘油三醋合成?本文利用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和siRNA干擾技術對通路上各信號蛋白進行超表達或沉默,結(jié)果表明PRL3作為上游基因作用于PI3K/AKT/mTOR和mTOR/Lipin1/SREBP1信號通路,且SREBP1調(diào)控DGAT2的表達。在鎂離子緩解NAFLD細胞模型脂積累同時,添加PRL3抑制劑和mTOR抑制劑進行驗證,Western blot結(jié)果表明鎂離子經(jīng)由PRL3/AKT/mTOR和mTOR/Lipin1/SREBP1作用于DGAT2的表達,并經(jīng)由此通路影響甘油三酯的合成。SREBP1作為脂代謝基因調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子,其轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域克隆超表達載體可以下調(diào)DGAT2表達,且siRNA-SREBP1上調(diào)DGAT2表達。啟動子數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)DGAT2啟動子區(qū)域存在SREBP1結(jié)合位點(5'-ATCACCCCAC-3'),熒光素酶報告基因檢測發(fā)現(xiàn)SREBP1負調(diào)控DGAT2基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性,EMSA和ChIP實驗結(jié)果證實SREBP1蛋白和DGAT2啟動子DNA在細胞外和內(nèi)存在結(jié)合作用。同時鎂離子作為輔助因子參與SREBP1蛋白和DGAT2啟動子的結(jié)合過程。綜上所述,三價鉻離子和鎂離子均可以降低OA誘導的NAFLD小鼠模型中的脂累積、肝重、體重和轉(zhuǎn)氨酶,并穩(wěn)定紊亂的脂代謝基因和炎癥因子;鎂離子還起到改善鐵負載和鎂缺乏的作用。鎂離子參與NAFLD脂代謝細胞調(diào)控機制結(jié)果顯示:鎂離子經(jīng)由PRL3/AKT/mTOR 和 mTOR/Lipin1/SREBP1 通路作用于 DGAT2 的表達且參與 SREBP1對DGAT2轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。總之,通過本論文的研究,證實了金屬離子在NAFLD脂代謝的重要調(diào)控作用,并提出了DGAT2作為NAFLD潛在治療靶點的可能性。

【學位授予單位】：華東理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018

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