健康的腸道微生物組(即腸道菌群)是一個相對穩(wěn)定的生態(tài)系統(tǒng)，很多科學家都稱其為人體的“第二大腦”。但抗生素、感染、飲食或生活方式的重大改變，比如間歇性禁食，都可能導致這一生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生短暫或持久的變化。

　　近年來，禁食已成了科學界的新寵。越來越多的研究表明，禁食有很多的健康益處，包括改善代謝健康，預防或延緩年齡相關的疾病，甚至可以減緩腫瘤的生長。

　　那么，禁食會對腸道菌群有什么樣的影響呢?

　　近日，來自深圳和哥本哈根的科學家們在Nature出版集團旗下刊物《NPJ Biofilms Microbiomes》發(fā)表了題為“Intermittent fasting modulates the intestinal microbiota and improves obesity and host energy metabolism”的研究論文，明確了間歇性禁食(IF)干預后參與者的體重減輕，肥胖相關參數(shù)得到顯著改善。接著，研究者采用鳥槍法宏基因組測序發(fā)現(xiàn)了腸道益生菌和碳水化合物降解菌顯著富集，即IF干預增加了碳水化合物活性酶的豐富性和多樣性。

　　一、研究背景

　　隨著經(jīng)濟的發(fā)展和飲食生活方式的傳播，肥胖已成為一個世界性問題。作為一種禁食策略，IF有望成為對抗肥胖的一種選擇。與傳統(tǒng)禁食計劃相比，采用IF的方案后的平均體重和胰島素抵抗減輕更多。

　　腸道菌群在肥胖和相關疾病中起著重要作用，通過刺激營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和調(diào)節(jié)宿主代謝來預防或促進肥胖。食物攝入的類型和時間，會改變腸道菌群的晝夜節(jié)律。

　　已有研究證實，IF可根據(jù)16SrRNA基因擴增子測序調(diào)節(jié)腸道菌群。但IF引起的人類腸道菌群變化尚未得到很好的表征，而且這種變化如何促進體重減輕的細節(jié)仍不清楚。

　　二、研究方法

　　1、參與者招募

　　共計81人符合標準并參與了整個試驗，72名參與者捐贈了所需樣本。

　　納入標準：(1)18-55歲;(2)18kg/m2?

　　排除標準：(1)在過去4周內(nèi)接受過抗生素治療;(2)高血壓、糖尿病或其他代謝疾病病史;(3)懷孕、腸胃手術史或全身性疾病;(4)使用皮質(zhì)類固醇藥物、β-受體阻滯劑或其他可能影響結(jié)果的藥物。

　　2、信息收集和生化檢測

　　IF干預為期三周，能量攝入設定在500-600kCal，均由代餐粉和蛋白棒提供。參與者被要求留在療養(yǎng)院，在禁食期間無法獲得額外的食物。每周五天安排代餐粉作為晚餐主食，其余時間提供正常飲食，參與者可隨意進食。在干預開始前一天和干預的最后一天進行血液生化分析和糞便樣本采集。

　　3、糞便DNA提取和鳥槍法宏基因組測序

　　在IF干預前后共收集了175個參與者的糞便樣本。提取DNA在中國國家基因庫(CNGB)中進行定量檢測，每個樣品的200ng DNA剪切成長度約為300 bp的片段進行下游反應，接著在CNGB的DIPSEQ-T1(華大基因研究院)上對文庫進行測序。175個糞便樣本中獲得的宏基因組測序數(shù)據(jù)用于從頭組裝和分箱。

　　4、組裝和重疊群分箱

　　使用MEGAHIT(宏基因組組裝工具)單獨組裝樣本的清晰讀數(shù)，使用VAMB(變體自動編碼器)進行宏基因組分箱。dRep程序?qū)昊蚪M的箱進行去復制，以獲得非冗余MAG(宏基因組組裝基因組)目錄。使用metaWRAP(宏基因組數(shù)據(jù)分析軟件包)進行分析，以計算每個樣本中MAG的豐度。

　　5、MAG的分類注釋

　　使用基因組分類數(shù)據(jù)庫工具包(GTDB-TkRelease95)分類注釋。與已知種屬的任何基因組相比，平均核苷酸同一性(ANI)< 95%的分箱被認為是未知種屬基因組分箱(uSGB)。

　　6、MAG的系統(tǒng)發(fā)育分析

　　MAG的基因預測和基因組注釋分別使用Prokka(原核生物的基因組自動注釋工具)和metaWRAP的bins注釋模塊進行。2934個代表性MAG的系統(tǒng)發(fā)育樹由PhyloPhlAn(分析菌群之間進化關系軟件)進一步構(gòu)建，以實現(xiàn)可視化。

　　7、菌群組成變化分析統(tǒng)計

　　來自72名參與者的144份糞便樣本數(shù)據(jù)被納入分析。使用vegan包執(zhí)行置換多元方差分析(PERMANOVA)。統(tǒng)計驗證體檢結(jié)果、血液生化參數(shù)和MAG相對豐度的變化。

　　8、菌群潛能分析比較

　　糞便宏基因組測序讀數(shù)被映射到IGC(腸型樣本)，并使用cOMG工具包計算樣本中基因的相對豐度。IGC的原始KO注釋用于注釋配置文件。調(diào)整分析KO相對豐度的變化并計算每個KEGG通路以評估功能通路的整體變化。

　　9、全基因組關聯(lián)研究

　　分析腸道菌群與臨床參數(shù)之間的關聯(lián)。身體檢查和血液生化參數(shù)的數(shù)值結(jié)果用作響應變量，而干預前后富集的MAG或KO的log10轉(zhuǎn)換相對豐度用作預測變量矩陣。使用ILAMM包執(zhí)行回歸。

　　三、研究結(jié)果

　　1、IF干預后體重減輕和臨床改善

　　72名成年中國志愿者在為期三周的干預研究后，結(jié)果顯示：

　　肥胖相關參數(shù)的顯著改善，包括BMI、體重和AI(動脈粥樣硬化指數(shù))——BMI平均下降1.32，體重平均下降3.67kg，而AI平均下降1.53。

　　不同BMI水平的參與者?在干預后體重平均減輕2.82公斤(正常)、3.84公斤(超重)和4.82公斤(肥胖)，以及AI也分別下降了1.23、1.50和2.10。

　　2、IF干預導致腸道菌群分類組成發(fā)生顯著變化

　　72對匹配的樣本進行鳥槍法宏基因組測序。通過從頭組裝和裝箱，總共回收了2934個MAG，包括241個已知屬和538個已知種。比較干預前后采集的樣本，共發(fā)現(xiàn)201個MAG的豐度不同，對能量代謝和肥胖發(fā)展產(chǎn)生有益影響的種屬菌群豐度增加。

　　3、IF干預后富集的菌群種屬含有豐富的碳水化合物活性酶(CAZymes)

　　通過在種屬水平上進行分類注釋，探究147個MAG中碳水化合物活性酶的多樣性和干預前后采集的樣本之間存在豐度差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在IF干預后表現(xiàn)出更高豐度的MAG中有更多類型和更高拷貝數(shù)的碳水化合物活性酶編碼基因。這些基因中的大多數(shù)被注釋為糖苷水解酶(GHs)和糖基轉(zhuǎn)移酶(GTs)，表明腸道菌群利用多種碳源的能力得到了增強。

　　4、IF誘導的腸道菌群變化與宿主代謝和肥胖的臨床參數(shù)相關

　　共計發(fā)現(xiàn)136個MAG與至少一個臨床參數(shù)顯著相關，包括B.thetaiotaomicron(多形擬桿菌)的8個MAGs和P.distasonis(狄氏副擬桿菌)的17個MAGs，與AI呈負相關，其中84個與血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)也呈負相關。與AI負相關的86個MAG中的67個在IF干預后得到了豐富，確定了MAG的相對豐度與宿主臨床測量值之間的相關性。

　　5、IF干預增加了腸道菌群合成琥珀酸的潛能

　　待分析數(shù)據(jù)被映射到已發(fā)布的腸道菌群基因目錄以計算功能注釋基因的豐度。使用調(diào)整后的閾值?，發(fā)現(xiàn)25個KEGG直系同源物(KO)在IF干預后顯著富集，而16個KO的相對豐度下降。進一步計算分析功能通路的富集，發(fā)現(xiàn)碳代謝、檸檬酸循環(huán)和磷酸戊糖途徑在干預后顯著增強，這可能會導致更高的碳水化合物轉(zhuǎn)化和腸道菌群產(chǎn)生的短鏈脂肪酸(SCFA)增加。

　　共計確定了220個KO與至少一個臨床參數(shù)相關。三種KO的相對豐度，即K00844(己糖激酶)、K06859(葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶)和K15037(生物素羧基載體蛋白)在琥珀酸的合成中發(fā)揮作用;K03146(半胱氨酸依賴性二磷酸腺苷噻唑合酶)，與硫胺素合成有關，以及與膽汁分泌有關的K05681干預后顯著升高，但與高脂血癥和動脈粥樣硬化性心血管疾病(ASCVD)密切相關的5個參數(shù)呈負相關。

　　四、總結(jié)

　　72名BMI范圍廣泛的中國志愿者參加了為期三周的IF計劃，在此期間，無論初始人體測量和腸道菌群狀態(tài)如何，平均體重減輕3.67公斤，且臨床參數(shù)得到改善。在干預前后收集糞便樣本并進行鳥槍法宏基因組測序，從頭組裝產(chǎn)生了2934 MAG。結(jié)果分析顯示，干預后腸道益生菌和碳水化合物降解菌顯著富集，它們的相對豐度與肥胖和ASCVD相關參數(shù)呈負相關。干預后富集的MAG顯示，碳水化合物活性酶的高度豐富性和多樣性以及琥珀酸合成相關基因的相對豐度增加。

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