首頁資訊科研

科研

來源：泰然健康網(wǎng) 時間：2024年11月21日 04:31

導(dǎo)讀

減肥手術(shù)是治療2型糖尿病最有效的方法，并且與腸道代謝產(chǎn)物的改變有關(guān)。先前的工作發(fā)現(xiàn)了一種具有抗糖尿病特性的腸道限制性TGR5激動劑-7硫酸膽酸（CA7S）-在進(jìn)行袖狀胃切除術(shù)（SG）后升高。本研究闡明了SG增加CA7S生產(chǎn)的微生物組依賴性途徑。研究顯示一種微生物代謝產(chǎn)物石膽酸（LCA），在小鼠門靜脈血栓形成后增加，并通過激活維生素D受體，誘導(dǎo)肝mSult2A1/hSULT2A表達(dá)來驅(qū)動CA7S的生產(chǎn)。SG引起的微生物組變化增加了膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Asbt和Ostα的腸道表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)LCA跨腸上皮細(xì)胞的選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)。SG動物的盲腸菌群移植足以在無菌（GF）動物中重建該途徑。腸-肝途徑的激活導(dǎo)致CA7S合成和GLP-1分泌，從而使微生物代謝產(chǎn)物與糖尿病表型改善。

論文ID

原名：A microbial metabolite remodels the gut-liver axis following bariatric surgery

譯名：一種微生物代謝物重塑了減肥手術(shù)后的腸-肝軸

期刊：Cell Host Microbe

IF：15.923

發(fā)表時間：2020.12

通訊作者：Eric G.Sheu & A SloanDevlin

通訊作者單位：美國波士頓醫(yī)學(xué)院&哈佛醫(yī)學(xué)院

實驗設(shè)計

結(jié)果

1 CA7S的產(chǎn)生和GLP-1的誘導(dǎo)需要微生物組

為了確定微生物組是否在膽酸-7-硫酸鹽（CA7S）的產(chǎn)生中起作用，對抗生素處理或未處理的飲食誘導(dǎo)肥胖（DIO）小鼠進(jìn)行了袖狀胃切除術(shù)（SG）和假手術(shù)。術(shù)后6周對小鼠實施安樂死，以測量術(shù)后早期變化（圖1A）。采用超高效液相色譜-質(zhì)譜法（UPLC-MS）定量測定組織中膽汁酸（BA）水平。與之前的觀察結(jié)果一致，與常規(guī)組相比，SG小鼠術(shù)后盲腸內(nèi)容物中的CA7S水平較高（圖1B）。然而，術(shù)前用抗生素治療小鼠可消除SG介導(dǎo)的CA7S水平升高（圖1C）。與未處理小鼠相比，抗生素處理小鼠中CA7S的總體水平顯著降低（圖1B和1C）。由這些結(jié)果推測，微生物組是小鼠產(chǎn)生CA7S所必需的。為了研究這個問題，定量了傳統(tǒng)DIO小鼠、抗生素處理的DIO小鼠或GF DIO小鼠的CA7S。觀察到抗生素處理和GF小鼠腸道中CA7S的水平比完全定植小鼠中CA7S的水平低100-200倍（圖1D）。在抗生素處理和GF小鼠的肝臟中檢測不到CA7S水平（圖1E）。這些結(jié)果表明，CA7S的穩(wěn)健生產(chǎn)需要微生物組。在接受SG的DIO小鼠中觀察到GLP-1循環(huán)水平升高（圖1F）。然而，在SG前后使用抗生素治療DIO小鼠可消除SG介導(dǎo)的GLP-1分泌增加（圖1G）。這一結(jié)果表明，在體內(nèi)誘導(dǎo)SG介導(dǎo)的GLP-1分泌需要微生物組。

2 微生物組誘導(dǎo)哺乳動物肝臟合成CA7S

接下來試圖研究微生物組是否直接合成或修飾CA7S。為了確定常規(guī)組或SG小鼠的微生物組是否能夠合成CA7S，培養(yǎng)了這些小鼠盲腸糞便中的細(xì)菌，并通過UPLC-MS分析了得到的細(xì)菌培養(yǎng)物。沒有觀察到假盲腸細(xì)菌或SG盲腸細(xì)菌在孵育7天后合成CA7S。在存在CA7S的條件下培養(yǎng)細(xì)菌7天，未觀察到CA7S水解為CA，表明CA7S未被腸道細(xì)菌脫硫。觀察到盲腸細(xì)菌將TCA7S解離為CA7S。這些數(shù)據(jù)表明，微生物產(chǎn)生CA7S和微生物分解TCA7S均不能解釋在SG小鼠中觀察到的CA7S水平升高。    BA的磺化主要通過BA磺基轉(zhuǎn)移酶或SULTs在哺乳動物肝臟中發(fā)生（圖1H）。在小鼠中發(fā)現(xiàn)了三種BA-SULTs亞型（mSULT2A1、mSULT2A2和mSULT2A8），在人類中發(fā)現(xiàn)了一種亞型（hSULT2A）。SG后小鼠肝臟中mSult2A1亞型的表達(dá)水平更高，但mSult2A2或mSult2A8亞型的表達(dá)無差異（圖1I）。因此，SG后小鼠肝臟中mSult2A1的表達(dá)增加可能是SG小鼠CA7S產(chǎn)生增加的原因之一。與DIO小鼠相比，抗生素治療和GF小鼠肝臟中mSult2A1的表達(dá)水平顯著降低（圖1J）。這些結(jié)果表明，肝臟中mSULT2A1從CA產(chǎn)生CA7S需要一個微生物群。圖1 SG介導(dǎo)的CA7S和GLP-1水平升高需要微生物群。（A）使用或不使用抗生素治療的DIO小鼠SG和假手術(shù)示意圖（ABX）。（B和C）接受SG或假手術(shù)（使用或不使用抗生素）的小鼠盲腸內(nèi)容物中CA7S水平。（D和E）常規(guī)DIO小鼠盲腸內(nèi)容物（D）和肝臟（E）中CA7S水平顯著高于抗生素治療組（+ABX）。（F和G）接受或不接受抗生素治療的SG或假手術(shù)小鼠的體循環(huán)中GLP-1水平。（H）哺乳動物的磺基轉(zhuǎn)移酶SULT2A催化初級膽汁酸CA轉(zhuǎn)化為7-硫酸膽酸（CA7S）。（I）qRT-PCR定量測定小鼠肝臟中硫酸鹽膽汁酸報告的mSult2A亞型。（J）qRT-PCR檢測顯示，DIO組小鼠肝臟mSult2A1的表達(dá)顯著高于DIO+ABX組。
3 門靜脈BAs誘導(dǎo)肝臟磺基轉(zhuǎn)移酶mSult2A1/hSULT2A的表達(dá) BA通過肝腸再循環(huán)嚴(yán)格調(diào)節(jié)自身的合成和磺化?；贑A7S產(chǎn)生需要微生物組的發(fā)現(xiàn)，研究了細(xì)菌修飾的BA是否通過門靜脈轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟參與CA7S的產(chǎn)生。對術(shù)前用抗生素治療或未治療的常規(guī)組和SG組小鼠的門靜脈進(jìn)行了BA分析（圖2A）。兩組SG后小鼠門靜脈總BA水平與假手術(shù)對照組無顯著差異（圖2B和2C）。為了檢測SG后門靜脈BA是否可以誘導(dǎo)BA磺基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)以及這種誘導(dǎo)是否依賴于微生物組，建立了BA體外池，模擬在常規(guī)和抗生素治療的常規(guī)組和SG門靜脈中觀察到的平均生理比率（圖2D和2E）。然后，檢測了這些重組BA池誘導(dǎo)人肝HepG2細(xì)胞表達(dá)hSULT2A的能力。發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)的假BA池相比，傳統(tǒng)的SG門靜脈BA在體外顯著誘導(dǎo)hSULT2A表達(dá)，而與未處理的假門靜脈BA相比，用抗生素處理的假門靜脈BA孵育細(xì)胞后，hSULT2A表達(dá)顯著降低（圖2D–2F）。發(fā)現(xiàn)，在所有檢測濃度下，與抗生素處理的常規(guī)組相比，抗生素處理的SG小鼠的BA池未誘導(dǎo)hSULT2A表達(dá)（圖2E）。這些結(jié)果表明，SG后通過門靜脈從腸道再循環(huán)至肝臟的BA可誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá)hSULT2A，且該誘導(dǎo)具有微生物組依賴性。圖2 門靜脈BA在體外誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá)hSULT2A1。（A）指定組小鼠的門靜脈BA分析示意圖。（B）假手術(shù)和SG后6周DIO小鼠的門靜脈BA。（C）假手術(shù)后用抗生素治療的DIO小鼠和SG小鼠的門靜脈BA。（D-F）在二甲基亞砜（DMSO）中，體外產(chǎn)生了模擬在常規(guī)和SG以及抗生素處理Sham和SG小鼠中測得的單個門靜脈膽汁酸的平均生理比率的膽汁酸濃縮池。（D）qRT-PCR檢測，與常規(guī)假PV BA處理細(xì)胞相比，常規(guī)SG PV BA處理細(xì)胞中hSULT2A的表達(dá)增加。（E）用abx處理的SG和假PV BA池孵育的細(xì)胞中hSULT2A表達(dá)無顯著差異。（F）qRT-PCR檢測，相對于DMSO對照，常規(guī)假PV BA處理的細(xì)胞中hSULT2A的表達(dá)增加，抗生素假PVBA處理的細(xì)胞中hSULT2A的表達(dá)減少。
4 微生物代謝產(chǎn)物L(fēng)CA通過維生素D受體（VDR）誘導(dǎo)mSult2A1/hSULT2A的表達(dá) BA分析顯示，與未處理的完全定植小鼠相比，抗生素處理小鼠之間存在差異（圖2B和2C）。具體而言，4種BA——鵝去氧膽酸（CDCA）、?；?脫氧膽酸（TDCA）、CA和石膽酸（LCA）——在常規(guī)組和SG組小鼠的門靜脈中均有表達(dá)，而在抗生素治療組小鼠的門靜脈中未檢測到（圖2B和2C）。為了確定這些BA中的哪一種可以誘導(dǎo)mSult2A1/hSULT2A的表達(dá)，檢測了這四種分子誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞中hSULT2A表達(dá)的能力。LCA以劑量依賴性方式誘導(dǎo)hSULT2A表達(dá)，而在所有檢測濃度下，CDCA、TDCA和CA均未誘導(dǎo)hSULT2A表達(dá)（圖3A）。用LCA孵育鼠肝細(xì)胞（Hepa1-6）時，觀察到mSult2A1表達(dá)的相似誘導(dǎo)作用。研究結(jié)果表明微生物代謝產(chǎn)物L(fēng)CA通過門靜脈轉(zhuǎn)運(yùn)至SG后的肝臟，并誘導(dǎo)肝臟mSult2A1的表達(dá)。接下來試圖確定促進(jìn)LCA介導(dǎo)的SULT表達(dá)誘導(dǎo)的受體。已證明LCA與某些核激素受體結(jié)合，包括FXR或NR1H4、PXR或NR1l2、維生素D受體、CARorNR1l3和RORa或RORa和RORg或RORC，從而誘導(dǎo)SULTs表達(dá)。采取了一種候選方法來研究哪種受體負(fù)責(zé)LCA誘導(dǎo)hSULT2A。siRNA介導(dǎo)的VDR敲除顯著降低了HepG2細(xì)胞中LCA依賴的hSULT2A表達(dá)的增加，而敲除PXR、FXR、CAR、RORa和RORg并沒有顯著影響hSULT2A的表達(dá)（圖3B）。VDR活化導(dǎo)致肝細(xì)胞中VDR表達(dá)增加。SG小鼠的肝臟Vdr表達(dá)也高于假手術(shù)小鼠（圖3C）。此外，在GF小鼠的肝臟中，Vdr的表達(dá)水平降低了20倍，而在抗生素治療的動物中幾乎檢測不到Vdr的表達(dá)（圖3D）。這些數(shù)據(jù)表明肝臟中Vdr的表達(dá)也需要微生物組。最后，對Vdr敲除小鼠糞便的BA分析發(fā)現(xiàn)，與野生型（WT）動物相比，CA7S的水平顯著降低，證明Vdr是小鼠產(chǎn)生CA7S所必需的（圖3E）。為了進(jìn)一步測試所提出的LCA-VDR-SULT2A1CA7S通路在體內(nèi)是否可操作，我們將LCA（50 MM）直接注射到DIO小鼠的門靜脈（圖3F）。這一濃度與SG小鼠門靜脈中LCA的生理濃度相差一個數(shù)量級（圖2B）。門脈注射亞甲基藍(lán)導(dǎo)致染料分布到肝臟的所有葉，解剖學(xué)證明門脈注射LCA將導(dǎo)致幾乎所有肝細(xì)胞對配體的生物利用度。門靜脈注射LCA后2h，小鼠肝臟mSult2A1和Vdr1的表達(dá)水平顯著升高（圖3g和3h）。值得注意的是，我們觀察到膽囊中CA7S水平的增加，表明門靜脈注射LCA導(dǎo)致了CA7S的合成和隨后在膽囊中的積聚（圖3I）。總之，我們的結(jié)果表明，LCA是一種微生物代謝物，通過門靜脈從腸道轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟，并誘導(dǎo)肝臟中mSult2A1的表達(dá)和CA7S的產(chǎn)生。我們的數(shù)據(jù)還表明，SG后觀察到的CA7S水平的升高是由LCA誘導(dǎo)的Vdr激活介導(dǎo)的。為了進(jìn)一步測試所提出的LCA-VDR-SULT2A1CA7S通路在體內(nèi)是否可操作，將LCA直接注射到DIO小鼠的門靜脈（圖3F）。門靜脈注射LCA 2h后，小鼠肝臟mSult2A1和Vdr1的表達(dá)水平顯著升高（圖3G和3H）。觀察到膽囊中CA7S水平的增加，表明門靜脈注射LCA導(dǎo)致了CA7S的合成和隨后在膽囊中的積聚（圖3I）。結(jié)果表明，LCA是一種微生物代謝物，通過門靜脈從腸道轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟，并誘導(dǎo)肝臟中mSult2A1的表達(dá)和CA7S的產(chǎn)生。研究數(shù)據(jù)還表明，SG后觀察到的CA7S水平的升高是由LCA誘導(dǎo)的Vdr激活介導(dǎo)的。 5 LCA觸發(fā)的CA7S合成誘導(dǎo)腸內(nèi)分泌細(xì)胞分泌GLP-1 推測在人或鼠肝細(xì)胞中，LCA誘導(dǎo)的hSULT2A或mSult2A1表達(dá)增加將導(dǎo)致CA7S合成增加，進(jìn)而誘導(dǎo)GLP-1分泌。作為檢驗這一假說的第一步，研究了體外CA7S的合成。用CA7S的前體CA孵育HepG2細(xì)胞，導(dǎo)致CA肝細(xì)胞攝取增加，但未觀察到可檢測到的CA7S水平（圖3J）。加入作為SULTs磺酸鹽供體所需的輔因子PAPS導(dǎo)致肝細(xì)胞中產(chǎn)生CA7S（圖3J）。加入LCA導(dǎo)致CA7S生成顯著增加（圖3J）。此外，siRNA介導(dǎo)的Vdr敲除消除了LCA介導(dǎo)的CA7S合成增加，證明LCA需要VDR激活誘導(dǎo)hSULT2A表達(dá)和肝細(xì)胞產(chǎn)生CA7S（圖3J）。接下來在transwell環(huán)境中檢測了HepG2細(xì)胞合成的CA7S誘導(dǎo)人腸內(nèi)分泌L細(xì)胞（NCI-H716）分泌GLP-1的能力（圖3K）。下腸L細(xì)胞在TGR5活化后分泌GLP-1。將NCI-H716細(xì)胞與先前誘導(dǎo)合成CA7S的HepG2細(xì)胞共同孵育，導(dǎo)致GLP-1分泌顯著增加（圖3L）。最后，siRNA介導(dǎo)的VDR敲低（消除CA7S的合成）導(dǎo)致GLP-1分泌減少，表明Vdr的激活是CA7S介導(dǎo)的GLP-1分泌誘導(dǎo)所必需的（圖3L）。這些結(jié)果表明，LCA-VDR-SULT通路在肝腸軸中發(fā)揮作用，誘導(dǎo)CA7S生成，隨后誘導(dǎo)GLP-1分泌。圖3 LCA通過Vdr誘導(dǎo)SULT的表達(dá)，導(dǎo)致CA7S和GLP-1分泌的產(chǎn)生。（A）qRT-PCR定量hSULT2A的表達(dá)水平。（B）與陰性對照siRNA相比，siRNA介導(dǎo)的Vdr基因敲除顯著降低了LCA介導(dǎo)的hSULT2A在HepG2細(xì)胞中的誘導(dǎo)作用。（C）qRT-PCR結(jié)果顯示，與常規(guī)組相比，SG組小鼠肝臟Vdr表達(dá)水平升高。（D）DIO組小鼠肝臟Vdr表達(dá)較DIO+ABX組高。（E）Vdr基因敲除（KO）小鼠的糞便中CA7S水平低于WT小鼠。（F）門靜脈注射LCA示意圖（GB，膽囊）。（G和H）實時定量PCR定量檢測注射了LCA或PBS的小鼠肝臟中mSult2A1（G）和Vdr（H）的表達(dá)水平。（J）在HepG2細(xì)胞中合成CA7S需要輔因子PAPs，在與LCA孵育時被誘導(dǎo)，并依賴于Vdr。用Vdr siRNA抑制Vdr的表達(dá)。擊倒48h后，按指示加入底物CA和配體LCA。16h后用UPLC-MS定量檢測CA7S的產(chǎn)生。（K）共培養(yǎng)研究示意圖。肝細(xì)胞HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于基底側(cè)室，NCI-H716腸內(nèi)分泌細(xì)胞單獨培養(yǎng)于Transwell插入部，聯(lián)合檢測GLP-1分泌。（L）與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)的NCI-H716細(xì)胞可通過向肝細(xì)胞中加入LCA、CA和PAPS來誘導(dǎo)GLP-1的分泌，而通過siRNA介導(dǎo)的Vdr抑制肝細(xì)胞GLP-1的分泌。
初級BAs CA和CDCA通過梭狀芽孢桿菌簇XIV細(xì)菌的7α-脫羥基作用分別轉(zhuǎn)化為脫氧膽酸（DCA）和石膽酸（LCA）（圖4A）。由于SG后小鼠門靜脈LCA水平較高，假設(shè)SG后小鼠腸道細(xì)菌合成了更多的LCA。與假設(shè)相反，觀察到SG后小鼠盲腸中LCA水平顯著降低，而DCA和總BA水平保持不變。在接受SG的人類患者糞便樣本中觀察到相似的變化。這些結(jié)果表明，小鼠和人類的SG均導(dǎo)致結(jié)腸中細(xì)菌代謝物L(fēng)CA水平降低，與門靜脈中觀察到的增加形成鮮明對比。    為了研究SG后產(chǎn)生LCA的腸道細(xì)菌減少的結(jié)果，對常規(guī)組和SG組小鼠盲腸內(nèi)容物進(jìn)行了16SrRNA測序。與之前的研究一致，發(fā)現(xiàn)SG后小鼠的微生物組發(fā)生了變化，包括擬桿菌門和變形菌門的豐度增加（圖4B、4C）。盡管在SG后小鼠中產(chǎn)生LCA的梭狀芽孢桿菌的相對豐度較低，但該差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（圖4D）。對小鼠盲腸內(nèi)容物的分析表明，與常規(guī)組相比，SG組BECD基因的表達(dá)顯著降低（~100倍）（圖4E）。在人SG前和SG后糞便樣本中觀察到相似的門水平變化，與細(xì)菌拷貝數(shù)、Shannon多樣性或Chao物種豐富度的變化無關(guān)，結(jié)果也與既往研究一致（圖4F、4G）。在人類患者中，SG后糞便樣本中梭狀芽孢桿菌的相對豐度顯著較低（圖4H）。之前的工作也表明，減肥手術(shù)可減少腸道梭狀芽孢桿菌。結(jié)果證明SG后微生物組的變化導(dǎo)致小鼠和人類腸道中LCA的合成減少。圖4 小鼠和人SG后次級膽汁酸LCA生成減少。（A）宿主產(chǎn)生的結(jié)合膽汁酸在餐后釋放到腸道中，并通過腸道細(xì)菌的酶活性轉(zhuǎn)化為次級膽汁酸。通過細(xì)菌膽鹽水解酶解離，然后通過膽汁酸誘導(dǎo)（bai）操縱子編碼的酶進(jìn)行7a-脫羥基化，可將CDCA分別轉(zhuǎn)化為脫氧膽酸（DCA）和石膽酸（LCA）。（B）進(jìn)行16S測序的假手術(shù)和SG小鼠盲腸樣本的示意圖和時間線。（C）堆疊條形圖顯示小鼠樣本中門水平分類群的平均相對豐度。（D）常規(guī)組和SG小鼠中梭狀芽孢桿菌的相對豐度。（E）用細(xì)菌16S核糖體DNA標(biāo)準(zhǔn)化的常規(guī)組和SG組小鼠盲腸內(nèi)容物中baiCD基因簇表達(dá)水平的qRT-PCR定量。（F）進(jìn)行16S測序的人SG前和SG后糞便樣本的示意圖和時間線。（G）堆疊條形圖顯示人類樣本中門水平分類群的平均相對豐度。（H）SG前后人糞便中梭狀芽孢桿菌的相對豐度。
6 BA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Asbt和Ostα在SG后小鼠回腸中過表達(dá)    在SG后門靜脈LCA水平升高，但在胃腸道（GI）降低，研究了BA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在促進(jìn)LCA選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入門靜脈循環(huán)中的影響。此外，通過與回腸BA結(jié)合蛋白（I-BABP或FABP6）直接結(jié)合，促進(jìn)BA從腸上皮頂側(cè)至基底外側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)（圖5A）。通過qPCR定量了常規(guī)組和SG小鼠遠(yuǎn)端回腸中BA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與常規(guī)組相比，SG后小鼠回腸中Asbt和Ostα的表達(dá)顯著升高（圖5B）。因此，SG似乎增加了參與BA轉(zhuǎn)運(yùn)至門靜脈的蛋白表達(dá)。 7 LCA在腸上皮細(xì)胞中優(yōu)先被Asbt轉(zhuǎn)運(yùn)     鑒于觀察到SG小鼠門靜脈LCA增加，假設(shè)Asbt和Ostα表達(dá)增加誘導(dǎo)LCA從腸道主動吸收進(jìn)入門靜脈循環(huán)。為了驗證這一假設(shè)，測量了人腸Caco-2細(xì)胞中BA的轉(zhuǎn)運(yùn)，這些細(xì)胞已分化為具有細(xì)胞間緊密連接和刷狀緣微絨毛的極化單層細(xì)胞（圖5C）。該體外腸模型系統(tǒng)已用于研究小分子通過腸上皮的胞吞作用。 LCA通過腸上皮特異性轉(zhuǎn)運(yùn)，將確定的主要腸道BA混合物加入transwell中分化的Caco-2細(xì)胞的頂端，使用UPLC-MS在12和24h測量主動轉(zhuǎn)運(yùn)到基底外側(cè)室（圖5D）。加入了在小鼠和人類腸道中發(fā)現(xiàn)的豐富的初級BA，在transwell小室頂端側(cè)的濃度均為10 mM）（圖5D）。發(fā)現(xiàn)在12和24h，LCA的總轉(zhuǎn)運(yùn)顯著高于DCA，表明單個BA分子可以具有不同的轉(zhuǎn)運(yùn)動力學(xué)。接下來，對12h內(nèi)BA轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行了時程分析，以研究LCA在早期時間點的轉(zhuǎn)運(yùn)是否更有效。與以前的結(jié)果相似，LCA似乎并不比其他BA通過上皮單層更有效地轉(zhuǎn)運(yùn)（圖5E和5F）。然而，siRNA介導(dǎo)的Asbt和/或Osta敲除特異性地消除了LCA和TCA跨上皮單層的轉(zhuǎn)運(yùn)，表明LCA和TCA需要表達(dá)Asbt和Ostα進(jìn)行胞吞作用（圖5E、5F）。此外，通過用特異性MEK抑制劑U0126處理分化的Caco-2細(xì)胞過表達(dá)Asbt導(dǎo)致LCA通過單層細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)增加（圖5E、5F）。重要的是，Asbt過表達(dá)后，無其他BA顯示轉(zhuǎn)運(yùn)增加（圖5E、5F）。這些結(jié)果表明，SG小鼠回腸中ASbt和Ostα水平升高導(dǎo)致LCA選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)至門靜脈增加。圖5 腸道BA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Asbt和Ostα促進(jìn)LCA選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)至門靜脈。（A）參與BA從腸腔轉(zhuǎn)運(yùn)至門靜脈的蛋白示意圖。（B）用小鼠核糖體18S標(biāo)準(zhǔn)化的常規(guī)組和SG小鼠遠(yuǎn)端回腸中BA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)水平的qRT-PCR定量。（C）transwell中未分化和分化Caco-2細(xì)胞的SEM圖像。（D）BA轉(zhuǎn)運(yùn)研究示意圖。（E和F）通過UPLCMS測定，12h內(nèi)指定BA從頂室穿過分化的Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至基底室。（F）中的曲線下面積圖對應(yīng)于（E）正上方。
8 較低水平的LCA post-SG導(dǎo)致Asbt表達(dá)增加 為了進(jìn)一步研究LCA在小鼠門靜脈中升高但在小鼠盲腸和人SG后糞便中降低的結(jié)果，檢查了BAs對Asbt（主要的BA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）表達(dá)的影響。已證明BAs可調(diào)節(jié)腸細(xì)胞中Asbt的表達(dá)。假設(shè)LCA減少促進(jìn)SG中Asbt表達(dá)增加（圖6A）。為了驗證這一假說，將Caco-2細(xì)胞與模擬常規(guī)組和SG組盲腸糞便中觀察到的平均生理濃度的BA體外池共同孵育。然后，我們檢測了這些重組BA池誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞表達(dá)Asbt的能力。發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)組相比，SG盲腸BA在體外顯著誘導(dǎo)Asbt表達(dá)（圖6B）。此外，用生理相關(guān)濃度的LCA（100 mM）孵育Caco-2細(xì)胞可顯著抑制Asbt表達(dá)，而不影響細(xì)胞活力（圖6C）。這些結(jié)果共同表明，SG后腸道LCA水平下降導(dǎo)致Asbt表達(dá)增加，從而導(dǎo)致門靜脈LCA水平增加（圖6A）?；谠隗w外觀察到微生物代謝產(chǎn)物L(fēng)CA抑制Asbt的表達(dá)，假設(shè)LCA在體內(nèi)也足以抑制Asbt的表達(dá)。為了驗證這一假設(shè)，給GF小鼠灌胃0.3%的LCA，為期7天（圖6D）。這種治療導(dǎo)致LCA在整個胃腸道積聚（圖6E）。飼喂LCA可顯著抑制下消化道Asbt的表達(dá)（圖6F），說明LCA在體內(nèi)抑制Asbt的表達(dá)。盡管Asbt在下胃腸道中的表達(dá)被抑制，發(fā)現(xiàn)在腸道中引入LCA足以觸發(fā)LCA-VDR-SULT通路并誘導(dǎo)CA7S的產(chǎn)生（圖6G和6H）。該效應(yīng)可能是由于引入了高濃度的LCA（圖6E）和腸道中存在的現(xiàn)有Asbt水平，盡管Asbt基因表達(dá)受到抑制，但仍能夠?qū)CA轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟。觀察到CA7S在喂食LCA的GF小鼠膽囊和胃腸道中蓄積（圖6G）。LCA-小鼠的肝臟mSult2A1表達(dá)水平顯著較高（圖6H）。與對照組小鼠相比，Vdr的表達(dá)也增加，盡管差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（圖6H）。因此，盡管LCA降低了這些動物的Asbt表達(dá)，但LCA飼喂能夠誘導(dǎo)肝臟合成CA7S?？傊@些結(jié)果表明LCA足以誘導(dǎo)GF小鼠產(chǎn)生CA7S。

圖6 LCA足以抑制Asbt表達(dá)并誘導(dǎo)CA7S的產(chǎn)生。（A）由梭狀芽孢桿菌產(chǎn)生LCA調(diào)節(jié)的假腸和SG腸BA轉(zhuǎn)運(yùn)示意圖。（B）BAS的假盲腸池與SG盲腸池相比抑制了Asbt的表達(dá)。（C）LCA（100 mM）可抑制Caco-2細(xì)胞中Asbt的表達(dá)。（D）在采集用于分析的組織前，給予含0.3%LCA（w/w）的飼料1周的GF小鼠示意圖。（E）LCA喂養(yǎng)導(dǎo)致LCA在GF小鼠的近端小腸（SI）、遠(yuǎn)端回腸（DI）和盲腸中蓄積。（F）LCA抑制SI和DI中Asbt的表達(dá)。（G）在GF小鼠體內(nèi)引入LCA可誘導(dǎo)膽囊（GB）和DI。（H）飼喂LCA使飼喂0.3%LCA的小鼠肝臟mSult2A1和Vdr的表達(dá)增加。

9 SG微生物區(qū)系移植重現(xiàn)GF動物的CA7S途徑為了檢測SG菌群是否能在體內(nèi)觸發(fā)門LCA轉(zhuǎn)運(yùn)和LCA-VDR-SULT通路的增加，對常規(guī)組和SG組小鼠進(jìn)行了CMT進(jìn)入GF動物。對常規(guī)組和SG小鼠術(shù)后6周的盲腸糞便進(jìn)行厭氧勻漿，并灌胃至喂食高脂飼料的GF小鼠中（圖7A）。常規(guī)化后2周，處死常規(guī)組-CMT和SG-CMT小鼠。為了檢測受體動物微生物群的LCA產(chǎn)生能力是否反映了供體的LCA產(chǎn)生能力，測定了兩個隊列盲腸糞便中微生物baiCD的表達(dá)。與以前的觀察相似，與常規(guī)組動物相比，SG供體的baiCD表達(dá)水平顯著降低。該效應(yīng)也轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的CMT受體（圖7B和7C）。與常規(guī)組-CMT相比，SG-CMT動物的盲腸LCA水平較低，DCA或總BA水平無變化，與之前在常規(guī)組和SG小鼠中的觀察結(jié)果相似（圖7D）。總之，這些結(jié)果表明，成功地用常規(guī)組和SG組小鼠的盲腸菌群常規(guī)化了GF小鼠。接下來，研究了SG小鼠的CMT是否在體內(nèi)重建了LCA-VDR-SULT-CA7S通路。與體外結(jié)果顯示LCA抑制Asbt和Ostα表達(dá)一致，與常規(guī)組-CMT相比，SG-CMT小鼠遠(yuǎn)端回腸中Asbt和Ostα表達(dá)水平顯著較高（圖7E）。此外，觀察到與常規(guī)組-CMT相比，SG-CMT小鼠的LCA門靜脈轉(zhuǎn)運(yùn)增加，而兩個隊列的其他門靜脈BA水平相當(dāng)（圖7F）。這些數(shù)據(jù)表明，SG微生物組誘導(dǎo)LCA通過門靜脈從腸道轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟的增加。與常規(guī)組-CMT相比，SG-CMT小鼠表現(xiàn)出顯著更高水平的肝臟Vdr和mSult2A1表達(dá)（圖7G）。還觀察到SG-CMT動物盲腸內(nèi)容物中CA7S水平顯著增加，證明與常規(guī)組-CMT相比，SG微生物群足以觸發(fā)CA7S生成增加（圖7H）。先前的研究表明，CA7S的積累誘導(dǎo)下消化道Tgr5表達(dá)增加，循環(huán)中GLP-1水平增加。SG-CMT組的GLP-1水平比常規(guī)組-CMT組高50%，但差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性（圖7I）。觀察到與常規(guī)組-CMT小鼠相比，SG-CMT動物遠(yuǎn)端回腸中Tgr5表達(dá)顯著增加，表明SG后微生物組在本實驗的時間范圍內(nèi)增加了Tgr5表達(dá)（圖7J）?？傊@些數(shù)據(jù)表明微生物組足以觸發(fā)LCA-VDR-SULT-CA7S通路和隨后的Tgr5誘導(dǎo)（圖7K）。更廣泛地說，這項研究表明，腸道菌群產(chǎn)生的一種小分子調(diào)節(jié)宿主代謝途徑，可能有助于改善SG后糖尿病。圖7 SG微生物群轉(zhuǎn)移在GF小鼠中重建了CA7S通路。（A）CMT示意圖。（B和C）qRT-PCR定量檢測供體常規(guī)組和SG小鼠盲腸內(nèi)容物（B）和受體常規(guī)組-CMT和SG-CMT小鼠盲腸內(nèi)容物（C）中白CD基因簇的表達(dá)量。（D）SG-CMT組小鼠盲腸內(nèi)容物中LCA水平低于Sham-CMT組小鼠。（E）qRT-PCR定量檢測常規(guī)組-CMT和SG-CMT小鼠DI中BA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)水平。（F）常規(guī)組-CMT和SG-CMT小鼠門靜脈LCA。（G）qRT-PCR定量檢測常規(guī)組-CMT和SG-CMT小鼠肝臟中mSult2A1和Vdr的表達(dá)水平。（H）SG-CMT小鼠盲腸內(nèi)容物中CA7S水平高于常規(guī)組-CMT小鼠。（I）SG-CMT（盲腸微生物移植）組小鼠血清GLP-1水平高于常規(guī)組-CMT組。（J）qRT-PCR定量檢測TGR5在常規(guī)組-CMT和SG-CMT小鼠回腸遠(yuǎn)端（DI）中的表達(dá)水平。（K）SG后LCA介導(dǎo)的CA7S合成和下游GLP-1分泌的模型。

討論

肥胖和肥胖相關(guān)的2型糖尿病是影響多器官和全身穩(wěn)態(tài)的全身代謝性疾病。最近的研究發(fā)現(xiàn)，肥胖相關(guān)疾病具有不同的代謝組學(xué)指紋，特別是與微生物組和微生物衍生代謝物的變化相關(guān)。減肥手術(shù)已被證明可以模擬與健康腸道相關(guān)的代謝組和微生物組，從而改變這種與肥胖相關(guān)的代謝組指紋。研究SG等減肥手術(shù)如何能夠?qū)C(jī)體進(jìn)行分子和代謝重編程，將有助于發(fā)現(xiàn)能夠模擬這些手術(shù)干預(yù)效果的新型治療方法。

在這項研究中，發(fā)現(xiàn)腸道細(xì)菌通過一種細(xì)菌來源的分子通過門靜脈從腸道轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟與宿主進(jìn)行交流。通過門靜脈轉(zhuǎn)運(yùn)的腸道代謝物構(gòu)成了肝臟暴露的分子環(huán)境的重要部分。在以前的工作中，確定了CA7S，一種腸道限制性TGR5激動劑，可以改善體內(nèi)高血糖。在這項工作中，確定一種微生物介導(dǎo)的機(jī)制，通過BA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Asbt和Ostα將微生物來源的LCA直接轉(zhuǎn)運(yùn)到門靜脈，驅(qū)動肝臟中CA7S的合成。最近的一項研究發(fā)現(xiàn)，人類糞便微生物定植于GF小鼠可導(dǎo)致宿主產(chǎn)生的CA7S增加4倍。此外，已證明抑制門靜脈中BA轉(zhuǎn)運(yùn)可損害葡萄糖耐量、胰島素敏感性和GLP-1分泌。因此，本文所述途徑表明，肝腸軸中微生物代謝物的交換可能是介導(dǎo)具有功能性微生物組的動物減肥手術(shù)抗糖尿病獲益的促成因素之一。

本項研究表明，Asbt表達(dá)的增加可以選擇性地增加LCA在門靜脈中的轉(zhuǎn)運(yùn)。然而，腸道上皮的轉(zhuǎn)胞作用只是體內(nèi)BA整體肝腸循環(huán)的一步。吸收后，BA與門靜脈血中的血清白蛋白結(jié)合，并通過肝臟中的BA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從血液中提取。在BA中，LCA對血清白蛋白結(jié)合BA的親和力最大，在肝腸循環(huán)中轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟。從門靜脈血液至肝細(xì)胞的提取效率差異需要進(jìn)一步研究。

研究數(shù)據(jù)表明，SG后微生物組的變化，特別是梭狀芽孢桿菌的減少，導(dǎo)致LCA的產(chǎn)生減少，通過跨器官途徑放大流量，最終導(dǎo)致葡萄糖調(diào)節(jié)化合物CA7S的產(chǎn)生增加。觀察到SG小鼠的CMT在GF受體小鼠中重建了LCA-VDR-SULT2A1-CA7S通路。具體而言，SG-CMT導(dǎo)致門靜脈LCA增加，鼠肝臟Vdr和mSult2A1表達(dá)增加，膽囊CA7S水平增加。此外，LCA-VDRSULT2A-CA7S-GLP-1通路在體外人腸和肝細(xì)胞中可操作。考慮到與SG小鼠相似，人SG后糞便也顯示梭菌水平降低、LCA水平降低和CA7S水平升高，研究者認(rèn)為LCA-VDR-SULT2A-CA7S-GLP-1通路有助于SG對人類患者的葡萄糖調(diào)節(jié)獲益是合理的。未來在SG患者中的研究可能有助于確定本文描述的途徑在人類中可操作，可能為未來治療T2D的療法鋪平道路。

最后，影響宿主代謝和信號傳導(dǎo)的其他細(xì)菌產(chǎn)生或修飾分子也直接通過門靜脈轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，包括短鏈脂肪酸、維生素和碳水化合物。最近的工作已經(jīng)證明了小腸微生物組在影響這些分子的生成和吸收中的作用。未來在CA7S產(chǎn)生和SG更普遍的背景下對小腸宿主-微生物相互作用的研究可能為減肥手術(shù)后代謝表型改善的機(jī)制基礎(chǔ)提供進(jìn)一步的見解。這項研究為將功能性微生物組和微生物代謝物與宿主代謝聯(lián)系起來的一種機(jī)制提供了證據(jù)，說明了研究代謝物在肝腸軸中轉(zhuǎn)運(yùn)和信號傳導(dǎo)的重要性。

網(wǎng)址: 科研 http://m.u1s5d6.cn/newsview17349.html