本發(fā)明涉及一種菌酶復(fù)配制備火麻蛋白肽及其在精釀啤酒的釀造中的應(yīng)用，屬于啤酒加工。

背景技術(shù)：

1、紅曲多糖作為真菌多糖的一類，最早于1988年被田軍從紫紅曲霉(monascuspurpureus)935菌株發(fā)酵液中分離發(fā)現(xiàn)，通過凝膠柱層析進(jìn)行分離純化得到胞外多糖，分部收集后，洗脫曲線為單一對稱洗脫峰，采用苯酚-硫酸法測定，顯色，結(jié)合紙層析表明組分均一且純度較好，且基本確定了紅曲多糖的分子量，約為40萬；通過硅膠薄層層析測定單糖組成由甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，其摩爾比為1:2:4，從單糖組成，可定義其為雜聚糖；通過氣相色譜、紅外光譜，核磁共振氫譜等色譜與光譜技術(shù)，該多糖分子中是以β(1→3)位糖苷鍵為主，同時含有1→6和1→2位糖苷鍵，根據(jù)有無支鏈，可將多糖分為直鏈多糖與支鏈多糖，而多糖支鏈的豐度在多糖免疫學(xué)性質(zhì)的研究中較為重要，通常支鏈豐度較高的β(1→3)葡聚糖生物活性較強(qiáng)，β(1→3)葡聚糖由β型葡萄糖聚合形成，較易卷曲形成螺旋結(jié)構(gòu)，其功能性較為顯著。

2、張建峰通過dth試驗(yàn)和碳粒廓清試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)紅曲多糖(來自紅曲as 3.4701)能提高小鼠細(xì)胞免疫功能和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬能力，促使小鼠外周血e-玫瑰環(huán)形成，增加體內(nèi)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，使非特異性免疫加強(qiáng)。淋巴細(xì)胞臟體指數(shù)以及脾臟抗體生成細(xì)胞檢測結(jié)果表明，紅曲多糖對小鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫有一定的增強(qiáng)作用。tseng等發(fā)現(xiàn)紅曲山藥多糖(rmrp)和紅曲米多糖(rmdp)對raw264.7細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)和抗氧化作用，山藥多糖和紅曲米多糖還具有抗氧化和免疫調(diào)節(jié)的潛力，可以開發(fā)為新的膳食補(bǔ)充劑，紅曲ntu 568發(fā)酵的大米和山藥在體內(nèi)外都具有保健功能。綜上所述，紅曲作為中國傳統(tǒng)的藥食兩用真菌，富含生物活性化合物，如紅曲多糖等。

3、目前，國內(nèi)對火麻仁的研究和利用主要集中在火麻仁油的提取和利用上，通常都是將火麻仁榨油，渣滓用作動物飼料，造成大量的資源浪費(fèi)?；鹇槿手械鞍踪|(zhì)的含量較高，還含有多種氨基酸，對火麻仁進(jìn)行深加工，充分利用其營養(yǎng)成分，有利于火麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。飲料作為一種人們喜愛的飲品，通常糖分高，蛋白含量低，添加劑多，多飲不利于身體健康，而開發(fā)出一種具有保健價值的火麻啤酒，有利于人體健康，還能有效促進(jìn)火麻業(yè)的健康發(fā)展，提高農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。

4、啤酒是以麥芽為主要原料，并添加啤酒花，經(jīng)過液態(tài)糊化和糖化，再經(jīng)過液態(tài)發(fā)酵釀制而成。它富含多種氨基酸、維生素、低分子糖、無機(jī)鹽和多種酶，是一種低濃度酒精飲料。但人們生活水平的不斷提高，傳統(tǒng)啤酒已經(jīng)難以滿足他們的需求，開發(fā)不同風(fēng)味和功能性營養(yǎng)需求的啤酒是目前啤酒釀造領(lǐng)域的一個重要研究方向。

5、發(fā)明人前期研發(fā)了一種火麻蛋白肽精釀啤酒，主要是通過中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶對火麻蛋白進(jìn)行酶解提取，發(fā)現(xiàn)酶解提取后，釀造得到的精釀啤酒中的蛋白質(zhì)只有68％；還是存在火麻蛋白肽中小分子蛋白肽數(shù)量不多的問題，同時采用之前的方法得到的火麻蛋白肽中的蛋白質(zhì)的含量不夠，導(dǎo)致釀造后得到的精釀啤酒的蛋白的含量也比較低，因此，本發(fā)明需要解決如何得到一種高小分子蛋白肽含量的火麻蛋白肽。

6、并且現(xiàn)有的研究都只是幾種在火麻蛋白肽精釀啤酒上，而一種富含胞外多糖的火麻蛋白肽極少有人研究，并且，如何設(shè)計(jì)工藝，既能實(shí)現(xiàn)在不影響火麻蛋白肽自身功能，又能增加胞外多糖的含量的情況下，得到一種富含胞外多糖的火麻蛋白肽，并且采用火麻蛋白肽制備精釀啤酒，是亟待解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種火麻蛋白肽的制備方法，所述方法包括以下步驟：

2、(1)將火麻蛋白添加至無菌營養(yǎng)液中，所述火麻蛋白的終濃度為5～7g/100ml，無菌營養(yǎng)液為0.3～0.4g/100ml的葡萄糖、3～4g/100ml的麩皮、無菌水；

3、(2)將紫色紅曲菌或瑞士乳桿菌按照體積比為10～15％(v/v)的接種量，接種至步驟(1)得到的混合物中進(jìn)行發(fā)酵；

4、(3)發(fā)酵結(jié)束后，滅菌，對滅菌后的發(fā)酵物進(jìn)行熱水?dāng)嚢杞?，固液比?:10～15，提取溫度為50～55℃，在15～25kv/cm的電場強(qiáng)度下處理500～1500μs后，進(jìn)行射流空化處理，處理，條件為：在溫度50～55℃、常壓條件下處理5～20min，射流空化處理后繼續(xù)在50～55℃條件提取90～110min，離心去除沉淀，收集上清；獲得火麻蛋白肽粗提液；

5、(4)對火麻蛋白肽粗提液過濾除渣，采用活性炭進(jìn)行脫色、脫苦，然后離心去除雜質(zhì)，最后將去除雜質(zhì)后的多肽液真空下濃縮后噴霧干燥，收集成品即為火麻活性肽。

6、在一種實(shí)施方式中，所述紫色紅曲菌添加的是紫色紅曲菌懸液，菌濃為：1～5×109個/ml在一種實(shí)施方式中，所述紫色紅曲菌懸液的制備方法為：

7、將紫色紅曲菌劃線于麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上，30～35℃培養(yǎng)5～7d，培養(yǎng)至紅曲菌長出孢子。往上述麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基中注入無菌水，并利用無菌接種環(huán)刮取培養(yǎng)基表面菌絲，轉(zhuǎn)移至裝有無菌水的三角瓶中，150～200r/min，震蕩2～30min，打散孢子，再用4層紗布將其過濾到新的50ml的三角瓶中，制得孢子懸浮液。用無菌水稀釋并調(diào)整孢子濃度為1×109個/ml，得到孢子懸液。

8、在一種實(shí)施方式中，所述瑞士乳桿菌添加的是瑞士乳桿菌懸液，菌濃為1～5×109cfu/ml在一種實(shí)施方式中，所述瑞士乳桿菌懸液的制備方法為：

9、將-80℃下保存的菌株接種到mrs培養(yǎng)基中，35～37℃厭氧下活化培養(yǎng)16～18h，活化三代后，取瑞士乳桿菌在mrs液體培養(yǎng)基中，于35～37℃厭氧下培養(yǎng)24～36h，于4℃、6000×g離心3min收集菌體，棄去上清并無菌水重懸菌體，使菌濃度達(dá)到1×109cfu/ml，制備得到菌懸液。

10、在一種實(shí)施方式中，步驟(2)為，將紫色紅曲菌或瑞士乳桿菌按照體積比為10～15％(v/v)的接種量，接種至步驟(1)得到的混合物中，同時添加木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶或菠蘿蜜蛋白酶進(jìn)行發(fā)酵。

11、在一種實(shí)施方式中，步驟(2)中的發(fā)酵條件為：當(dāng)采用紫色紅曲菌進(jìn)行發(fā)酵時，發(fā)酵條件為：30～35℃，120～150r/min，發(fā)酵時間至少48h；

12、當(dāng)采用瑞士乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵時，發(fā)酵條件為：35～37℃，發(fā)酵時間至少48h。

13、在一種實(shí)施方式中，所述木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶或菠蘿蜜蛋白酶的添加量為：7000～10000u/g火麻蛋白。

14、在一種實(shí)施方式中，步驟(1)中，所述火麻蛋白的制備方法包括：

15、(1)將火麻仁45～50℃烘干、粉碎、超臨界脫脂后，得到火麻仁粉，取脫脂后的火麻仁粉以1：10～15的重量比加入水，用膠體磨研磨兩遍進(jìn)行勻漿，得到勻漿液；

16、(2)將得到的勻漿液高壓脈沖電場預(yù)處理：向勻漿液加入食用堿，調(diào)整ph為10.0，在15～25kv/cm的電場強(qiáng)度下處理500～1500μs后，得到懸浮液；

17、(3)射流空化預(yù)處理：將經(jīng)步驟(2)處理后的懸浮液體系進(jìn)行射流空化處理，處理?xiàng)l件為：在溫度50～60℃、常壓條件下處理5～20min；

18、(4)射流空化預(yù)處理后，繼續(xù)在50～60℃條件下堿提，提取時間為1.5～2小時，提取結(jié)束后，用檸檬酸調(diào)ph為4.0～4.5進(jìn)行沉降，沉降后的蛋白反復(fù)水洗至中性后，進(jìn)行真空冷凍干燥，得火麻蛋白。

19、本發(fā)明還提供了一種火麻蛋白肽，所述火麻蛋白肽是按照下述方法制備得到的：

20、(1)將火麻蛋白添加至無菌營養(yǎng)液中，所述火麻蛋白的終濃度為5～7g/100ml，無菌營養(yǎng)液為0.3～0.4g/100ml的葡萄糖、3～4g/100ml的麩皮、無菌水；

21、(2)將紫色紅曲菌或瑞士乳桿菌按照體積比為10～15％(v/v)的接種量，接種至步驟(1)得到的混合物中進(jìn)行發(fā)酵；

22、(3)發(fā)酵結(jié)束后，滅菌，對滅菌后的發(fā)酵物進(jìn)行熱水?dāng)嚢杞?，固液比?:10～15，提取溫度為50～55℃，在15～25kv/cm的電場強(qiáng)度下處理500～1500μs后，進(jìn)行射流空化處理，處理，條件為：在溫度50～55℃、常壓條件下處理5～20min，射流空化處理后繼續(xù)在50～55℃條件提取90～110min，離心去除沉淀，收集上清；獲得火麻蛋白肽粗提液；

23、(4)對火麻蛋白肽粗提液過濾除渣，采用活性炭進(jìn)行脫色、脫苦，然后離心去除雜質(zhì)，最后將去除雜質(zhì)后的多肽液真空下濃縮后噴霧干燥，收集成品即為火麻活性肽。

24、在一種實(shí)施方式中，步驟(2)為，將紫色紅曲菌或瑞士乳桿菌按照體積比為10～15％(v/v)的接種量，接種至步驟(1)得到的混合物中，同時添加木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶或菠蘿蜜蛋白酶進(jìn)行發(fā)酵。

25、在一種實(shí)施方式中，步驟(2)中的發(fā)酵條件為：當(dāng)采用紫色紅曲菌進(jìn)行發(fā)酵時，發(fā)酵條件為：30～35℃，120～150r/min，發(fā)酵時間至少48h；

26、當(dāng)采用瑞士乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵時，發(fā)酵條件為：35～37℃，發(fā)酵時間至少48h。

27、在一種實(shí)施方式中，所述木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶或菠蘿蜜蛋白酶的添加量為：7000～10000u/g火麻蛋白。

28、在一種實(shí)施方式中，步驟(1)中，所述火麻蛋白的制備方法包括：

29、(1)將火麻仁45～50℃烘干、粉碎、超臨界脫脂后，得到火麻仁粉，取脫脂后的火麻仁粉以1：10～15的重量比加入水，用膠體磨研磨兩遍進(jìn)行勻漿，得到勻漿液；

30、(2)將得到的勻漿液高壓脈沖電場預(yù)處理：向勻漿液加入食用堿，調(diào)整ph為10.0，在15～25kv/cm的電場強(qiáng)度下處理500～1500μs后，得到懸浮液；

31、(3)射流空化預(yù)處理：將經(jīng)步驟(2)處理后的懸浮液體系進(jìn)行射流空化處理，處理?xiàng)l件為：在溫度50～60℃、常壓條件下處理5～20min；

32、(4)射流空化預(yù)處理后，繼續(xù)在50～60℃條件下堿提，提取時間為1.5～2小時，提取結(jié)束后，用檸檬酸調(diào)ph為4.0～4.5進(jìn)行沉降，沉降后的蛋白反復(fù)水洗至中性后，進(jìn)行真空冷凍干燥，得火麻蛋白

33、本發(fā)明還提供了上述方法或上述方法制備得到的火麻蛋白肽或上述火麻蛋白肽在制備精釀啤酒中的應(yīng)用。

34、本發(fā)明還提供了一種火麻蛋白肽精釀啤酒的制備方法，所述方法包括以下步驟：

35、(1)在糊化鍋中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5～1.0％的燕麥片、20～40mlα-耐高溫淀粉酶、水，1～5℃/min的升溫速度階梯式升溫至98℃，得醪液；

36、(2)按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加10～15份的加麥麥芽、40～45份澳麥麥芽、35～40份小麥芽麥芽，加入粉碎機(jī)內(nèi)粉碎，獲得粉碎混料；

37、向糖化鍋中加水，待溫度升至40～45℃時加入上述粉碎混料，同時，添加添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.08～0.1％的檸檬酸、0.007～0.01％的乳酸、0.09～0.1％的硫酸鈣、0.15～0.2iu/g的木聚糖酶、1.5～2.0iu/g的β-葡聚糖復(fù)合酶；保溫10～15min，再升溫至50～55℃，保溫15～20分鐘后，將糊化鍋的醪液導(dǎo)入糖化鍋中，攪拌，升溫至68～72℃，保溫25～30分鐘；碘試合格后升溫至70～80℃后，結(jié)束糖化；將糖化完成后的糖化液過濾，收集原汁；洗糟后合并收集的麥芽汁，洗槽后，洗糟殘?zhí)?.5°p以上；合并原汁和洗槽后的麥芽汁；

38、(3)向步驟(2)收集得到的麥芽汁中加入硫酸鈣、氯化鈣，攪拌均勻，將澄清的麥芽汁升溫至沸騰后，分三次加入酒花，沸騰10～15min后，添加麥芽汁質(zhì)量的0.1％～0.25％的saaz香花，沸騰20～25min后，再次添加麥芽汁質(zhì)量的0.5％～0.75％的啤酒花，煮沸20～25min，最后添加麥芽汁質(zhì)量的0.1％～0.3％的saaz香花，繼續(xù)煮沸5～10min，然后冷卻，降溫；

39、(4)沉淀、過濾后，向麥芽汁中充氧，充氧量9-10mg/l，滿罐釀酒酵母添加量1000-1100萬/ml；

40、(5)主發(fā)酵：將加入釀酒酵母的麥芽汁輸送至發(fā)酵罐中，封罐發(fā)酵(控溫18～20℃)，當(dāng)雙乙酰0.09mg/l，發(fā)酵度63-65％時，主發(fā)酵結(jié)束；

41、(6)主發(fā)酵結(jié)束后，向發(fā)酵罐中添加權(quán)利要求1～5任一所述的方法制備得到的火麻蛋白肽或權(quán)利要求6所述的火麻蛋白肽，添加量為1～2％；添加后進(jìn)行降溫、冷儲，冷儲45-60天后，采用離心機(jī)進(jìn)行離心，濾酒后的酒中酵母數(shù)800-1000萬/ml；

42、冷儲45-60天后，采用離心機(jī)進(jìn)行離心后，包裝成品。

43、在一種實(shí)施方式中，所述啤酒花為saaz啤酒花；所述α-耐高溫淀粉酶的酶活為2萬u/ml。

44、本發(fā)明還提供了上述制備方法制備得到的火麻蛋白肽精釀啤酒。

45、有益效果

46、(1)本發(fā)明采用高壓脈沖電場結(jié)合射流空化處理后，極大的提高了蛋白的溶解度和菌株發(fā)酵性能，并且，紫色紅曲菌和瑞士乳桿菌發(fā)酵后的火麻活性肽的dpph清除率分別提高至85.2％和84.3％；

47、(2)本發(fā)明采用能夠產(chǎn)多樣蛋白酶的菌株：枯草芽胞桿菌、米曲霉、解淀粉芽胞桿菌解淀粉亞種、紫色紅曲菌、瑞士乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵火麻蛋白后，提高火麻蛋白的生物利用度。與酶解法相比，本專利提供的菌與木瓜蛋白酶或菠蘿蛋白酶聯(lián)合固態(tài)發(fā)酵方法，顯著提高了活性肽制備效率，同時能夠顯著降低水解肽的苦味，提高最終火麻活性肽的dpph清除率。

48、(3)本發(fā)明的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)了在不影響火麻蛋白肽自身功能的條件下，又能增加胞外多糖的含量，得到一種富含胞外多糖的火麻蛋白肽。

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