導(dǎo)語(yǔ)

轉(zhuǎn)移仍然是結(jié)直腸癌(CRC)患者死亡的主要原因。免疫微環(huán)境在CRC轉(zhuǎn)移的起始和進(jìn)展中的關(guān)鍵作用已引起廣泛關(guān)注。

背景介紹

今天小編為大家?guī)?lái)的這篇文章，作者基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)開(kāi)發(fā)了一個(gè)三基因?qū)μ卣鱽?lái)預(yù)測(cè)CRC的預(yù)后，并在多個(gè)驗(yàn)證集中實(shí)現(xiàn)了其有效性。文章發(fā)表在《Frontiers in Immunology》上，影響因子為8.786，文章題目為：A novel prognostic signatures based on metastasis- and immune-related gene pairs for colorectal cancer。

數(shù)據(jù)介紹

共有來(lái)自癌癥基因組圖譜(TCGA)的453名CRC患者被納入作為訓(xùn)練集，GSE39582、GSE17536、GSE29621、GSE71187被納入作為驗(yàn)證集。

本研究技術(shù)路線如圖1所示。

圖 1

結(jié)果解析

01、鑒定差異表達(dá)的mRNA

本研究首先對(duì)TCGA-CRC公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的612例轉(zhuǎn)錄組分析進(jìn)行了差異表達(dá)分析，并鑒定出7,980個(gè)差異表達(dá)基因（圖 2A）。隨后分析了CRC樣本的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因并鑒定了469個(gè)差異表達(dá)基因（圖 2B）。為了獲得免疫浸潤(rùn)的程度，使用CIBERSORT和ESTIMATE算法來(lái)量化CRC組織中免疫細(xì)胞的活性或富集水平。CRC患者根據(jù)免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分分為高免疫組、中免疫組和低免疫組（圖 2C）。本研究進(jìn)一步分析了高免疫組和低免疫組之間的差異表達(dá)基因，獲得了3,177個(gè)差異表達(dá)基因（圖2D）。對(duì)上述差異表達(dá)基因進(jìn)行交集，最終鑒定出161個(gè)與CRC轉(zhuǎn)移和免疫相關(guān)的差異表達(dá)基因（圖2E）。

圖 2

02、風(fēng)險(xiǎn)模型的構(gòu)建和驗(yàn)證

通過(guò)迭代循環(huán)和基于表達(dá)的0或1分配將161個(gè)差異基因轉(zhuǎn)化為基因?qū)?，然后通過(guò)單變量cox回歸篩選出35個(gè)預(yù)后基因?qū)?。隨后的LASSO回歸與多因素cox回歸分析共有三個(gè)基因?qū)Π贑ox比例風(fēng)險(xiǎn)模型中（圖 2F-H）。

為了評(píng)估模型的有效性，本研究計(jì)算了接受者操作特征曲線在1、2和6年時(shí)的曲線下面積(AUC)，并取最佳AUC對(duì)應(yīng)的截止值作為評(píng)估患者風(fēng)險(xiǎn)的點(diǎn)（圖 3A）。根據(jù)臨界值，TCGA-CRC數(shù)據(jù)集中的患者被分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，并進(jìn)行K-M分析以研究模型的預(yù)后性能。高風(fēng)險(xiǎn)組患者的生存時(shí)間明顯短于低風(fēng)險(xiǎn)組，表明三基因?qū)δＰ驮谟?xùn)練數(shù)據(jù)集中具有良好的預(yù)后預(yù)測(cè)效率（圖 3B）。此外，模型的預(yù)后性能通過(guò)獨(dú)立驗(yàn)證集GSE17536、GSE29621、GSE39582中的K-M分析進(jìn)行了驗(yàn)證,和GSE71187(圖 3C–F)。這些結(jié)果表明三基因?qū)δＰ驮谟?xùn)練集和多個(gè)獨(dú)立的驗(yàn)證集上具有良好的預(yù)后預(yù)測(cè)效率。

圖 3

03、風(fēng)險(xiǎn)模型的臨床評(píng)估

接下來(lái)，為了探索驗(yàn)證集中模型與臨床特征之間的關(guān)系，使用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)來(lái)分析風(fēng)險(xiǎn)組與患者年齡、性別、腫瘤分期和TNM分期之間的相關(guān)性（圖 4A）?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果揭示了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與轉(zhuǎn)移之間的關(guān)聯(lián)（圖 4B）。本研究發(fā)現(xiàn)基于模型的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與患者年齡（圖 4C）和性別（圖 4D）無(wú)關(guān)，而腫瘤分級(jí)（圖 4E）、T分期（圖 4F）、N期（圖 4G）和M期（圖 4B、H）與風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)?？紤]到從數(shù)據(jù)集中識(shí)別的基因參與免疫反應(yīng)，本研究通過(guò)Spearman相關(guān)分析調(diào)查了風(fēng)險(xiǎn)模型是否與腫瘤微環(huán)境相關(guān)（圖 5A）。與低危組相比，高危組的免疫浸潤(rùn)程度明顯更高（圖5B），CD8+T細(xì)胞、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤(rùn)更多，CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)更少（圖 5C–G）。

圖 4

此外，在分析風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與癌癥靶向藥物的相關(guān)性時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)PARP抑制劑Rucaparib、Olaparib和FH535的IC50在高危組中顯著低于低危組，提示高危人群對(duì)PARP抑制劑更敏感（圖 5H）。高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與臨床常用的順鉑、伊馬替尼和厄洛替尼的較低IC50相關(guān)（圖 5I）。

圖 5

04、CTSW和FABP4作為CRC的潛在治療靶點(diǎn)

在構(gòu)成風(fēng)險(xiǎn)模型的五個(gè)基因中，本研究根據(jù)初步實(shí)驗(yàn)和現(xiàn)有報(bào)告，重點(diǎn)關(guān)注兩個(gè)基因，CTSW和FABP4，作為CRC免疫和轉(zhuǎn)移的潛在靶點(diǎn)。TCGA-CRC數(shù)據(jù)按照CTSW表達(dá)量排序，前25%的高表達(dá)數(shù)據(jù)和后25%的低表達(dá)數(shù)據(jù)納入GSEA富集分析。除了豐富的免疫反應(yīng)和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)過(guò)程外，還發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因與DNA損傷和雙鏈斷裂有關(guān)（圖 6A）。本研究還通過(guò)TIMER預(yù)測(cè)了CTSW與免疫細(xì)胞的相關(guān)性，結(jié)果顯示CTSW與CD4+T、CD8+T、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞顯著相關(guān)（圖 6B）。為了通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證本研究的生物信息學(xué)分析結(jié)果，通過(guò)CRISPR-Cas9生成了CTSW-KO HT-29和HCT-116細(xì)胞，并通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析驗(yàn)證了敲除效率（圖 6C）。

接下來(lái)探討了EMT相關(guān)蛋白與CTSW之間的關(guān)系。與陰性對(duì)照（NC）相比，CTSW-KO細(xì)胞中N-cadherin和MMP9的表達(dá)增加，而E-cadherin則相反，這也與之前的篩選結(jié)果一致（圖6D）。Transwell測(cè)定還證實(shí)了與對(duì)照相比，CTSW-KOCRC細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)（圖 6F）。鑒于GSEA分析結(jié)果表明CTSW表達(dá)水平與CRC腫瘤內(nèi)的DNA損傷通路之間存在關(guān)聯(lián)，接下來(lái)本研究探討了CTSW與干擾素基因(STING)通路的環(huán)GMP-AMP合酶(cGAS)刺激物之間的潛在關(guān)系，結(jié)果顯示，CTSW敲除顯著降低了cGAS、p-STING、p-TBK1和p-IRF3的蛋白表達(dá)，提示CTSW在激活免疫反應(yīng)（圖 6E）。上述結(jié)果提示CTSW除免疫浸潤(rùn)外與CRC轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示其在CRC發(fā)生發(fā)展中的重要作用。

圖 6

FABP4是一種與脂肪酸攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝相關(guān)的脂肪酸結(jié)合蛋白。根據(jù)FABP4表達(dá)水平對(duì)TCGA-CRC樣本進(jìn)行排序，并分別取高低25%的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行GSEA分析。與CTSW的結(jié)果類似，F(xiàn)ABP4相關(guān)基因不僅與轉(zhuǎn)移和免疫反應(yīng)相關(guān)，而且與DNA雙鏈斷裂和錯(cuò)配修復(fù)相關(guān)（圖 7A）。TIMER的結(jié)果還表明，F(xiàn)ABP4與CD4+T、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞密切相關(guān)（圖 7B）。隨后，通過(guò)CRISPR-cas9系統(tǒng)構(gòu)建FABP4基因敲除的CRC細(xì)胞，并通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證（圖 7C）。發(fā)現(xiàn)Ecadherin表達(dá)上調(diào)，而N-cadherin和MMP9表達(dá)在FABP4敲低的CRC細(xì)胞中下調(diào)（圖 7D）。與NC相比，F(xiàn)ABP4敲除減弱了CRC細(xì)胞的遷移和侵襲能力，表明FABP4可能促進(jìn)CRC轉(zhuǎn)移（圖 7F）。考慮到FABP4與DNA損傷修復(fù)相關(guān)，探索了FABP4與cGAS-STING通路之間的關(guān)聯(lián)。cGAS、p-STING、p-TBK1和p-IRF3的表達(dá)水平在FABP4-KO細(xì)胞中顯著降低（圖 7E）。引人注目的是，通過(guò)免疫組織化學(xué)檢查了來(lái)自35名CRC患者的組織微陣列樣本中的FABP4和CD8表達(dá)，表明FABP4表達(dá)升高的患者中CD8浸潤(rùn)增加（圖 7G）。這些發(fā)現(xiàn)表明FABP4與免疫反應(yīng)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能成為CRC的潛在治療靶點(diǎn)。

圖 7

小編總結(jié)

基于正常/腫瘤、高/低免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移/非轉(zhuǎn)移組，本研究鑒定了161個(gè)差異表達(dá)基因。經(jīng)過(guò)隨機(jī)分配和LASSO回歸分析，構(gòu)建了一個(gè)包含3個(gè)轉(zhuǎn)移和免疫相關(guān)基因?qū)Φ念A(yù)后模型，并在訓(xùn)練集和4個(gè)獨(dú)立的 CRC隊(duì)列中表現(xiàn)出良好的預(yù)后預(yù)測(cè)效率。根據(jù)這個(gè)模型，本研究對(duì)患者進(jìn)行聚類，發(fā)現(xiàn)高危組與分期、T和M分期相關(guān)。此外，高危人群還表現(xiàn)出較高的免疫浸潤(rùn)和對(duì)PARP抑制劑的高敏感性。此外，源自本模型的FABP4和CTSW被鑒定為參與CRC的轉(zhuǎn)移和免疫。本研究缺陷在于所用數(shù)據(jù)集不足，結(jié)果的應(yīng)用有限制，仍需要更多后續(xù)的實(shí)驗(yàn)證明。

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