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老頑童說.

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翻譯 by 左越晟王雪寶張?；?王敏

蜀道難，早梅悲，長路漫，且修遠，上下求索終有時，撥開迷霧見明日。在人們追求長壽，延緩衰老的萬里征途上，清除衰老細胞作為一種潛在策略被廣泛關注。而在疾病發(fā)生發(fā)展過程中，衰老細胞也是“功勞”不小，這也使得靶向衰老細胞成為疾病治療的可能策略，如最近有報道發(fā)現(xiàn)延緩衰老的干預策略在COVID-19治療中具有潛在價值。今天小編就分享一篇康涅狄格大學老齡化研究中心Ming Xu博士及其合作者于2021年10月07日在Nature Aging上發(fā)表的 “Strategies for targeting senescent cells in human disease” 綜述，為大家詳述衰老細胞的特征和針對它們的靶向策略，關于清除衰老細胞的senolytics療法在應對人類疾病的臨床試驗進展及其可能存在的問題。

摘要

細胞衰老是一種獨特的細胞命運，是細胞在應答一系列內(nèi)在和外在的壓力時出現(xiàn)的復制阻滯。細胞衰老不僅可以促進發(fā)育和傷口愈合進程，還能限制腫瘤的發(fā)生。但是，衰老細胞的病理性積累往往也與一系列疾病相關，包括年齡相關的器官疾病。衰老細胞通過產(chǎn)生旁分泌和內(nèi)分泌信號引起局部組織功能紊亂并對全身產(chǎn)生有害反應。通過誘導凋亡來清除衰老細胞的藥物或抑制衰老相關分泌表型的療法來清除衰老細胞，這些策略在老年功能退行和慢性疾病的臨床研究中取得了一定的療效，這表明衰老細胞是延緩衰老進程的潛在藥理學靶標。然而，衰老細胞群體在組成、功能和組織分布方面都具有異質(zhì)性，甚至在不同物種之間也有差異，這也是目前臨床試驗中從實驗室到正式臨床應用過程中遇到的問題。在此，作者對衰老細胞的特點和靶向衰老細胞的策略（包括免疫學方法，以及關鍵的胞內(nèi)信號通路）進行了總結(jié)回顧。此外，作者還調(diào)研列舉了目前正在進行人體試驗的senolytics，闡述了其作用機制、應用前景及其存在的問題。

正文

實際年齡是全球范圍內(nèi)疾病和死亡的主要風險因素。通常情況下，生物學年齡與實際年齡是等同的；然而在多種慢性疾病和老年綜合癥的影響下，生物學年齡的增長會加快，這也是個體間的患病和死亡風險高低各有不同的由來。因此，現(xiàn)在有越來越多的科學工作者致力于從根源上了解和調(diào)節(jié)細胞衰老以減輕全球范圍內(nèi)的共發(fā)性疾病。細胞衰老作為慢性疾病與老年功能退行的一個基本驅(qū)動因素而愈發(fā)受到重視。盡管在體外培養(yǎng)細胞進行連續(xù)傳代后發(fā)現(xiàn)細胞生長和分裂終止時，就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)細胞衰老了，但直到人們發(fā)現(xiàn)衰老細胞與許多增齡引起的跨器官系統(tǒng)的慢性疾病相關時，才開始關注到細胞衰老的影響。隨著研究者對細胞衰老在病理學中作用的認識不斷深入，對細胞衰老在基礎生理學中的作用的理解也在不斷發(fā)展。由于衰老研究中固有的二元性以及當前人們有限的認知，從研究衰老細胞的實驗方法到將衰老細胞作為治療靶標的研究，都引發(fā)了研究熱潮和爭議。

在此，作者調(diào)研了目前細胞衰老領域有關其異質(zhì)性的研究，以闡釋這一細胞命運在生理學和病理學方面的不同作用。作者首先探討了細胞衰老的分子基礎以強調(diào)目前如何根據(jù)其潛在的多樣性來定義衰老細胞。其后，作者探索了衰老細胞分泌組如何進一步加劇細胞異質(zhì)性。最后，作者總結(jié)了目前針對各種類型的衰老細胞的治療方法和意義，以及目前針對senolytics研制的臨床試驗。

細胞衰老

盡管細胞衰老在健康和疾病中的作用存在著爭議，但就其基本的定義，學界目前達成了一定程度上的共識。究其本源，細胞衰老代表了一種細胞命運，其在面對各種壓力因素時表現(xiàn)為穩(wěn)定的增殖阻滯，并常伴隨產(chǎn)生一種被稱為“衰老相關分泌表型”（senescence-associated secretory phenotype，SASP）的分泌組。相關的壓力因素包括端?？s短導致的復制壓力、DNA損傷途徑的激活、表觀遺傳學變化、氧化壓力、線粒體功能障礙、輻射、腫瘤基因誘導以及機械和剪切壓力，這些因素在先前的綜述中都已被細致地總結(jié)過。在受到壓力后，往往會因為細胞周期檢查點阻斷因子上調(diào)而導致DNA復制進程被阻滯。盡管這些細胞積累了大量的損傷但是其并不會發(fā)生凋亡，導致?lián)p傷積累的原因包括DNA斷裂的發(fā)生、DNA損傷應答反應（DNA damage response，DDR）的增加，以及線粒體功能障礙和活性氧（reactive oxygen species，ROS）的增加。相反，這些衰老細胞通過衰老細胞抗凋亡通路（senescent cell anti-apoptotic pathways，SCAPs）使得促進生存的通路發(fā)生上調(diào)，而關鍵的凋亡調(diào)控因子則下調(diào)。除了其內(nèi)部的穩(wěn)態(tài)平衡發(fā)生紊亂外，衰老細胞還能通過SASP引發(fā)局部和全身的炎癥以及組織損傷。

壓力、衰老和隨后的SASP信號和免疫激活對正常發(fā)育和健康至關重要。在發(fā)育的早期，具有衰老特征的細胞對體軸建立發(fā)揮著重要作用，相關的SASP通過巨噬細胞介導的清除來指導諸如肢芽等結(jié)構(gòu)的生長。更進一步地，由于衰老細胞產(chǎn)生促進組織重塑和招募相關免疫組分的因子，因此受時空調(diào)控的細胞衰老對于維持傷口和器官修復等的再生過程中愈合和纖維化之間的平衡至關重要。有趣的是，衰老細胞還可以通過旁分泌機制促進鄰近細胞的去分化和可塑性。此外，由于衰老細胞的炎癥特性是在DNA損傷和致癌壓力的誘導下發(fā)生的，因此其也可以作為一種腫瘤抑制機制，盡管這種炎癥特性和DNA損傷的誘導在失調(diào)時也會導致患腫瘤風險的增加。

雖然研究者們對衰老細胞的有益作用很感興趣，但大部分基于細胞衰老的研究都是針對它們在疾病中的作用，并強調(diào)其在老年功能退行中的作用。細胞衰老領域研究的熱點浪潮是由以下發(fā)現(xiàn)推動的：細胞衰老的標志物隨著衰老而積累，并且增加壽命和健康壽命的干預措施能夠延緩積累，去除衰老細胞可增加早衰模型小鼠的健康壽命，而將少量衰老細胞移植到健康的動物身上會引發(fā)與老年動物類似的多系統(tǒng)功能障礙。更進一步的研究發(fā)現(xiàn)，人類衰老細胞的積累與疾病也具有相關性，并且可通過相關的臨床干預手段減輕衰老細胞負擔?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，理解細胞衰老在疾病發(fā)病率和死亡率中的作用就顯得至關重要。迄今為止，細胞的衰老已被認為與大多數(shù)器官系統(tǒng)的疾病相關聯(lián)，其中不乏死亡率較高以及造成較高醫(yī)療系統(tǒng)負擔的疾病，諸如心血管、肺、神經(jīng)系統(tǒng)、腎、肝、肌肉骨骼和內(nèi)分泌疾病等。

細胞衰老的分子基礎及標志物

衰老作為一種細胞命運，常常被認為是一種壓力應激反應。衰老與其他經(jīng)適當有絲分裂劑誘導可進入增殖狀態(tài)的非增殖性細胞的命運不同，后者可以分為靜息狀態(tài)和終末分化狀態(tài)，處于終末分化狀態(tài)的細胞通過特定的譜系發(fā)育以發(fā)揮特定的功能，并通過多種通路阻滯增殖?；趯Χ肆？s短或電離輻射等內(nèi)部和外部因素的響應，衰老的細胞周期停滯信號主要集中在p53-Cdkn1a（p21）以及視網(wǎng)膜母細胞瘤（retinoblastoma，RB）-Cdkn2a（p16）通路。細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（cyclin-dependent kinase inhibitors，CDKIs）p21或p16水平的增加可以促進G1/S細胞周期的阻滯，其主要通過抑制細胞周期蛋白-循環(huán)蛋白依賴性激酶復合物的形成以及不能滅活與轉(zhuǎn)錄抑制相關的RB來介導。盡管引起細胞衰老生長停滯的通路趨向一致，但新的觀點更傾向認為不同的壓力誘導因素會導致獨特的衰老亞型。由于沒有任何一個已知的標記物能以高靈敏度和特異性來定義細胞衰老，這也加劇了上述細胞衰老亞型的復雜性。目前慣用的做法是依靠表型和標志物的組合來表征細胞的衰老。例如，盡管p16和p21的積累在生物學上與衰老有關，而且它們被廣泛地用作分子標記，但各種不同的體外壓力源卻能誘導這些CDKIs出現(xiàn)差異表達，甚至在同一細胞系內(nèi)也沒有例外，這表明p16和p21本身并不足以代表細胞的衰老。而當不同類型的細胞面對同一誘導性壓力源時，其轉(zhuǎn)錄組也會發(fā)生不同的變化，這使得細胞衰老的亞型更加復雜化。與體外細胞培養(yǎng)模型的良好控制約束不同的是，多種壓力源可以在體內(nèi)同時作用于衰老和疾病。因此，研究者們推測，體內(nèi)的細胞衰老亞型將會更加多樣化。

除了p16和p21之外，其他一些標志物也可用于識別衰老的細胞，盡管每種標志物的特異性和敏感性各不相同（表1）。許多體外的形態(tài)學特征也能指征細胞衰老，并可通過明場顯微鏡等進行評估。與同類細胞相比，衰老細胞的大小增加，這可能反映了其代謝和細胞器穩(wěn)態(tài)的改變。尤其是線粒體和溶酶體在細胞受到衰老誘導壓力時都會積累。這些表型上的變化為檢測衰老細胞提供了額外的手段和助力。衰老細胞中的溶酶體豐度是其中最常用的特征之一，這是由于溶酶體衰老相關的β-半乳糖苷酶（lysosomal senescence-associated beta-galactosidase，SA-β-gal）活性的測定相對快速而直接。然而，這種特異性的標志物也有其局限性，最好與其他標志物搭配使用。脂褐素是溶酶體副產(chǎn)物的聚集物，也在衰老細胞內(nèi)積累，可以方便地進行檢測，而這種檢測在特異性方面與SA-β-gal檢測有類似的限制。此外，衰老細胞中還出現(xiàn)線粒體豐度增加的現(xiàn)象，同時其膜電位發(fā)生改變，ROS、氧化磷酸化和氧消耗增加。因此，氧化還原狀態(tài)、線粒體功能和線粒體生物合成等相關的檢測也可用于衰老細胞表型的鑒定。

表1：細胞衰老標志物的選擇

細胞核的改變是衰老細胞的突出特征，這主要是由引起p16和p21激活的DDR通路激活造成的。這些DDR通路的激活還同時使組蛋白H2AX磷酸化和激活態(tài)增加，該組蛋白的主要功能是在基因毒性壓力和雙鏈斷裂后協(xié)助DNA的修復。H2AX組蛋白的這一特點促成了細胞衰老研究中使用免疫組化技術(shù)在衰老試驗中標記磷酸化（γ）H2AX。然而，由于這一通路可以修復大部分染色體上的DNA雙鏈斷裂，考慮到其在大多數(shù)基因座上的瞬時性，其敏感性可能相對較為欠缺。然而，非同源末端連接為防止染色體末端-末端融合而呈現(xiàn)的局部抑制，使得雙鏈斷裂在端粒位點持續(xù)存在。因此，通過檢測端粒探針和γ-H2AX抗體的共定位來評估端粒相關的DNA損傷灶是檢測衰老細胞一種相對特異和敏感的方法，因為損傷灶在衰老誘導的壓力下會在細胞中積累。其他細胞核的核改變包括核中間絲蛋白和表觀遺傳調(diào)節(jié)因子lamin B1的丟失、衰老相關異染色質(zhì)區(qū)域的特定染色質(zhì)重塑模式的出現(xiàn)以及DNA復制的減少，每一種改變都可以用免疫熒光技術(shù)進行鑒定和評估。其他遺傳和表觀遺傳標記包括LINE-1逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的激活和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶KAT7的上調(diào)等。

細胞衰老研究領域目前正被組學和生物信息學方法所推動，這些方法有助于更好地理解細胞衰老的圖譜，闡述新的分子機制，尤其是衰老細胞亞群的異質(zhì)性。轉(zhuǎn)錄組方法為衰老細胞的動態(tài)研究提供了獨特的視角，同時也給出了新的衰老分子標志物。最近研究發(fā)現(xiàn)，無論誘發(fā)的壓力和細胞類型如何，衰老細胞似乎都有共同的基因差異表達特征，包括組蛋白相關轉(zhuǎn)錄物的下調(diào)和參與p53信號調(diào)控的長非編碼RNA PURPL的上調(diào)。然而，單細胞分辨率下的轉(zhuǎn)錄組分析顯示，即使是面臨相同壓力的單細胞也會呈現(xiàn)獨特的衰老亞型，具有不同的基因和SASP表達譜，這不禁讓人懷疑是否有可能找到一個的衰老標志物的“金標準”。不管怎樣，單細胞轉(zhuǎn)錄組學可以通過多種轉(zhuǎn)錄標志物用以鑒定衰老細胞群。例如，這種技術(shù)顯示脂肪來源的間充質(zhì)干細胞在自然衰老條件下因衰老相關通路的改變而積累衰老標志物。輔以表觀基因組以及蛋白質(zhì)組和代謝組的數(shù)據(jù)，我們對衰老細胞命運的理解正在呈指數(shù)型增長。

SASP

SASP不僅可以抑制細胞增殖，還在衰老細胞的生理功能和病理變化中發(fā)揮重要作用。SASP包含大量細胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、microRNA、趨化因子、生長因子和小分子代謝物，它們由外泌體包裹或直接分泌，主要受p53、NF-κB、CEBPB、JAK-STAT和GATA4轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。隨著研究深入人們逐漸發(fā)現(xiàn)SASP調(diào)控是多層次的，除了轉(zhuǎn)錄水平，還包括如cGAS-STING通路的轉(zhuǎn)錄前信號級聯(lián)作用，以及超級增強子重塑等表觀遺傳調(diào)控?？茖W家通過SASP圖譜等來繪制和記錄相應的衰老分泌表型，以此為基礎的分析表明SASP隨不同的壓力而發(fā)生變化。例如病原體相關因子脂多糖或嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒2 S1抗原，可以顯著放大現(xiàn)有衰老細胞的SASP，導致機體產(chǎn)生細胞因子風暴并增加死亡風險，這在老年人和慢性疾病患者中尤為嚴重。

SASP組分與許多生物學功能相關，但通常與衰老的慢性炎癥相關，部分SASP組分與免疫調(diào)節(jié)相關。SASP趨化因子如白介素1（interleukin 1, IL-1）、白介素8（interleukin 8, IL-8）和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor, TNF）能夠招募包括巨噬細胞、嗜中性粒細胞和T細胞在內(nèi)的免疫細胞。這使得積累了ROS、DNA損傷或致癌應激的衰老細胞和鄰近細胞被清除，與衰老在腫瘤發(fā)生中的預防作用一致。相反，這些相同的SASP組分（以及其他組分）長期或不受控制地表達時可能會通過基質(zhì)和血管重塑促進腫瘤擴散和侵襲。這可以解釋衰老在癌癥預防和癌癥發(fā)展中都起作用這一矛盾的發(fā)現(xiàn)。此外，SASP不僅是衰老細胞的產(chǎn)物，它還通過旁分泌和自分泌信號機制誘導和促進衰老（圖1）。鑒于此，人們推測在慢性炎癥環(huán)境中，與年齡相關的免疫能力下降可能會使得衰老細胞逃避被清除的命運，盡管這一點還沒有完全被解析。此外，SASP信號會使得衰老細胞對免疫介導的清除產(chǎn)生抗性（例如，通過上調(diào)HLA-E配體，可抑制CD8+ T細胞和自然殺傷細胞功能）。不管免疫相互作用的確切潛在機制如何，衰老細胞的積累可以通過使衰老細胞清除的循環(huán)失敗來持續(xù)下去，同時增加SASP信號，導致繼發(fā)性衰老細胞誘導。值得注意的是，盡管有證據(jù)表明原發(fā)性和繼發(fā)性誘導衰老細胞之間的SASP動力學存在差異，但關于繼發(fā)性衰老細胞和那些初始因壓力而衰老的細胞是否相似仍存在爭議。此外，衰老的免疫系統(tǒng)因子還會進一步加強衰老和損傷的SASP信號，例如具有線粒體功能障礙的T細胞會像衰老細胞那樣導致衰老細胞整體壓力的增加，這與虛弱和多重病征的增加有關，并且部分可能與TNF信號有關。此外，在轉(zhuǎn)基因小鼠的造血祖細胞中引入干擾DNA修復的載體使得免疫細胞成熟前衰老，導致產(chǎn)生多種年齡相關表型和轉(zhuǎn)基因小鼠多種組織中的衰老細胞負擔增加的現(xiàn)象。

圖1：衰老細胞累積的正反饋循環(huán)。

在暴露于初始應激源后誘導了細胞衰老。由此產(chǎn)生的衰老細胞會產(chǎn)生SASP，它可以進一步促進衰老細胞的積累并抑制其被清除。反過來SASP也可以被放大，引發(fā)慢性炎癥和繼發(fā)性的衰老誘導壓力源，驅(qū)動衰老細胞積累的正反饋循環(huán)。

SASP的異質(zhì)性反映了潛在衰老機制的復雜性，也進一步說明了SASP如何影響非衰老細胞的再生潛力。在體內(nèi)角質(zhì)細胞再生模型中，NF-κB通路SASP因子瞬時表達可促進干細胞特性和再生潛能的增強，而中斷該信號或長時間暴露會減少干細胞特性和再生潛能。這表明了思考SASP動力學和闡明慢性衰老細胞的積累和信號傳導如何減弱對生理損傷應答的必要性。在肝臟中，衰老分泌組也扮演者截然不同的兩個角色。衰老和相關的轉(zhuǎn)化生長因子-β信號傳導與再生受損和膽管纖維化有關，而衰老細胞的不斷消除和隨后的SASP減少可誘導血管結(jié)構(gòu)纖維化。這些發(fā)現(xiàn)可能是所使用的模型系統(tǒng)造成的假象，如不斷消除衰老細胞的影響、p16作為衰老標志物的特異性有限，以及一項研究中可能存在血管滲漏的血管細胞群，但另一方面也可以表明衰老特征在不同環(huán)境下的可變性。

靶向衰老細胞

2004年的一份報告表明小鼠衰老細胞比重與健康壽命之間存在反比關系，這促使人們開始研發(fā)選擇性消除衰老細胞的藥物。在轉(zhuǎn)基因INK-ATTAC小鼠模型（在衰老細胞中少量活躍的p16啟動子的控制下，帶有藥物誘導的胱天蛋白酶8的轉(zhuǎn)基因小鼠模型可以選擇性消除表達p16的衰老細胞）中，通過從早衰小鼠中選擇性去除高水平表達p16的細胞來緩解與年齡相關的表型，進一步支持了這一結(jié)論。由于衰老細胞在其分子生物學和生理功能方面具有高度異質(zhì)性，因此需要有針對性的策略來盡量將衰老細胞保持在有益的狀態(tài)，同時消除有害的影響。從廣義上講，這些療法可以分為senomorphic療法和senolytic療法的主要類別，這種分類方法有一定的相對性，因為在一種細胞類型或環(huán)境中具有促進衰老作用的藥物可能在另一種細胞類型或環(huán)境中具有延緩衰老作用，反之亦然。Senomorphic化合物靶向病理SASP信號，而senolytic則消除釋放有害SASP因子的潛在衰老細胞。Senomorphic在其他地方也有討論，簡而言之，Senomorphic可抑制SASP組分的產(chǎn)生或者對其進行拮抗與中和，且通常需要連續(xù)給藥。我們將專注于新興的senolytic療法以解決衰老病理的根本原因——衰老細胞，并通過間歇性給藥產(chǎn)生多效益處。目前已經(jīng)被研究證明有效清除衰老細胞的senolytic療法包括Src激酶抑制劑達沙替尼和類黃酮槲皮素（dasatinib and the flavonoid quercetin, D+Q），以及最新的BCL-2家族抑制劑等。雖然第一批senolytic療法是使用生物信息學方法開發(fā)的，旨在破壞SCAP和其他促進生存的通路，但該類已經(jīng)擴展到利用額外的衰老特征和增強免疫介導的清除（圖2）。從廣義上講，第一代藥物的作用是使SCAP暫時失效，導致那些具有組織損傷性SASP的衰老細胞凋亡。所有senolytic療法都可能發(fā)生脫靶效應或干擾正常細胞，但這些影響被控制在一定范圍內(nèi)，因為大多數(shù)療法都適合間歇性的“打了就跑”的給藥策略，不需要每天甚至每周給藥。這種間隔給藥策略被認為是有效的，因為衰老細胞即使在體外面臨持續(xù)且嚴酷的衰老誘導壓力時，也需要7天或更長時間（至少在體外）產(chǎn)生和累積SASP，并且可能需要同樣長時間才能開始在體內(nèi)重新積累。

圖2：senolytic所靶向的衰老細胞特征。

利用衰老細胞的經(jīng)典特征來降低它們的豐度。這些靶標包括特異的表面抗原、SCAP和其他生存網(wǎng)絡、生化代謝改變和細胞器特征的變化。

細胞外靶標和免疫系統(tǒng)介導的清除

衰老細胞的描述和定義已經(jīng)揭示了衰老相關的特異性抗原。這些可以用于免疫系統(tǒng)介導的衰老細胞激活和清除。最近一項在小鼠模型中使用嵌合抗原受體CAR-T細胞靶向抑制尿激酶型纖溶酶原激活劑受體（urokinase-type plasminogen activator receptor, uPAR）的研究就利用了這一點。uPAR與細胞外基質(zhì)重塑相關，在復制、致癌基因誘導和毒性誘導的衰老細胞表面上調(diào)。細胞毒性CAR-T細胞能夠在體外和體內(nèi)選擇性地清除表達uPAR的衰老細胞。在四氯化碳和飲食誘導的肝纖維化小鼠模型中，CAR-T細胞介導的衰老細胞清除改善了存活率和組織病理學特征，這表明了這種衰老細胞清除療法的可行性和潛力。然而，在治療時，CAR-T細胞劑量與細胞炎性因子、體重減輕和體溫過低有關，表明需要特別注意初始給藥劑量。特別是在免疫系統(tǒng)受損和持續(xù)的慢性炎癥的老年人群中，這可能會成為限制治療的因素。此外，人類CAR-T細胞方法涉及初始免疫系統(tǒng)抑制，致病率較大且價格昂貴。衰老細胞清除療法的CAR-T細胞可能具有自我限制的特性，它們的擴張和消退會在幾天內(nèi)發(fā)生，但這在急性到亞急性不良反應的情況下是有風險的。鑒于其臨床前療效和對衰老細胞的特異性，該策略有一定可行性，但在臨床給藥前還需進一步優(yōu)化和測試。

選定衰老抗原后接種相應疫苗為清除衰老細胞提供了一種新穎的療法。衰老的T細胞群在肥胖的脂肪組織中積聚，從而導致具有局部和全身效應的炎癥。這些T細胞帶有已知的衰老相關標志物，其特征是CD4陽性、CD44高表達、CD62L低表達、PD1陽性和CD153陽性。用CD153肽偶聯(lián)物對這些細胞進行免疫接種可促進衰老T細胞從脂肪組織中清除，并改善其代謝功能。與其他免疫介導的清除療法一樣，針對衰老抗原表位的疫苗接種需要仔細考慮臨床轉(zhuǎn)化，尤其是在其可能難以逆轉(zhuǎn)的持久影響的背景下。由于CD153與分枝桿菌清除有關，那些有分枝桿菌感染史或易感性強的患者需要特別注意中和抗體或清除陽性細胞的可能。此外，免疫系統(tǒng)衰退可能會限制老年人群的疫苗應答和記憶能力。

作用于SCAP

靶向SCAP網(wǎng)絡開發(fā)了初始senolytic療法。與單一藥物、單一目標的方法相比，SCAP抑制可同時與多個促進生存的信號相互作用。因此，這些早期抗衰老藥物通常具有幾種協(xié)同相互作用的藥理作用機制。這方面的主要例子是類黃酮非瑟酮（flavonoid fisetin）以及D+Q，它們已被充分運用和驗證。簡而言之，盡管確切的作用機制尚不清楚（大多數(shù)藥物都是如此），但D+Q組合通過干擾包括ephrin依賴性受體信號通路、PI3K-AKT和BCL-2成員在內(nèi)的幾種促進生存的網(wǎng)絡發(fā)揮廣譜的清除衰老細胞活性。BCL-2家族成員（BCL-2、BCL-XL、BCL-W等）會阻止促凋亡線粒體信號級聯(lián)的激活、細胞色素c的釋放和下游的半胱天冬酶激活，是衰老抑制劑的靶標。這些化合物中，如navitoclax（ABT-263）、A1331852和A1155463，在體外對衰老的人肺成纖維細胞和臍靜脈內(nèi)皮細胞以及其他細胞類型顯示出了活性。然而，與D+Q不同的是，這些藥物并不能在體外消除所有的衰老細胞，并且在衰老的前脂肪細胞中發(fā)生了部分的回彈，而在體內(nèi)也會造成廣泛的代謝功能障礙和傷害。盡管調(diào)節(jié)間歇給藥的劑量可能有所幫助，但BCL-2抑制劑作為senolytic的臨床效用由于在血小板、中性粒細胞并且可能在T細胞中存在脫靶效應而受到限制，但這對于高危人群來說可能是特殊的（可能在單次給藥后即可發(fā)生），并且可能損害止血功能并進一步損害其免疫功能。其他可以作為藥物靶向的SCAP包括調(diào)節(jié)p53相關通路、抑制抗凋亡轉(zhuǎn)錄因子FOXO4、抑制肽酶USP7、抑制HSP90分子伴侶、增加由caspase激活驅(qū)動的凋亡以及其他正在研究中的通路。

其他方法

衰老細胞的其他特征有利于定向清除衰老細胞，其中一個便是衰老細胞的溶酶體酶活性增加。研究發(fā)現(xiàn)可以通過使用被溶酶體酶SA-β-gal切割和激活的藥物前體來實現(xiàn)定向清除衰老細胞，或者通過將細胞毒性化學物質(zhì)裝載到的可以優(yōu)先釋放到衰老細胞中的納米顆粒（進行半乳糖聚合物包被），從而實現(xiàn)定向清除衰老細胞。這種療法可能會在具有高SA-β-gal活性的非衰老細胞中（如活化的巨噬細胞）受到脫靶效應的影響。衰老細胞中的溶酶體的豐度也通過激活自噬為衰老細胞清除提供了機會。自噬通常涉及細胞器和其他細胞成分的轉(zhuǎn)換，這些成分被運輸?shù)饺苊阁w進行分子再利用。除了能夠作為細胞循環(huán)系統(tǒng)之外，自噬在持續(xù)壓力下而高度激活時，可激活細胞死亡的途徑。自噬雖然在衰老細胞內(nèi)受到抑制，但衰老細胞可在自噬的推動下為細胞死亡做好準備。這可以通過誘導自噬和隨后使用貝特類藥物、二甲雙胍、mTOR復合物1（mTORC1）抑制劑、溴區(qū)結(jié)構(gòu)域和末端結(jié)構(gòu)域（bromodomain and extraterminal domain, BET）抑制劑和溶酶體酸化（ataxia telangiectasia mutated, ATM）抑制劑等來清除衰老細胞。除了靶向細胞器外，即使是微小的化學變化也能被利用來進行衰老細胞清除。強心苷可以通過衰老細胞內(nèi)膜電位和質(zhì)子濃度的變化對衰老細胞進行清除便可以證實這一點。此外，也可以靶向衰老細胞中對這些化學變化的補償反應。例如，衰老細胞通過上調(diào)包括谷氨酰胺酶的產(chǎn)物氨在內(nèi)的緩沖系統(tǒng)來抵抗溶酶體改變和其他因素導致的pH降低。這些緩沖系統(tǒng)的中斷可以誘導衰老細胞死亡，并且維持緩沖濃度的酶可以被小分子藥物所靶向。

Senolytics療法的臨床試驗

在首例試點開放性的臨床senolytics療法研究中（ClinicalTrials.gov identifier NCT02874989），14名特發(fā)性肺纖維化患者在3周內(nèi)口服9次D+Q，停止服藥五天后，患者的6分鐘內(nèi)步行距離、步行速度、座椅起身能力和簡易體能狀況均有所改善，這可能與試驗藥物、學習效果或開放性研究設計中固有的其他因素有關。依據(jù)這些初始數(shù)據(jù)，研究人員計劃進行規(guī)模更大的安慰劑對照的D+Q治療特發(fā)性肺纖維化的臨床試驗。最近報告了關于糖尿病腎病患者D+Q的一期開放性臨床試驗（NCT02848131）中期結(jié)果。在為期3天的口服D+Q之后的11天，與D+Q給藥之前的活檢細胞相比，9名糖尿病腎病患者脂肪組織p16INK4A和 SA-β-gal陽性數(shù)量都減少了。此外，在為期3天senolytic干預完成后的第11天，由于激活了CD68+巨噬細胞脂肪組織浸潤和脂肪組織冠狀結(jié)構(gòu)形成（由于纖維化所造成的），10種循環(huán)SASP因子的綜合評分顯著降低，并且在這項持續(xù)試驗中（受試者總計30人），迄今尚未出現(xiàn)嚴重的副作用。其他多項臨床試驗也正在進行或即將開始（表2），其中包括針對阿爾茨海默癥（ALSENLITE, NCT04785300; STOMP-AD, NCT04685590），骨髓移植（HTSS, NCT02652052）和兒童癌癥治愈者（SENSURV, NCT04733534）的加速衰老狀態(tài)，年齡相關性骨質(zhì)疏松癥（NCT04313634）的D+Q試驗，以及老年羸弱女性（AFFIRM, NCT03430037），糖尿病和慢性腎病（NCT03325322），兒童癌癥治愈者的加速衰老狀態(tài)（與SENSURV的D+Q相比），年齡相關性骨質(zhì)疏松癥（NCT04313634）、骨關節(jié)炎（NCT04210986）和在療養(yǎng)院、住院病人和門診病人中發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒患者（分別為COVID-FIS, NCT04537299; COVID-FISETIN, NCT04476953和COVFIS-HOME, NCT04771611)的非瑟酮試驗。除了D+Q和非瑟酮，目前，一項Bcl-xL抑制劑UBX1325治療糖尿病黃斑水腫的試驗（NCT04537884）正在招募受試者。在一項擬用于治療骨關節(jié)炎的senolytic復合物UBX0101（p53負調(diào)節(jié)因子MDM2的抑制劑）的臨床試驗（NCT03513016）中，因為UBX0101服用組未能在中期評估中優(yōu)于安慰劑組，而被迫在2期臨床試驗時停止。這可能是由于多種因素造成的，其中包括可能的主要作用機制——MDM2抑制劑有異構(gòu)活性以及需要持續(xù)性給藥。此外，與臨床試驗中的單次注射相比，UBX0101在臨床前模型中需要多次注射治療，由于關節(jié)內(nèi)注射生理鹽水對骨關節(jié)炎患者報告結(jié)果的臨床益處，該試驗的 UBX0101 組的潛在益處也可能被掩蓋了。在這些研究和其他研究提供有關益處以及不良或脫靶效應的結(jié)果和數(shù)據(jù)之前，不應在臨床試驗之外施以senolytics療法。

表 2：關于senolytics療法正在進行或即將開始的臨床試驗

結(jié)論和未來方向

由于細胞衰老寬泛的影響，其研究在十年間增長十分迅速，在未來幾年必定會有更多新的衰老領域發(fā)現(xiàn)，然而，這之中依然存在巨大的差距與關鍵性問題。由于它們的表型依賴之前的應激環(huán)境，衰老細胞表現(xiàn)出滯后性。此外，衰老細胞在形式和功能上都是異質(zhì)性的。衰老表型因細胞類型、起源組織、駐留組織、功能作用及衰老誘導方式的不同而不同（圖3）。

圖三：細胞衰老的多層異質(zhì)性。

衰老細胞表現(xiàn)出環(huán)境依賴的表型多樣性。大量的刺激可以引起應激反應，足以引起細胞衰老。此外，對這些應激源的易感性和衰老細胞特征可能取決于細胞類型、組織、疾病狀態(tài)和其他背景。由此產(chǎn)生的衰老細胞在其分泌組和隨之產(chǎn)生的功能上表現(xiàn)出一系列趨同和不同的表型。

由于體外模型和從組織培養(yǎng)研究到體內(nèi)動物模型，以及最終到人類的轉(zhuǎn)化之間的差異，也讓這一點變得更加復雜。并且研究這些差異的模型也很少（表3）。當前的動物模型，如INK-ATTAC或p16-3MR小鼠和其他p16依賴的模型，其作用是有限的。因為p16Ink4a不是每個衰老細胞都特異表達的，一些非衰老細胞（類型普遍且豐富），如活化的巨噬細胞，也可以高水平表達p16Ink4a。最近開發(fā)了基于p21的小鼠系統(tǒng)，以解決這些問題并探索未表征的衰老細胞群。但是，不得而知的是小鼠的衰老細胞是否代表人類體內(nèi)的衰老細胞？我們已經(jīng)開始通過移植研究來回答這個問題，在某項研究中，人類衰老細胞被引入小鼠宿主，但是這一問題依然還未解決。

表3：基于CDKI的已構(gòu)建的衰老細胞模型

顯然，該領域需要新的動物模型、衰老細胞培養(yǎng)系統(tǒng)和附加的人類轉(zhuǎn)化實驗來推動。在對衰老細胞異質(zhì)性的不斷認識中，可能仍存在尚未定義的衰老細胞種群和亞群，它們可能具有獨特的表型，具有獨特的空間動力學，并以依賴于環(huán)境的方式發(fā)揮不同的生理和致病作用。更為重要的是，很少有研究來評估自然發(fā)生衰老的細胞特征，盡管這可能是與衰老表型最相關的。雖然有大量的臨床前證據(jù)表明，senolytics療法可以治療各種疾病過程，甚至補充再生療法，但是目前還不清楚如何將senolytics治療策略調(diào)節(jié)不同的衰老細胞群的方式轉(zhuǎn)化為臨床結(jié)果，也不清楚在預防性使用或在病程中使用時，senolytics的療效是否不同。理想情況下，隨著我們對衰老異質(zhì)性理解的不斷拓展，將越來越有可能使用合理的設計策略來瞄準并清除最有害的衰老細胞亞群（比如利用衰老細胞的單細胞差異基因表達譜）。然而，考慮到動物模型和人類自身之間的內(nèi)在差異，這些轉(zhuǎn)化問題仍具有挑戰(zhàn)性，這些內(nèi)在差異是由復雜的免疫功能和衰老細胞積累動力學的差異所構(gòu)成的。總之，這些缺口需要通過蓬勃發(fā)展的細胞衰老領域來填補，并可能在可預見的未來引起人們的廣泛興趣。