利用 Wakopak? Ultra APDSTAG? 定量

檢測氨基酸飲料的氨基酸

和光純藥工業(yè)株式會社 試劑化學實驗室 須藤　勇紀

◆前言

　　自從天冬酰胺在1806年從蘆筍汁中分離成功以來，人們開始發(fā)現(xiàn)氨基酸，并將其大致分為四類，即作為營養(yǎng)物質(zhì)的利用，作為味道成分的利用，生理作用的利用，反應性的利用，這些功能在我們生活中是不可缺少的 1）。另外，在動物體內(nèi)無法合成的氨基酸既是動物的必需氨基酸，也是很重要的食物營養(yǎng)素。

　　在日本實施的1991年特定保健食品體系、2002年保健功能食品體系、2015年功能性食品體系過程中，也是期待著將氨基酸作為保健品用于國民自我治療藥物的實踐中 2,3）。功能性標示食品制度因其呈報制度更便于新企業(yè)參與。2017年3月特定保健用食品的數(shù)量為 1,127 件，功能性標示食品從以往的 815 件正在急劇增加中。從而可預計保健食品市場將迅速擴大。氨基酸作為營養(yǎng)素的功能已被廣泛認可，以飲料、健康飲料、果凍等多種形態(tài)的氨基酸的食品流通于市場中 1），未來也將繼續(xù)推出更多含有氨基酸的新型食品。

◆3-氨基吡啶-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯（APDS）衍生化

　　高效液相色譜法（HPLC）中的氨基酸分析衍生化技術(shù)是很久以前便存在的，因此市面上也存在許多種類的衍生劑，其中包括茚三酮和鄰苯二甲醛。本次介紹的 APDS 氨基酸衍生化技術(shù)是一種具有高疏水性，且因其高電離效率更有利于反相 LC/MS（/MS）的方法。

　　該方法不僅用于味之素株式會社的“Amino index? 癌癥風險篩選”（AICS）7）。在食品分析中也用于氨基酸分析專用裝備（UF-Amino Station）的分析案例 8）。

　　Wakopak? Ultra APDSTAG? 是一種專用分析柱，可利用 LC / MS / MS 儀器對 APDS-氨基酸衍生物進行分離分析。本次我們介紹的是使用該柱分析市售氨基酸飲料中的氨基酸種類。

◆實驗方法和結(jié)果分析

　　樣品前處理和衍生化的流程如圖1所示，LC / MS / MS條件如表１所示。 定量采用內(nèi)標法進行。在這次實驗的飲料中，據(jù)材料記載氨基酸種類含有甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）和精氨酸（Arg）這六種種類，但市售飲料中都不含表１的 No.13~20 的氨基酸類。圖2顯示的是市售飲料中的６種氨基酸的 MRM 色譜分析圖。接下來，將氨基酸標準品加入到獲得該色譜的樣品中，并進行回收實驗。圖３顯示的是添加標準品后飲料的 MRM 色譜圖，而圖４則是加標回收實驗的結(jié)果顯示圖。回收率高達 99-103％。

　　根據(jù)這次研究的結(jié)果顯示，使用 Wakopak? Ultra APDS TAG? 進行 APDS 衍生化的氨基酸定量檢測是有效的。雖然這次推出的結(jié)果僅限于飲料，但對于分析其他食品和培養(yǎng)液等樣品也是有用的，歡迎采購此產(chǎn)品用于定量分析氨基酸。

表１．LC/MS/MS 條件

設備

Prominence LC-20A XR（島津公司）

柱

Wakopak? Ultra APDS TAG? φ2.1×100 mm（W）

防護過濾器

SunShell RP 防護過濾器（Cromanic   Technologies）

流動相 A

APDS TAG? 洗脫液

流動相 B

60％乙腈

梯度條件

0 min.（A：B=94：6）→0.05 min.（92：8）

→1.70 min.（92：8）   →1.71 min.（88：12）→4.95 min.（70：30）→5.95  min.（40：60）→5.96 min.（5：95）→6.70 min.（5：95）

→6.71 min.（94：6）→12 min.（94：6）

流量

0.3 mL/min.

柱溫

40 ℃

注射量

1 μL

設備

LCMS-8030 Plus（島津公司）

電離

ESI positive

測量模式

MRM

DL 溫度

250 ℃

霧化器氣體流量

1.5 L/min.

加熱塊溫度

250 ℃

干燥氣體流量

10 L/min.

No.

組件名稱（簡稱）

分子量

監(jiān)測因子（m/z）

前體

制品

1

甘氨酸（Gly）

75.1

196.1

121.0

2

甘氨酸-13C2，15N（Gly-IS）

78.1

199.1

121.1

3

丙氨酸（Ala）

89.1

210.1

121.0

4

丙氨酸-13C3（Ala-IS）

92.1

213.1

121.1

5

纈氨酸（Val）

117.2

238.1

121.0

6

纈氨酸-13C5,   15N（Val-IS）

123.1

244.1

121.1

7

亮氨酸（Leu）

131.2

252.1

121.0

8

異亮氨酸（Ile）

131.2

252.1

121.0

9

亮氨酸-5,5,5-d3（Leu-IS）

134.2

255.1

121.1

10

異亮氨酸-13C6,15N（Ile-IS）

138.1

259.1

121.1

11

精氨酸（精氨酸）

174.2

295.1

175.1

12

精氨酸-15N4（Arg-IS）

178.2

299.1

179.1

13

肌氨酸（Sar）

89.1

210.0

121.0

14

羥脯氨酸（Hypro）

131.1

252.1

121.0

15

天冬酰胺（Asn）

132.1

253.1

121.0

16

天冬氨酸（Asp）

133.1

254.1

121.0

17

谷氨酰胺（Gln）

146.1

267.1

121.0

18

谷氨酸（Glu）

147.1

268.1

121.0

19

α-氨基己二酸（α-AAA）

161.2

282.1

121.0

20

瓜氨酸（Cit）

175.2

296.3

121.0

圖2. 市售飲料中６種氨基酸成分的 MRM 色譜圖

圖3. 添加標準品后飲料的 MRM 色譜圖

圖4. 加標回收實驗的結(jié)果顯示圖

<致謝>感謝味之素股份有限公司的每一位同仁對本產(chǎn)品的合作。

 Wako Pack? Ultra APDS Tag? 通用 LC / MS 可以實現(xiàn)高靈敏度和高速氨基酸分析。

◆產(chǎn)品列表

產(chǎn)品編號

產(chǎn)品名稱

包裝

235-63973

Wakopak? Ultra APDS TAG? φ2.1mm × 100mm（ W）

1支

◆相關產(chǎn)品

產(chǎn)品編號

產(chǎn)品名稱

標準/制造商

規(guī)格

014-23841

Amino Acid Analysis Reagent (for LC/MS) (AminoTag(R))

氨基酸分析試劑

（用于LC/MS）

用于氨基酸自動分析

100 mg

016-28161

Amino Acids Mixture Standard Solution, Type AN (High Range)

氨基酸混合標準溶液, AN型（高濃度）

用于氨基酸自動分析 1 mL×5A，5 mL

010-28164

012-28141

Amino Acids Mixture Standard Solution, Type B (High Range)

氨基酸混合標準溶液, B型（高濃度）

用于氨基酸自動分析 1 mL×5A，5 mL

016-28144

019-28151

Amino Acids Mixture Standard Solution, Type H (High Range)

氨基酸混合標準溶液, H型（高濃度）

用于氨基酸自動分析 1 mL×5A，5 mL

013-28154

293-73701

APDS TAG? Wako Amino Acids Internal   Standard Mixture Solution

用于氨基酸自動分析

1套

010-23061

APDS Tag Wako Eluent

APDS標簽洗提液

用于氨基酸自動分析

1 L

019-23151

APDS Tag Wako Borate Buffer

APDS標簽硼酸鹽緩沖液

用于氨基酸自動分析

1 L

參考文獻

[1]　味の素株式會社 編：「アミノ酸ハンドブック」 （工業(yè)調(diào)査會）（2003）.

[2]　大澤 俊彥：化學と生物，44 （6），406 （2006）.

[3]　和田 他：分析化學，65 （6），301 （2016）.

[4]　湯田 直樹：健康?栄養(yǎng)食品研究，16 （1），1 （2017）.

[5]　特許第 4453363 號．

[6]　宮野 博：和光純薬時報，79 （1），2 （2011）.

[7]　今泉 明：化學と生物，53 （3），192 （2015）.

[8]　渡邊 他：島津評論，69 （1?2），47 （2012）.

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