利用Wakopak? Ultra APDSTAG? 定量

檢測(cè)氨基酸飲料的氨基酸

和光純藥工業(yè)株式會(huì)社 試劑化學(xué)實(shí)驗(yàn)室 須藤　勇紀(jì)

◆前言

　　自從天冬酰胺在1806年從蘆筍汁中分離成功以來(lái)，人們開始發(fā)現(xiàn)氨基酸，并將其大致分為四類，即作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用，作為味道成分的利用，生理作用的利用，反應(yīng)性的利用，這些功能在我們生活中是不可缺少的 1）。另外，在動(dòng)物體內(nèi)無(wú)法合成的氨基酸既是動(dòng)物的必需氨基酸，也是很重要的食物營(yíng)養(yǎng)素。

　　在日本實(shí)施的1991年特定保健食品體系、2002年保健功能食品體系、2015年功能性食品體系過(guò)程中，也是期待著將氨基酸作為保健品用于國(guó)民自我治療藥物的實(shí)踐中 2,3）。功能性標(biāo)示食品制度因其呈報(bào)制度更便于新企業(yè)參與。2017年3月特定保健用食品的數(shù)量為1,127件，功能性標(biāo)示食品從以往的815件正在急劇增加中。從而可預(yù)計(jì)保健食品市場(chǎng)將迅速擴(kuò)大。氨基酸作為營(yíng)養(yǎng)素的功能已被廣泛認(rèn)可，以飲料，健康飲料，果凍等多種形態(tài)的氨基酸的食品流通于市場(chǎng)中 1），未來(lái)也將繼續(xù)推出更多含有氨基酸的新型食品。

◆3-氨基吡啶-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯（APDS）衍生化

　　高效液相色譜法（HPLC）中的氨基酸分析衍生化技術(shù)是很久以前便存在的，因此市面上也存在許多種類的衍生劑，其中包括茚三酮和鄰苯二甲醛。本次介紹的APDS氨基酸衍生化技術(shù)是一種具有高疏水性，且因其高電離效率更有利于反相LC/MS（/MS）的方法。

　　該方法不僅用于味之素株式會(huì)社的“Amino index? 癌癥風(fēng)險(xiǎn)篩選”（AICS）7）。在食品分析中也用于氨基酸分析專用裝備（UF-Amino Station）的分析案例 8）。

　　Wakopak? Ultra APDSTAG? 是一種專用分析柱，可利用LC / MS / MS儀器對(duì)APDS-氨基酸衍生物進(jìn)行分離分析。本次我們介紹的是使用該柱分析市售氨基酸飲料中的氨基酸種類。

◆實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果分析

　　樣品前處理和衍生化的流程如圖1所示，LC / MS / MS條件如表1所示。 定量采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行。在這次實(shí)驗(yàn)的飲料中，據(jù)材料記載氨基酸種類含有甘氨酸（Gly），丙氨酸（Ala），纈氨酸（Val），亮氨酸（Leu），異亮氨酸（Ile）和精氨酸（Arg）這六種種類，但市售飲料中都不含表1的No.13?20的氨基酸類。圖2顯示的是市售飲料中的6種氨基酸的MRM色譜分析圖。接下來(lái)，將氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品加入到獲得該色譜的樣品中，并進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)。圖3顯示的是添加標(biāo)準(zhǔn)品后飲料的MRM色譜圖，而圖4則是加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示圖?；厥章矢哌_(dá)99-103％。

　　根據(jù)這次研究的結(jié)果顯示，使用Wakopak? Ultra APDS TAG? 進(jìn)行APDS衍生化的氨基酸定量檢測(cè)是有效的。雖然這次推出的結(jié)果僅限于飲料，但對(duì)于分析其他食品和培養(yǎng)液等樣品也是有用的，歡迎采購(gòu)此產(chǎn)品用于定量分析氨基酸。

表１．LC/MS/MS條件

設(shè)備

Prominence LC-20A XR（島津公司）

柱

Wakopak? Ultra APDS TAG? φ2.1×100 mm（W）

防護(hù)過(guò)濾器

SunShell RP防護(hù)過(guò)濾器（Cromanic   Technologies）

流動(dòng)相A

APDS TAG? 洗脫液

流動(dòng)相B

60％乙腈

梯度條件

0min（. A：B=94：6）→0.05min.（. 92：8）→1.70min.（92：8）   →1.71min.（88：12）→4.95min.（70：30）→5.95min.（40：60）→5.96min.（5：95）→6.70min.（5：95）→6.71min.（94：6）→12min.（94：6）

流量

0.3 mL/min.

柱溫

40 ℃

注射量

1μL

設(shè)備

LCMS-8030 Plus（島津公司）

電離

ESI positive

測(cè)量模式

MRM

DL溫度

250 ℃

霧化器氣體流量

1.5 L/min.

加熱塊溫度

250 ℃

干燥氣體流量

10 L/min.

No.

組件名稱（簡(jiǎn)稱）

分子量

監(jiān)測(cè)因子（m / z）

前體

制品

1

甘氨酸（Gly）

75.1

196.1

121.0

2

甘氨酸-13C2，15N（Gly-IS）

78.1

199.1

121.1

3

丙氨酸（Ala）

89.1

210.1

121.0

4

丙氨酸-13C3（Ala-IS）

92.1

213.1

121.1

5

纈氨酸（Val）

117.2

238.1

121.0

6

纈氨酸-13C5,   15N（Val-IS）

123.1

244.1

121.1

7

亮氨酸（Leu）

131.2

252.1

121.0

8

異亮氨酸（Ile）

131.2

252.1

121.0

9

亮氨酸-5,5,5-d3（Leu-IS）

134.2

255.1

121.1

10

異亮氨酸-13C6,15N（Ile-IS）

138.1

259.1

121.1

11

精氨酸（精氨酸）

174.2

295.1

175.1

12

精氨酸-15N4（Arg-IS）

178.2

299.1

179.1

13

肌氨酸（Sar）

89.1

210.0

121.0

14

羥脯氨酸（Hypro）

131.1

252.1

121.0

15

天冬酰胺（Asn）

132.1

253.1

121.0

16

天冬氨酸（Asp）

133.1

254.1

121.0

17

谷氨酰胺（Gln）

146.1

267.1

121.0

18

谷氨酸（Glu）

147.1

268.1

121.0

19

α-氨基己二酸（α-AAA）

161.2

282.1

121.0

20

瓜氨酸（Cit）

175.2

296.3

121.0

圖2.市售飲料中6種氨基酸成分的MRM色譜圖

圖3.添加標(biāo)準(zhǔn)品后飲料的MRM色譜圖

圖4.加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示圖

<致謝>感謝味之素股份有限公司的每一位同仁對(duì)本產(chǎn)品的合作。

 Wako Pack? Ultra APDS Tag?通用LC / MS可以實(shí)現(xiàn)高靈敏度和高速氨基酸分析。

◆產(chǎn)品列表

產(chǎn)品編號(hào)

產(chǎn)品名稱

包裝

235-63973

Wakopak? Ultra APDS TAG? φ2.1mm × 100mm（ W）

1支

◆相關(guān)產(chǎn)品

產(chǎn)品編號(hào)

產(chǎn)品名稱

標(biāo)準(zhǔn)/制造商

規(guī)格

014-23841

Amino Acid Analysis Reagent (for LC/MS) (AminoTag(R))

氨基酸分析試劑

（用于LC/MS）

用于氨基酸自動(dòng)分析

100mg

011-14463

Amino Acids Mixture Standard Solution, Type AN-2

氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液, AN-2型

用于氨基酸自動(dòng)分析

1mL×5A 5mL

015-14461

012-08643

Amino Acids Mixture Standard Solution, Type B

氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液, B型

用于氨基酸自動(dòng)分析

1mL×5A 5mL

016-08641

019-08393

Amino Acids Mixture Standard Solution, Type H

氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液, H型

用于氨基酸自動(dòng)分析

1mL×5A 5mL

013-08391

293-73701

APDS TAG? Wako Amino Acids Internal   Standard Mixture Solution

用于氨基酸自動(dòng)分析

1套

010-23061

APDS Tag Wako Eluent

APDS標(biāo)簽洗提液

用于氨基酸自動(dòng)分析

1L

019-23151

APDS Tag Wako Borate Buffer

APDS標(biāo)簽硼酸鹽緩沖液

用于氨基酸自動(dòng)分析

1L

380-04131

SunShell RP Guard Filter Starter kit 

（a holder, a cartridge, a tubing）

Cromic技術(shù)

1套

[參考文獻(xiàn)]

[1]　味の素株式會(huì)社 編：「アミノ酸ハンドブック」 （工業(yè)調(diào)査會(huì)）（2003）.

[2]　大澤 俊彥：化學(xué)と生物，44 （6），406 （2006）.

[3]　和田 他：分析化學(xué)，65 （6），301 （2016）.

[4]　湯田 直樹：健康?栄養(yǎng)食品研究，16 （1），1 （2017）.

[5]　特許第 4453363 號(hào)．

[6]　宮野 博：和光純薬時(shí)報(bào)，79 （1），2 （2011）.

[7]　今泉 明：化學(xué)と生物，53 （3），192 （2015）.

[8]　渡邊 他：島津評(píng)論，69 （1?2），47 （2012）.

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