成體肝穩(wěn)態(tài)中，肝細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，增殖緩慢；當(dāng)肝臟發(fā)生損傷后，肝細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期，參與損傷修復(fù)，維持肝臟功能。近年來，越來越多的實(shí)驗(yàn)證明在肝臟損傷中，肝細(xì)胞具有顯著的再生能力，肝損傷主要通過肝細(xì)胞的自我增殖進(jìn)行損傷修復(fù)，而肝祖細(xì)胞對肝細(xì)胞的貢獻(xiàn)幾乎可以忽略。 然而，愛丁堡大學(xué)Forbes研究組在肝細(xì)胞中進(jìn)行β1-integrin基因敲除或者p21基因過表達(dá)來抑制肝細(xì)胞的增殖，同時(shí)利用譜系示蹤技術(shù)標(biāo)記膽管上皮細(xì)胞，在肝損傷模型中直接觀察到膽管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肝細(xì)胞，促進(jìn)肝臟損傷修復(fù)。 

同一時(shí)期，第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院謝渭芬研究組等通過給予小鼠長期喂養(yǎng)TAA等藥物來誘導(dǎo)慢性肝損傷，觀察到在慢性肝損傷過程中膽管上皮細(xì)胞可以轉(zhuǎn)分化為肝細(xì)胞參與肝臟再生。隨后，多個(gè)不同研究組獨(dú)立證明在肝細(xì)胞增殖受阻的肝損傷條件下，膽管上皮細(xì)胞可以貢獻(xiàn)給肝細(xì)胞參與肝臟損傷修復(fù)。 然而，關(guān)于膽管上皮細(xì)胞向肝細(xì)胞分化是否經(jīng)歷肝臟祖細(xì)胞狀態(tài)這一細(xì)胞機(jī)制及膽管上皮細(xì)胞向肝細(xì)胞分化的分子機(jī)制尚未明確，其中一個(gè)重要原因是以前報(bào)道的方法誘導(dǎo)膽管上皮細(xì)胞向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)變的效率太低，很難進(jìn)行細(xì)胞和分子機(jī)制的深入研究。 

近日，中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（中科院生化細(xì)胞所）周斌研究組和諾華生物醫(yī)學(xué)研究所Jan S. Tchorz研究組合作，在 Nature Genetics 期刊發(fā)表了發(fā)表題為：Bipotent transitional liver progenitor cells contribute to liver regeneration 的研究論文。 該研究在人類多種肝臟疾病和小鼠肝損傷模型中鑒定出一群同時(shí)表達(dá)膽管上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞特征的肝臟祖細(xì)胞；發(fā)現(xiàn)這群肝臟祖細(xì)胞起源于膽管上皮細(xì)胞；利用雙同源重組示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)這群肝臟祖細(xì)胞具有向膽管上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞分化的能力；通過基因敲除及過表達(dá)發(fā)現(xiàn)Notch和WNT/β-catenin信號(hào)通路分別調(diào)控膽管上皮細(xì)胞向肝臟祖細(xì)胞、肝臟祖細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化。

在這項(xiàng)研究中，研究人員首先構(gòu)建了高效穩(wěn)定的膽管上皮細(xì)胞向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的遺傳學(xué)模型，為膽管上皮細(xì)胞向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞及分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。研究人員在 Fah 基因中插入loxp-stop-loxp序列，構(gòu)建了 Fah-loxp-stop-loxp （Fah-LSL） 小鼠，阻止 Fah 基因的正常表達(dá)。 Fah-LSL 小鼠與組織特異性CreER小鼠結(jié)合可以在特定類型細(xì)胞中發(fā)生Cre-loxp同源重組，切除stop序列，使細(xì)胞恢復(fù)表達(dá)Fah基因的能力。對 CK19-CreER;R26-tdT;Fah-LSL/Fah-LSL 小鼠進(jìn)行他莫昔芬誘導(dǎo)，可將膽管上皮細(xì)胞及其子代細(xì)胞標(biāo)記為tdT + ，同時(shí)在膽管上皮細(xì)胞及其子代細(xì)胞中將 Fah 基因中的stop序列切除，使膽管上皮細(xì)胞及其子代細(xì)胞恢復(fù)表達(dá) Fah 基因的能力。之后對小鼠停止給予NTBC藥物，肝臟呈現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷狀態(tài)，刺激膽管上皮細(xì)胞向肝細(xì)胞分化。

該遺傳學(xué)模型從基因組水平進(jìn)行全身性 Fah 基因敲除，不存在抑制肝細(xì)胞增殖的效率問題，因?yàn)槊總€(gè)肝細(xì)胞都是缺乏 Fah 基因的，這樣能夠高效穩(wěn)定地誘導(dǎo)具有表達(dá) Fah 基因能力的膽管上皮細(xì)胞向肝細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，為研究轉(zhuǎn)分化的細(xì)胞和分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 在 Fah-LSL/Fah-LSL 小鼠誘導(dǎo)的肝損傷中，研究人員對Epcam+細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果顯示Epcam+細(xì)胞群分為不同亞群；一群細(xì)胞高表達(dá)細(xì)胞增殖相關(guān)基因 （Cdk1） ，定義為增殖的膽管上皮細(xì)胞群 （Proliferating BECs） ；一群細(xì)胞同時(shí)表達(dá)膽管上皮細(xì)胞分子標(biāo)記 （Krt19、Epcam） 和肝細(xì)胞分子標(biāo)記 （HNF4a、Ttr） ，定義為肝臟祖細(xì)胞群 （LPCs） 。將上述單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)與之前報(bào)道的2組DDC誘導(dǎo)的肝損傷中Epcam+細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，研究人員未在DDC誘導(dǎo)的肝損傷中檢測到肝臟祖細(xì)胞；也未在正常肝臟中檢測到肝臟祖細(xì)胞。

同時(shí)，研究人員通過免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)在 Fah-LSL/Fah-LSL 小鼠誘導(dǎo)的肝損傷中檢測到CK19+HNF4a+的肝祖細(xì)胞，并且這些細(xì)胞也表達(dá)Epcam、A6、OPN等肝臟祖細(xì)胞分子標(biāo)記；而DDC誘導(dǎo)的肝損傷中未檢測到CK19+HNF4a+的肝祖細(xì)胞。 此外，研究人員在多種人類肝臟疾病包括非酒精性脂肪性肝炎和病毒性肝炎等中發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞呈現(xiàn)衰老狀態(tài)，并檢測到CK19+HNF4a+肝祖細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞的衰老程度與肝祖細(xì)胞的產(chǎn)生呈現(xiàn)正相關(guān)聯(lián)系；并且在這些人類肝臟疾病中，膽管上皮細(xì)胞未呈現(xiàn)衰老狀態(tài)，提示在人的肝臟疾病中，膽管上皮細(xì)胞可能作為肝臟祖細(xì)胞的來源貢獻(xiàn)給肝細(xì)胞而發(fā)揮重要作用。 

研究人員對單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行擬時(shí)序分析發(fā)現(xiàn)肝臟祖細(xì)胞來源于膽管上皮細(xì)胞；之后利用 CK19-CreER 工具小鼠標(biāo)記并示蹤膽管上皮細(xì)胞，揭示膽管上皮細(xì)胞可以貢獻(xiàn)給肝臟祖細(xì)胞。為了研究肝臟祖細(xì)胞的分化潛能，研究人員利用雙同源重組酶介導(dǎo)的譜系示蹤技術(shù)來標(biāo)記肝臟祖細(xì)胞，示蹤結(jié)果揭示肝臟祖細(xì)胞具有向膽管上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞分化的潛能。值得注意的是，肝臟祖細(xì)胞不具有增殖活性，并且單個(gè)肝臟祖細(xì)胞不能同時(shí)產(chǎn)生膽管上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞。 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)顯示肝臟祖細(xì)胞群相較于膽管上皮細(xì)胞群下調(diào)表達(dá)Hippo信號(hào)通路相關(guān)基因和Notch信號(hào)通路相關(guān)基因，提示Notch信號(hào)通路調(diào)控膽管上皮細(xì)胞向肝臟祖細(xì)胞的分化。

研究人員在膽管上皮細(xì)胞中進(jìn)行 Rbpj 基因敲除，發(fā)現(xiàn)抑制Notch信號(hào)通路能夠促進(jìn)膽管上皮細(xì)胞向肝臟祖細(xì)胞分化，從而促進(jìn)膽管上皮細(xì)胞向肝細(xì)胞分化。此外，研究人員利用Dibenzazepine藥物來抑制Notch信號(hào)通路也證實(shí)抑制Notch信號(hào)通路能夠促進(jìn)膽管上皮細(xì)胞向肝臟祖細(xì)胞分化，從而促進(jìn)膽管上皮細(xì)胞向肝細(xì)胞分化。當(dāng)在膽管上皮細(xì)胞中激活Notch信號(hào)通路后，則完全抑制了膽管上皮細(xì)胞向肝臟祖細(xì)胞的分化，阻礙了肝臟再生。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)顯示膽管上皮細(xì)胞分化產(chǎn)生的肝細(xì)胞相較于肝臟祖細(xì)胞上調(diào)表達(dá)WNT/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因，提示W(wǎng)NT/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控膽管上皮細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化。研究人員在膽管上皮細(xì)胞中進(jìn)行β-catenin基因敲除，發(fā)現(xiàn)抑制WNT/β-catenin信號(hào)通路阻礙了肝臟祖細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化；而在膽管上皮細(xì)胞中激活WNT/β-catenin信號(hào)通路能夠促進(jìn)膽管上皮細(xì)胞向肝臟祖細(xì)胞分化，促進(jìn)膽管上皮細(xì)胞向肝細(xì)胞分化；并且在膽管上皮細(xì)胞中激活WNT/β-catenin信號(hào)通路后促進(jìn)肝臟祖細(xì)胞中肝細(xì)胞基因以及肝細(xì)胞代謝相關(guān)基因的上調(diào)，提示激活WNT/β-catenin信號(hào)通路能夠促進(jìn)肝臟祖細(xì)胞向肝細(xì)胞分化。此外，研究人員利用RSPO1重組蛋白來激活WNT/β-catenin信號(hào)通路，也能夠顯著促進(jìn)膽管上皮細(xì)胞向肝細(xì)胞分化。

以上研究揭示了膽管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肝細(xì)胞的細(xì)胞及分子調(diào)控機(jī)制，為肝臟祖細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生肝細(xì)胞治療肝臟疾病的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供新的理論基礎(chǔ)和研究思路。

雙潛能肝臟祖細(xì)胞促進(jìn)肝臟再生機(jī)制，a, 示意圖顯示肝臟祖細(xì)胞起源于膽管上皮細(xì)胞，并在肝臟再生中貢獻(xiàn)給肝細(xì)胞。肝臟祖細(xì)胞是雙潛能的，可以分化為肝細(xì)胞或膽管上皮細(xì)胞，但是一個(gè)肝臟祖細(xì)胞不能同時(shí)產(chǎn)生肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞。b, 示意圖顯示抑制Notch信號(hào)能促進(jìn)膽管上皮細(xì)胞向肝臟祖細(xì)胞分化，激活Notch信號(hào)則抑制這一分化過程而促進(jìn)膽管上皮細(xì)胞增殖。c, 示意圖顯示抑制WNT信號(hào)削弱肝臟祖細(xì)胞向肝細(xì)胞分化，激活WNT信號(hào)會(huì)促進(jìn)膽管上皮細(xì)胞向肝臟祖細(xì)胞和肝臟祖細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化。 

中科院分子細(xì)胞卓越中心周斌研究組副研究員蒲文娟和博士生朱歡、張銘珺為該論文的共同第一作者，周斌研究員和諾華生物醫(yī)學(xué)研究所Jan S. Tchorz博士為論文共同通訊作者。該研究得到瑞士巴塞爾大學(xué)Heim Markus、意大利IRCCS Humanitas大學(xué)Luigi Terracciano等大力支持和幫助。該工作得到中科院、基金委、科技部和上海市科委等部門的經(jīng)費(fèi)資助。 

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