技術(shù)特征：

1.一種乳糖酶，其特征在于，所述乳糖酶氨基酸序列如序列表seqidno.2、4、6、8、10、12、14、16或18所示。

2.權(quán)利要求1所述的一種乳糖酶，其特征在于，所述乳糖酶編碼基因如序列表seqidno.1、3、5、7、9、11、13、15或17所示。

3.含有權(quán)利要求2所述乳糖酶編碼基因的重組載體或重組菌株。

4.如權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于，采用的表達載體包括但不限于phy-wzx，pbl-wzx，phy300plk，pub110，pe194，pht1469，pwh1520；

或phse-001、phse-002、phse-003、phse-004、phse-005、phse-006、phse-007、phse-008、phse-009、phse-010、phse-011、phse-012、phse-013、phse-014、phse-015、phse-016、phse-017、phse-018。

5.如權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于，采用的表達載體phse-018是以phy-wzx為基礎(chǔ)表達載體的骨架，整合來源于地衣芽胞桿菌淀粉酶啟動子pamyl和堿性蛋白酶apre的信號肽所得；

所述pamyl如seqidno.20所示，所述堿性蛋白酶apre的信號肽如seqidno.23所示。

6.如權(quán)利要求3所述的重組菌株，其特征在于，所述重組菌株采用的表達宿主包括但不限于枯草芽胞桿菌、環(huán)狀芽胞桿菌、巨大芽胞桿菌、短小芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌、谷氨酸棒桿菌、地衣芽胞桿菌。

7.如權(quán)利要求6所述的重組菌株，其特征在于，所述重組菌株采用的表達宿主為突變株bcbt0529，是在地衣芽胞桿菌cbb3008，編號cctccno.m208236的基因組上敲除apre，vpr，wpr，lacr，laca，laca2，yesz基因所得；

apre，vpr，wpr，lacr，laca，laca2，yesz基因的genbank登錄號分別為：mt885340、mt885341、mt885342、mt885336、mt885337、mt885338、mt885339。

8.如權(quán)利要求7所述的重組菌株，其特征在于，具體為地衣芽胞桿菌bcbtbc168d，是將seqidno.17所示的bcbg168-d編碼基因整合在phse-008質(zhì)粒上，并在宿主細(xì)胞突變株bcbt0529中進行表達所得。

9.權(quán)利要求3所述重組菌發(fā)酵生產(chǎn)乳糖酶的方法，其特征在于，搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)乳糖酶：接種重組菌至搖瓶培養(yǎng)基，30～45℃、120-270r/min下培養(yǎng)2～3天；

搖瓶培養(yǎng)基組成：酵母膏0.5～1.5％，蛋白胨1.2～3.6％，葡萄糖8～20％；ph7.0。

10.權(quán)利要求3所述重組菌發(fā)酵生產(chǎn)乳糖酶的方法，其特征在于，發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)乳糖酶：將菌種按接種量為5％-10％接入發(fā)酵罐培養(yǎng)基；發(fā)酵過程中采用發(fā)酵溫度33～45℃，控制溶氧為0.1％～20％，ph為6.0～7.8，流加30％～60％麥芽糖漿并維持還原糖含量在0.1％-5％；發(fā)酵持續(xù)90～120h，發(fā)酵終點控制為發(fā)酵酶活增加值小于5-20u/(ml·h)。

發(fā)酵罐培養(yǎng)基組成為：麥芽糖漿1％～5％，棉籽粉0％～5％，玉米漿0％-4％，豆餅粉0.5～5％，硫酸銨0.1～5％，ph6.0～8.0。

11.權(quán)利要求9或10所述重組菌發(fā)酵生產(chǎn)乳糖酶的方法，其特征在于，發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)板框過濾除去菌體，再經(jīng)超濾系統(tǒng)過濾后獲得酶液。

12.權(quán)利要求3所述重組載體或重組菌株在生產(chǎn)乳糖酶中的應(yīng)用。

13.權(quán)利要求1或2所述乳糖酶在生產(chǎn)低聚半乳糖中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及生成低聚半乳糖的乳糖酶及其制備和應(yīng)用。本發(fā)明以兩種來源的乳糖酶(來源于環(huán)狀芽胞桿菌B2301的BglD305和來源于環(huán)狀芽胞桿菌ATCC 31382的BglD)分子為基礎(chǔ)進行分子進化，獲得合成低聚半乳糖效率高、表達性能好的乳糖酶新酶分子；并構(gòu)建乳糖酶高產(chǎn)菌株，能夠在深層發(fā)酵時高效合成乳糖酶并將酶蛋白分子分泌到培養(yǎng)基中，從發(fā)酵上清中直接制備高活性的酶制劑，乳糖酶的表達水平可以達到2208U/mL，有助于降低乳糖酶的發(fā)酵制造成本、簡化發(fā)酵制造工藝并提高乳糖酶酶制劑的質(zhì)量。

技術(shù)研發(fā)人員：王正祥;牛丹丹;田康明
受保護的技術(shù)使用者：天津科技大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：2020.09.29
技術(shù)公布日：2021.03.30

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