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一種低聚半乳糖生產(chǎn)專用酶及其制備與應(yīng)用的制作方法

來源:泰然健康網(wǎng) 時間:2024年12月24日 19:35

技術(shù)特征:

1.一種乳糖酶,其特征在于,所述乳糖酶氨基酸序列如序列表seqidno.2、4、6、8、10、12、14、16或18所示。

2.權(quán)利要求1所述的一種乳糖酶,其特征在于,所述乳糖酶編碼基因如序列表seqidno.1、3、5、7、9、11、13、15或17所示。

3.含有權(quán)利要求2所述乳糖酶編碼基因的重組載體或重組菌株。

4.如權(quán)利要求3所述的重組載體,其特征在于,采用的表達載體包括但不限于phy-wzx,pbl-wzx,phy300plk,pub110,pe194,pht1469,pwh1520;

或phse-001、phse-002、phse-003、phse-004、phse-005、phse-006、phse-007、phse-008、phse-009、phse-010、phse-011、phse-012、phse-013、phse-014、phse-015、phse-016、phse-017、phse-018。

5.如權(quán)利要求3所述的重組載體,其特征在于,采用的表達載體phse-018是以phy-wzx為基礎(chǔ)表達載體的骨架,整合來源于地衣芽胞桿菌淀粉酶啟動子pamyl和堿性蛋白酶apre的信號肽所得;

所述pamyl如seqidno.20所示,所述堿性蛋白酶apre的信號肽如seqidno.23所示。

6.如權(quán)利要求3所述的重組菌株,其特征在于,所述重組菌株采用的表達宿主包括但不限于枯草芽胞桿菌、環(huán)狀芽胞桿菌、巨大芽胞桿菌、短小芽胞桿菌、解淀粉芽胞桿菌、谷氨酸棒桿菌、地衣芽胞桿菌。

7.如權(quán)利要求6所述的重組菌株,其特征在于,所述重組菌株采用的表達宿主為突變株bcbt0529,是在地衣芽胞桿菌cbb3008,編號cctccno.m208236的基因組上敲除apre,vpr,wpr,lacr,laca,laca2,yesz基因所得;

apre,vpr,wpr,lacr,laca,laca2,yesz基因的genbank登錄號分別為:mt885340、mt885341、mt885342、mt885336、mt885337、mt885338、mt885339。

8.如權(quán)利要求7所述的重組菌株,其特征在于,具體為地衣芽胞桿菌bcbtbc168d,是將seqidno.17所示的bcbg168-d編碼基因整合在phse-008質(zhì)粒上,并在宿主細(xì)胞突變株bcbt0529中進行表達所得。

9.權(quán)利要求3所述重組菌發(fā)酵生產(chǎn)乳糖酶的方法,其特征在于,搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)乳糖酶:接種重組菌至搖瓶培養(yǎng)基,30~45℃、120-270r/min下培養(yǎng)2~3天;

搖瓶培養(yǎng)基組成:酵母膏0.5~1.5%,蛋白胨1.2~3.6%,葡萄糖8~20%;ph7.0。

10.權(quán)利要求3所述重組菌發(fā)酵生產(chǎn)乳糖酶的方法,其特征在于,發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)乳糖酶:將菌種按接種量為5%-10%接入發(fā)酵罐培養(yǎng)基;發(fā)酵過程中采用發(fā)酵溫度33~45℃,控制溶氧為0.1%~20%,ph為6.0~7.8,流加30%~60%麥芽糖漿并維持還原糖含量在0.1%-5%;發(fā)酵持續(xù)90~120h,發(fā)酵終點控制為發(fā)酵酶活增加值小于5-20u/(ml·h)。

發(fā)酵罐培養(yǎng)基組成為:麥芽糖漿1%~5%,棉籽粉0%~5%,玉米漿0%-4%,豆餅粉0.5~5%,硫酸銨0.1~5%,ph6.0~8.0。

11.權(quán)利要求9或10所述重組菌發(fā)酵生產(chǎn)乳糖酶的方法,其特征在于,發(fā)酵結(jié)束后,經(jīng)板框過濾除去菌體,再經(jīng)超濾系統(tǒng)過濾后獲得酶液。

12.權(quán)利要求3所述重組載體或重組菌株在生產(chǎn)乳糖酶中的應(yīng)用。

13.權(quán)利要求1或2所述乳糖酶在生產(chǎn)低聚半乳糖中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及生成低聚半乳糖的乳糖酶及其制備和應(yīng)用。本發(fā)明以兩種來源的乳糖酶(來源于環(huán)狀芽胞桿菌B2301的BglD305和來源于環(huán)狀芽胞桿菌ATCC 31382的BglD)分子為基礎(chǔ)進行分子進化,獲得合成低聚半乳糖效率高、表達性能好的乳糖酶新酶分子;并構(gòu)建乳糖酶高產(chǎn)菌株,能夠在深層發(fā)酵時高效合成乳糖酶并將酶蛋白分子分泌到培養(yǎng)基中,從發(fā)酵上清中直接制備高活性的酶制劑,乳糖酶的表達水平可以達到2208U/mL,有助于降低乳糖酶的發(fā)酵制造成本、簡化發(fā)酵制造工藝并提高乳糖酶酶制劑的質(zhì)量。

技術(shù)研發(fā)人員:王正祥;牛丹丹;田康明
受保護的技術(shù)使用者:天津科技大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日:2020.09.29
技術(shù)公布日:2021.03.30

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