前言

T細(xì)胞受體(TCR)工程化T細(xì)胞是用于治療多種晚期癌癥的過繼細(xì)胞療法的新選擇。使用TCR工程化T細(xì)胞的工作始于20多年前，大量臨床前研究表明此類細(xì)胞可以介導(dǎo)腫瘤溶解和根除。

這些試驗(yàn)的成功為臨床試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)，包括最近使用TCR工程化T細(xì)胞靶向食管鱗狀細(xì)胞癌的臨床成功這些成功證明了這種方法治療癌癥的潛力。

在這里對(duì)TCR工程化T細(xì)胞在癌癥治療中的當(dāng)前和未來應(yīng)用提供了一個(gè)觀點(diǎn)?？偨Y(jié)側(cè)重于TCR激活以及TCR工程化T細(xì)胞的臨床前和臨床應(yīng)用。還討論了如何增強(qiáng)TCR工程化T細(xì)胞的功能并延長(zhǎng)其在腫瘤微環(huán)境中的壽命。

介紹

早在1976年就表明，作為T細(xì)胞生長(zhǎng)因子的白細(xì)胞介素2(IL-2)在體外誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖而不喪失效應(yīng)子功能?，F(xiàn)在已知細(xì)胞因子IL-2對(duì)于響應(yīng)T細(xì)胞的持續(xù)克隆擴(kuò)增至關(guān)重要。

Rosenberg等人的一項(xiàng)研究。證明同基因腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)可以在IL-2存在的情況下進(jìn)行擴(kuò)增。將這些TIL過繼轉(zhuǎn)移到小鼠模型被證明會(huì)導(dǎo)致肺和肝臟腫瘤的消退。

隨后，使用自體TIL的過繼細(xì)胞療法已成為誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者長(zhǎng)期消退的最有效方法之一。TIL的存在還與其他癌癥類型的預(yù)后改善有關(guān)，包括卵巢癌、結(jié)腸癌和乳腺癌。

早期研究發(fā)現(xiàn)，從黑色素瘤患者體內(nèi)分離的TIL識(shí)別出兩種非突變的黑色素瘤黑色素細(xì)胞分化蛋白：MART-1和gp100。

MART-1和gp100蛋白通常由皮膚、眼睛和耳朵中的黑素細(xì)胞表達(dá)。然而，許多癌癥完全消退的患者在用靶向MART-1或gp100的TIL治療后沒有毒性反應(yīng)。

這表明TIL中的抗原特異性T細(xì)胞對(duì)癌癥消退至關(guān)重要。然而，純化用作治療所需的抗原特異性T細(xì)胞的數(shù)量存在幾個(gè)障礙：

(1)很難從許多癌癥患者中分離出腫瘤特異性T細(xì)胞；(2)獲得治療量的腫瘤特異性T細(xì)胞需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。

隨著T細(xì)胞受體(TCR)工程技術(shù)的引入，生產(chǎn)抗原特異性T細(xì)胞成為可能。工程化、腫瘤抗原特異性T細(xì)胞治療已證明在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、結(jié)直腸癌、滑膜肉瘤和多發(fā)性骨髓瘤患者中取得了顯著的臨床成功（圖1）。

因此，腫瘤抗原特異性TCR基因工程T細(xì)胞被認(rèn)為是癌癥患者潛在的“現(xiàn)成”治療方法。

圖1. TCR工程化T細(xì)胞療法的過程。

T細(xì)胞是從患者血液或腫瘤組織中分離出來的。然后從單個(gè)T細(xì)胞克隆中分離出TCRα和β鏈，并插入慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中。

從患者外周血中分離的T細(xì)胞可以用慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)行修飾，以編碼所需的TCRαβ序列。這些經(jīng)過修飾的T細(xì)胞隨后在體外擴(kuò)增，以獲得足夠的數(shù)量用于治療和重新輸回患者體內(nèi)。

TCR激活的基礎(chǔ)

pMHC分子的TCR識(shí)別

TCR在T細(xì)胞表面表達(dá)，由兩條不同的蛋白鏈組成。在大多數(shù)成熟T細(xì)胞中，TCR由α和β鏈組成，盡管有較少數(shù)量的T細(xì)胞，其中TCR由γ和δ鏈組成。αβTCR的抗原識(shí)別是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)功能的核心。αβTCR與抗原呈遞細(xì)胞表面的肽主要組織相容性復(fù)合體(pMHC)結(jié)合。

由于T細(xì)胞能夠區(qū)分稀有的外源pMHC和豐富的自身pMHC分子，αβTCR和pMHC之間的相互作用是高度特異性的。CD8+T細(xì)胞在癌癥患者的適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，并被特定肽表位的TCR識(shí)別激活。

這些肽表位主要由內(nèi)源性蛋白質(zhì)產(chǎn)生，這些蛋白質(zhì)由腫瘤細(xì)胞表面的MHC I類蛋白質(zhì)呈遞。MHC I類蛋白質(zhì)是在幾乎所有有核細(xì)胞上表達(dá)的膜蛋白質(zhì)。

它們由人類白細(xì)胞抗原（HLA-A、B和C）基因的幾個(gè)家族編碼。HLA基因的表達(dá)可以通過干擾素(IFN)信號(hào)傳導(dǎo)上調(diào)，但表達(dá)是通常在腫瘤中顯著下調(diào)。

下調(diào)程度與免疫逃逸和疾病進(jìn)展相關(guān)癌癥。T細(xì)胞活化需要將pMHC抗原與TCR結(jié)合，然后翻譯為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路。體外和體內(nèi)研究表明，抗原的劑量決定了T細(xì)胞中細(xì)胞因子表達(dá)的性質(zhì)。

TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

通過TCR/pMHC相互作用激活后，幼稚T細(xì)胞會(huì)經(jīng)歷10到20輪細(xì)胞分裂的克隆擴(kuò)增。與初始T細(xì)胞相比，抗原刺激的T細(xì)胞通過稱為“功能親和力成熟”的過程顯著提高抗原反應(yīng)性。研究發(fā)現(xiàn)，抗原刺激的T細(xì)胞比初始T細(xì)胞表現(xiàn)出更大的增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生。

T細(xì)胞通過TCR-CD3簇識(shí)別抗原-MHC復(fù)合物。在MHC和TCR相互作用后，幾類蛋白質(zhì)被激活的受體募集到質(zhì)膜以參與信號(hào)傳播（圖2）。

磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)將膜磷脂分子二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)切割成肌醇三磷酸(IP3)和甘油二酯(DAG)。IP3與其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受體的相互作用上調(diào)細(xì)胞質(zhì)中Ca2+的水平，激活Ca2+結(jié)合蛋白鈣調(diào)素。這隨后調(diào)節(jié)活化T細(xì)胞(NFAT)蛋白的核因子。

此外，DAG激活Ras/細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(Erk)通路，調(diào)節(jié)核因子Fos。通過所有這些相互作用的信號(hào)通路，T細(xì)胞被激活，釋放多種細(xì)胞因子和趨化因子，包括IFN-γ、顆粒酶B和IL-2。

圖2. TCR信號(hào)的示意圖演示。

T細(xì)胞通過TCR-CD3簇識(shí)別pMHC復(fù)合物。然后，幾類蛋白質(zhì)被激活的受體募集到質(zhì)膜并參與信號(hào)傳播。磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)將膜磷脂分子二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)裂解為三磷酸肌醇(IP3)和二?；视?DAG).IP3與其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受體的相互作用上調(diào)細(xì)胞質(zhì)中Ca2+的水平，進(jìn)一步激活Ca2+結(jié)合蛋白鈣調(diào)素。

NFAT作為活化T細(xì)胞的核因子，受鈣途徑調(diào)節(jié)。DAG主要參與Ras/Erk通路的激活。T細(xì)胞通過這些信號(hào)通路被激活，釋放IFN-γ、顆粒酶B、IL-2等。

T淋巴細(xì)胞的功能在很大程度上受TCR信號(hào)的調(diào)節(jié)。研究表明，通過p38的初始TCR信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致維生素D受體(VDR)和PLC-γ1的連續(xù)誘導(dǎo)，這兩者都是經(jīng)典TCR信號(hào)傳導(dǎo)和T細(xì)胞激活所必需的?；蜃钄郥CR內(nèi)化會(huì)抑制T細(xì)胞增殖，表明TCR信號(hào)是T細(xì)胞增殖所必需的。

TCR內(nèi)化也需要關(guān)鍵代謝途徑的持續(xù)信號(hào)傳導(dǎo)和激活，包括雷帕霉素(mTOR)的機(jī)制靶標(biāo)。為了控制T細(xì)胞活化，T細(xì)胞無反應(yīng)性是一種耐受機(jī)制，其中淋巴細(xì)胞在遇到抗原后本質(zhì)上功能失活。這種現(xiàn)象經(jīng)常在腫瘤微環(huán)境中觀察到。

研究者發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用抗原誘導(dǎo)和腫瘤誘導(dǎo)的無反應(yīng)性模型時(shí)，早期生長(zhǎng)反應(yīng)蛋白2(Egr2)是體內(nèi)無反應(yīng)性誘導(dǎo)所必需的。因此，Egr2被認(rèn)為是T細(xì)胞無反應(yīng)性的非必需轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。

T細(xì)胞的激活狀態(tài)和免疫反應(yīng)水平進(jìn)一步受各種共刺激（CD28、誘導(dǎo)性T細(xì)胞共刺激(ICOS)和OX40）和共抑制（細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4 (CTLA-4)、程序性死亡1(PD-1)）分子。例如，在缺乏免疫檢查點(diǎn)蛋白PD-1的情況下，融合抗體B7H1-Ig可以增強(qiáng)T細(xì)胞增殖和免疫反應(yīng)。這表明可能基于B7H1介導(dǎo)的通路干預(yù)和增強(qiáng)或下調(diào)免疫反應(yīng)。

TCR工程T淋巴細(xì)胞的應(yīng)用

大量科學(xué)研究表明，TCR改造的T細(xì)胞可以靶向并殺死表達(dá)適當(dāng)抗原的癌細(xì)胞。然而，為了使治療可行，必須首先在體外富集TCR基因修飾的抗原特異性T細(xì)胞。

使用這些工程細(xì)胞進(jìn)行過繼細(xì)胞療法將是一種精確的療法，因?yàn)樗槍?duì)患者體內(nèi)癌細(xì)胞上表達(dá)的抗原。我們接下來將研究這種療法在癌癥治療中的應(yīng)用。

選擇合適的抗原

癌細(xì)胞在發(fā)育過程中可以表達(dá)與未轉(zhuǎn)化細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)不同的蛋白質(zhì)。由類似腫瘤更頻繁表達(dá)的某些抗原是利用免疫識(shí)別進(jìn)行治療的有吸引力的候選者。這些抗原可以是獨(dú)特的或共有的。共有抗原分為腫瘤分化抗原、過表達(dá)抗原和共有腫瘤特異性抗原

許多共同的腫瘤特異性抗原，由癌癥種系基因編碼，已被鑒定出來。這些抗原可以誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，是用于疫苗接種或T細(xì)胞治療的有希望的候選靶標(biāo)，例如黑色素瘤相關(guān)抗原(MAGE)-A3、MAGE-A4和食管鱗狀細(xì)胞癌(NY-ESO)-1。許多研究還報(bào)道，腫瘤分化抗原和過度表達(dá)的抗原可以引起T細(xì)胞反應(yīng)，包括MART-1、gp100、癌胚抗原(CEA)和p53。

除了共享抗原外，獨(dú)特的抗原也有可能用作靶向治療。獨(dú)特抗原是僅由腫瘤細(xì)胞表達(dá)的異常蛋白質(zhì)。在某些癌癥中發(fā)現(xiàn)的病毒相關(guān)抗原可用于產(chǎn)生抗原特異性T細(xì)胞，例如人乳頭瘤病毒(HPV)。

在過去的3年中，新抗原作為一種潛在的精準(zhǔn)免疫療法備受關(guān)注。新抗原是由正常組織中不存在的腫瘤組織中的體細(xì)胞點(diǎn)突變產(chǎn)生的。全基因組或外顯子組測(cè)序可用于確定個(gè)性化癌癥治療的最佳新抗原候選者?？梢赃M(jìn)行RNA測(cè)序來檢查表達(dá)并預(yù)測(cè)新表位是否會(huì)被MHC呈遞以被T細(xì)胞識(shí)別。

2016年，一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)突變反應(yīng)性T細(xì)胞可以從供體來源的T細(xì)胞中富集，并用作治療轉(zhuǎn)移性癌癥患者的有效療法。CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞已被證明可以靶向由腫瘤細(xì)胞的表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后改變產(chǎn)生的表位。最近，技術(shù)突破表明，許多內(nèi)源性突變癌癥蛋白是腫瘤細(xì)胞所獨(dú)有的。

這些可以被加工成肽并呈現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞的表面上，導(dǎo)致這些細(xì)胞在體內(nèi)被免疫系統(tǒng)識(shí)別為“非自身”或外來物。靶向高度特異性的新抗原將使免疫細(xì)胞能夠?qū)┘?xì)胞與正常細(xì)胞區(qū)分開來，并避免自身免疫的風(fēng)險(xiǎn)。因此，新抗原是成功免疫治療的理想靶點(diǎn)。

最近令人興奮的結(jié)果表明，與其他類型相比，可以以更高的頻率檢測(cè)到對(duì)患者新抗原有反應(yīng)的TIL。

多項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)，針對(duì)CTLA-4的單克隆抗體在治療體細(xì)胞突變負(fù)擔(dān)高的癌癥方面特別有效。在接受pembrolizumab（一種靶向PD-1的抗體）治療的肺癌和膀胱癌患者中，非同義突變負(fù)擔(dān)與臨床療效密切相關(guān)。

可能需要分離和再輸注新抗原特異性T細(xì)胞來介導(dǎo)腫瘤消退，而不會(huì)引起靶內(nèi)但非腫瘤毒性。目前獲得大量新抗原特異性T細(xì)胞的最佳技術(shù)是在體外將靶向已識(shí)別新抗原的TCR序列插入到T細(xì)胞中。

例如，識(shí)別突變腫瘤特異性新抗原ERBB2蛋白的轉(zhuǎn)基因CD4+淋巴細(xì)胞在膽管癌患者中誘導(dǎo)持續(xù)的腫瘤消退。

這些發(fā)現(xiàn)表明，基于TCR工程T細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移開發(fā)治療方法可能是可行的，這些T細(xì)胞與帶有識(shí)別自體外周T細(xì)胞的突變表位的四聚體一起分類。進(jìn)一步有趣的結(jié)果顯示，來自PBMC和TIL的CD8+PD-1+細(xì)胞群具有靶向患者特異性新抗原的淋巴細(xì)胞。

然而，另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，缺乏確定的新抗原會(huì)導(dǎo)致可移植腫瘤模型中的腫瘤細(xì)胞耐藥。人類腫瘤中的新抗原庫(kù)是否穩(wěn)定，因此具有始終如一的靶向性是目前不清楚的。

Verdegaal等人設(shè)計(jì)了一項(xiàng)研究來觀察新抗原動(dòng)力學(xué)的景觀，并揭示任何可檢測(cè)的穩(wěn)定性。他們的數(shù)據(jù)表明，特定的T細(xì)胞識(shí)別的新抗原可能會(huì)因轉(zhuǎn)錄表達(dá)減少或突變等位基因。

因此，使用新抗原特異性T細(xì)胞進(jìn)行免疫治療的目的應(yīng)該是利用免疫系統(tǒng)的適應(yīng)能力?；谶@些有希望的結(jié)果，在不久的將來，新抗原特異性T細(xì)胞有可能被用作開發(fā)個(gè)性化治療癌癥的新策略。

用于TCR工程化T細(xì)胞治療的候選靶抗原如果要被利用，需要三個(gè)特征：

（1）它們必須在腫瘤中而不是在正常組織中選擇性表達(dá)（腫瘤特異性）；

（2）它們與腫瘤發(fā)生（腫瘤成癮）有關(guān)；

(3)它們能夠引起T細(xì)胞反應(yīng)（免疫原性）。

從廣義上講，選擇合適的抗原是確定TCR工程化T細(xì)胞有效性的第一步，也是最重要的一步。

TCR序列的鑒定

鑒定TCR序列本身就很困難，因?yàn)槊總€(gè)T細(xì)胞都包含自己獨(dú)特的TCR，可以識(shí)別一組不同的pMHC分子。已經(jīng)開發(fā)了幾種方法來從單個(gè)T細(xì)胞中識(shí)別TCR序列（圖3）。T細(xì)胞克隆的培養(yǎng)是鑒定TCR序列的典型方法。簡(jiǎn)而言之，CD8+或CD4+T細(xì)胞是從外周血單核細(xì)胞(PBMC)中純化出來的。

連續(xù)稀釋允許將單個(gè)T細(xì)胞接種到96孔板的單個(gè)孔。最后，這些單個(gè)細(xì)胞被繁殖，產(chǎn)生T細(xì)胞克隆。來自這些T細(xì)胞克隆的TCRα鏈和β鏈被鑒定和測(cè)序。

使用這種方法，已經(jīng)鑒定了幾種抗原特異性T細(xì)胞，它們可以有效識(shí)別相關(guān)抗原，包括腫瘤抗原。這些腫瘤特異性TCR治療癌癥的功效已在臨床試驗(yàn)中使用工程化TCR進(jìn)行了測(cè)試。

NY-ESO-1特異性TCR-T細(xì)胞得到了最徹底的檢查，它們的治療潛力已在滑膜細(xì)胞肉瘤、黑色素瘤和骨髓瘤中進(jìn)行了測(cè)試。

圖3. 獲得TCR序列的三個(gè)典型程序。

分離抗原反應(yīng)性T細(xì)胞，通過單克隆衍生的cDNA測(cè)序（I）、單細(xì)胞測(cè)序（II）或批量DNA的配對(duì)測(cè)序（III）鑒定特異性TCR基因。

最近，已開發(fā)出單細(xì)胞RT-PCR和pairSEQ方法來更快速地識(shí)別TCR序列。單細(xì)胞RT-PCR允許同時(shí)處理數(shù)千個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組。

該方法可以識(shí)別每個(gè)T細(xì)胞的獨(dú)特TCR和配對(duì)的α和β異二聚體，并已成功用于從小鼠91個(gè)幼稚CD4+T輔助細(xì)胞中識(shí)別配對(duì)的α和β鏈。PairSEQ技術(shù)可以利用TCR序列的多樣性，在單次高通量實(shí)驗(yàn)中準(zhǔn)確識(shí)別多個(gè)TCRα和β鏈序列。

Howie等人使用該技術(shù)將數(shù)十萬(wàn)個(gè)TCRα和β鏈序列配對(duì)，這些序列來自從兩名健康供體中分離出的PBMC，以及來自9對(duì)匹配腫瘤和血液樣本中TIL的數(shù)千個(gè)序列。

Pasetto等人應(yīng)用PairSEQ技術(shù)識(shí)別源自12個(gè)新鮮轉(zhuǎn)移性黑色素瘤TIL的T細(xì)胞的TCR序列。這項(xiàng)研究成功鑒定了幾種對(duì)腫瘤抗原表現(xiàn)出反應(yīng)性的序列。

總之，PairSEQ是一項(xiàng)令人興奮的高通量技術(shù)，可用于識(shí)別TIL的TCR序列。然后可以使用該信息來設(shè)計(jì)表達(dá)抗原特異性TCR的T細(xì)胞。這些新技術(shù)具有促進(jìn)TCR工程T細(xì)胞療法發(fā)展的巨大潛力。

臨床前研究

在確定靶向腫瘤抗原的TCR并將其引入T細(xì)胞后，有必要進(jìn)行功能評(píng)估以分析T細(xì)胞對(duì)同源肽或自體腫瘤細(xì)胞反應(yīng)的敏感性。靶向共享組織分化抗原，如MART-1、gp100和CEA，可能會(huì)以對(duì)關(guān)鍵器官中的正常細(xì)胞毒性為代價(jià)。因此，也有必要評(píng)估TCR工程T細(xì)胞的腫瘤外毒性。

雖然有些抗原沒有廣泛表達(dá)，例如在腫瘤組織、胎兒組織和成人睪丸上表達(dá)但不在其他正常成人組織上表達(dá)的癌癥-睪丸NY-ESO-1和MAGE家族，但這些TCR的安全性和親和力-仍應(yīng)評(píng)估工程化T細(xì)胞。

Parkhurst等人開發(fā)了一種小鼠模型來分離CEA反應(yīng)性進(jìn)行功能評(píng)估。

在這項(xiàng)研究中，他們證明了修飾的CEA反應(yīng)性TCRs是未來基因治療的良好候選者，并且還展示了在TCR的抗原結(jié)合區(qū)域中選擇的氨基酸取代增強(qiáng)TCR反應(yīng)親和力的能力。

Kunert等人從黑色素瘤患者中分離出針對(duì)四個(gè)MAGE-C2表位的10個(gè)TCR序列，并設(shè)計(jì)了一組實(shí)驗(yàn)來評(píng)估TCR轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞功能。在MAGE-A3疫苗接種后，從兩名黑色素瘤患者的PBMC中分離出兩個(gè)MAGE-A3特異性TCR。這些TCR識(shí)別由HLA-DPB1*04:01呈遞的MAGE-A3肽。

比較了這兩種TCR的特異性和親和力，發(fā)現(xiàn)6F9 TCR在HLA-DPB1*04:01的背景下特異性識(shí)別MAGE-A3，但不識(shí)別MAGE-A家族的其他成員。

6F9 TCR被選擇用于潛在的TCR基因治療，靶向MHCII類限制性MAGE-A3。另一個(gè)問題是，在患者體內(nèi)循環(huán)的許多修飾的T細(xì)胞沒有任何治療效果，因?yàn)樗鼈兙哂薪档偷哪孓D(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)基因表達(dá)。

一些研究報(bào)告了改善TCR基因轉(zhuǎn)移和為免疫治療提供穩(wěn)定系統(tǒng)的可能方法。Fujio等人使用兩個(gè)獨(dú)立的單順反子逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以產(chǎn)生卵清蛋白(OVA)特異性TCR-T細(xì)胞。

這些細(xì)胞對(duì)抗原表現(xiàn)出顯著的反應(yīng)。此外，Bobisse等人使用了攜帶雙向啟動(dòng)子的慢病毒載體。該基因遞送系統(tǒng)表現(xiàn)出提高的轉(zhuǎn)移效率，表明慢病毒載體可能是免疫治療中TCR表達(dá)的有效工具。

這些臨床前實(shí)驗(yàn)有助于指導(dǎo)TCR-T細(xì)胞在臨床試驗(yàn)中的應(yīng)用，但必須測(cè)試靶向腫瘤抗原的新TCR的親和力、毒性和安全性。

臨床試驗(yàn)

使用TCR工程化T細(xì)胞的過繼免疫療法已成為癌癥治療的重要策略，最近的臨床試驗(yàn)提供了令人鼓舞的結(jié)果（表1）。

2006年首次報(bào)道了MART-1 TCR修飾的淋巴細(xì)胞可以介導(dǎo)人類腫瘤消退。2009年和2014年MART-1 TCR工程化T細(xì)胞的臨床試驗(yàn)也證明了這種現(xiàn)象。

Johnson等人表明，用gp100 TCR工程化T細(xì)胞治療的19%患者經(jīng)歷了客觀的抗腫瘤反應(yīng)。

除了分化抗原，臨床試驗(yàn)還檢查了癌癥-睪丸抗原，如MAGE-A3和NY-ESO-1。在使用靶向HLA-A*0201限制的NY-ESO-1抗原的TCR的臨床試驗(yàn)中在超過50%的滑膜細(xì)胞肉瘤、黑色素瘤和骨髓瘤患者中觀察到了反應(yīng)。Kageyama等人進(jìn)行了一項(xiàng)臨床試驗(yàn)，檢查具有HLA-A*2402限制性MAGE-A4的TCR修飾的T細(xì)胞在治療食管癌中的作用。

這些TCR修飾的T細(xì)胞可以在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間檢測(cè)到，并且三名患者在超過27個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)最小的腫瘤病變。

這些臨床試驗(yàn)表明，使用TCR工程化的T細(xì)胞療法可以使腫瘤顯著消退。這引起了相當(dāng)大的熱情，盡管必須指出的是，大多數(shù)這些臨床試驗(yàn)僅使用了少數(shù)癌癥患者。

此外，盡管使用TCR工程T細(xì)胞進(jìn)行過繼細(xì)胞療法取得了很大進(jìn)展，但也出現(xiàn)了一些意想不到的毒性。

在一項(xiàng)使用TCR工程化T細(xì)胞靶向轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌和高親和力CEA反應(yīng)性TCR的臨床試驗(yàn)中，由于TCR與表達(dá)CEA的正常結(jié)腸上皮細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)，所有三名患者都發(fā)生了嚴(yán)重的暫時(shí)性炎癥性結(jié)腸炎（盡管一名患者有一個(gè)目標(biāo)轉(zhuǎn)移到肺和肝的癌癥消退）。

在另一項(xiàng)研究中，兩名患者在輸注具有針對(duì)HLA-A*01限制性MAGE-A3的TCR設(shè)計(jì)的T細(xì)胞后死于心源性休克。人工修飾的MAGE-A3 TCR在CDR2區(qū)的α鏈中有4個(gè)替換，并且保留β鏈中的野生型序列以增加TCR親和力。這種親和力增強(qiáng)的TCR可能已識(shí)別出源自正常心臟組織表達(dá)的無關(guān)蛋白的表位，但親本MAGE-A3特異性TCR也可能通過自然胸腺選擇過程在無心臟毒性的患者中擴(kuò)增。

進(jìn)一步的研究還導(dǎo)致兩名患者在接受自體MAGE-A3 TCR工程化T細(xì)胞治療后陷入昏迷并隨后死亡。在這項(xiàng)研究中，修飾的T細(xì)胞還識(shí)別出在人腦中檢測(cè)到的MAGE-A12衍生的表位。

潛在的交叉反應(yīng)性使得必須仔細(xì)評(píng)估TCR的親和力并選擇合適的抗原以安全地臨床應(yīng)用TCR工程T細(xì)胞至關(guān)重要。

表1. TCR工程T細(xì)胞的臨床試驗(yàn)

改進(jìn)TCR工程T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的功能

改進(jìn)TCR工程化T細(xì)胞的功能對(duì)于克服腫瘤微環(huán)境中的抑制因素并引發(fā)腫瘤消退至關(guān)重要。許多提高抗原反應(yīng)性和規(guī)避T細(xì)胞耐受性的努力都集中在增加TCR信號(hào)強(qiáng)度和生成功能強(qiáng)大的T細(xì)胞上。免疫檢查點(diǎn)蛋白，如PD-1和CTLA-4，可以阻止免疫系統(tǒng)中T細(xì)胞的激活。已證明阻斷PD-1通路可以改善TIL的功能并增強(qiáng)抗腫瘤免疫。因此，PD-1/PD-L1信號(hào)通路很可能是抗原反應(yīng)性的主要負(fù)反饋調(diào)節(jié)劑。其他證據(jù)表明PD-1信號(hào)傳導(dǎo)參與調(diào)節(jié)磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、AKT和RAS通路以及細(xì)胞周期控制。

表達(dá)高水平抑制性受體PD-1的TCR工程T細(xì)胞降低了它們的功能活性。當(dāng)與抗PD-1抗體結(jié)合使用時(shí)，NY-ESO-1 TCR工程化T細(xì)胞的功效得到增強(qiáng)。此外，癌細(xì)胞可以通過釋放細(xì)胞外信號(hào)，促進(jìn)腫瘤 血管生成，和誘導(dǎo)外周免疫耐受性來影響局部微環(huán)境。相反，微環(huán)境中的免疫細(xì)胞會(huì)影響癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和進(jìn)化。

幾種重組細(xì)胞因子通常用于治療癌癥，尤其是IL-2。這種細(xì)胞因子刺激抗原特異性T細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和存活，并已被用作不同的癌癥類型的單一療法，包括黑色素瘤。

與上述免疫檢查點(diǎn)蛋白和免疫抑制細(xì)胞因子相比，抗原特異性T細(xì)胞的數(shù)量會(huì)受到腫瘤微環(huán)境中趨化因子的影響。阻斷CXCR3（趨化因子配體CXCL9/10的受體）會(huì)損害STAT3缺陷型CD8+T細(xì)胞在腫瘤部位的積累。另一項(xiàng)研究表明趨化因子CXCL10維持效應(yīng)T細(xì)胞群。CD8α+產(chǎn)生的趨化因子CCL17樹突狀細(xì)胞吸引了表達(dá)趨化因子受體CCR4的幼稚細(xì)胞毒性T細(xì)胞。

使用嵌合抗原受體(CAR)轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞的研究表明，趨化因子可增強(qiáng)T細(xì)胞向腫瘤的運(yùn)輸。CAR-T細(xì)胞在治療白血病和淋巴瘤的臨床試驗(yàn)中取得了巨大成功，盡管在將它們用于實(shí)體瘤時(shí)仍然存在問題，例如腫瘤部位存在的T細(xì)胞數(shù)量較少。然而，在與CCR2b共同修飾后，腫瘤中GD2-CAR轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞的數(shù)量增加。

CCR4的強(qiáng)制表達(dá)也改善了CAR-T淋巴細(xì)胞的遷移。這些細(xì)胞的功能不受CCR4轉(zhuǎn)基因表達(dá)的阻礙?？紤]到帶有趨化因子受體的CAR-T細(xì)胞表現(xiàn)出增強(qiáng)的腫瘤浸潤(rùn)，通過加入趨化因子受體來改善其他轉(zhuǎn)基因TCR-T細(xì)胞系可能會(huì)帶來更好的臨床結(jié)果。

此外，TCR-T細(xì)胞僅識(shí)別MHC分子存在于細(xì)胞表面的細(xì)胞內(nèi)腫瘤抗原，而CAR-T細(xì)胞可以識(shí)別表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面的腫瘤抗原，而不受MHC限制和抗原加工的影響。

最近的一項(xiàng)研究證明了這種方法的好處，它創(chuàng)造了表達(dá)兩種額外受體的CD8+T細(xì)胞；gp100抗原特異性TCR和黑色素瘤相關(guān)硫酸軟骨素蛋白多糖特異性CAR。

這些使用聯(lián)合識(shí)別途徑的T細(xì)胞通過繞過腫瘤細(xì)胞逃避免疫識(shí)別的機(jī)制顯示出更大的功效?？傊琓CR設(shè)計(jì)的靶向趨化因子、細(xì)胞因子和免疫檢查點(diǎn)蛋白的藥物，可能在未來的治療中獲得更好的臨床反應(yīng)。

未來展望

使用TCR工程化T細(xì)胞的過繼細(xì)胞療法取得了相當(dāng)大的進(jìn)展，這是一種高度個(gè)性化的癌癥療法。還有一些問題有待回答：

（1）如何克服腫瘤微環(huán)境中存在的抑制因素；

(2)是否有可能提高體內(nèi)腫瘤部位的TCR工程化T細(xì)胞的壽命；

(3)能否識(shí)別出有效的TCR工程T細(xì)胞混合物，包括針對(duì)不同抗原表位的不同類型的抗原特異性T細(xì)胞。

盡管一些抗體或重組細(xì)胞因子可以與TCR工程化的T細(xì)胞一起使用，但其他目前尚未確定的因素仍然存在于腫瘤微環(huán)境中，這些因素也可能影響結(jié)果。另一個(gè)問題是，一旦被激活，幼稚T細(xì)胞會(huì)在TCR-pMHC相互作用后迅速增殖并分化為效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞。

雖然這些分化的效應(yīng)T細(xì)胞可以產(chǎn)生多種效應(yīng)分子，但這些細(xì)胞表現(xiàn)出耗竭標(biāo)志物的高表達(dá)和細(xì)胞死亡的快速進(jìn)展。

為了解決T細(xì)胞耗竭的問題并延長(zhǎng)有效的免疫反應(yīng)，一些選擇可能是可行的。

其中一種方法是改變代謝途徑以增強(qiáng)工程化T細(xì)胞的持久性。已經(jīng)表明mTOR信號(hào)、AMPK-α1信號(hào)和IL-7信號(hào)支持記憶CD8+T細(xì)胞的發(fā)育。

基于這些觀察結(jié)果，可能有必要產(chǎn)生長(zhǎng)壽命記憶樣TCR工程化T細(xì)胞表達(dá)代謝相關(guān)分子。

Verdegaal等人，觀察了兩名IV期黑色素瘤患者的新抗原的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞識(shí)別的新抗原在腫瘤部位的表達(dá)減少甚至丟失。

這表明，如果輸注多種T細(xì)胞系和識(shí)別不同新抗原的工程TCR，患者的臨床反應(yīng)會(huì)有所改善。

例如，最近的一項(xiàng)研究表明，用來自TIL的十種最豐富的CD8+PD-1+克隆型的TCR工程化的T細(xì)胞對(duì)癌癥種系抗原和新抗原具有反應(yīng)性。

未來，通過培養(yǎng)從患者身上分離出來的CD8+PD-1+T細(xì)胞，可以獲得不同類型的TCR，這可能是開發(fā)個(gè)性化癌癥治療的新策略。

共表達(dá)TCR和CAR的T細(xì)胞也為設(shè)計(jì)用于過繼轉(zhuǎn)移的多功能腫瘤特異性T細(xì)胞開辟了一條新途徑。為了滿足這些療法的潛力，需要開發(fā)新的和準(zhǔn)確的方法。

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