飲食限制對(duì)遺傳多樣性小鼠的健康和壽命的影響

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熱量限制在多個(gè)物種中延長(zhǎng)了健康壽命。間歇性禁食作為飲食限制的另一種形式，對(duì)人類來說可能更具可持續(xù)性，但其有效性仍然在很大程度上未被探索。確定最有效的飲食限制形式對(duì)于開發(fā)改善人類健康和長(zhǎng)壽的干預(yù)措施至關(guān)重要。在這里，我們對(duì)960只遺傳多樣性雌性小鼠進(jìn)行了廣泛的評(píng)估，包括不同程度的熱量限制（20%和40%）和間歇性禁食（每周1天和2天禁食）對(duì)其健康和存活的影響。我們展示了熱量限制和間歇性禁食都按限制的程度延長(zhǎng)了壽命。壽命是可遺傳的，基因?qū)勖挠绊懘笥陲嬍诚拗?。與壽命最強(qiáng)烈的特征關(guān)聯(lián)包括在處理期間保持體重——這是應(yīng)激韌性的指標(biāo)、高淋巴細(xì)胞比例、低紅細(xì)胞分布寬度以及晚年的高脂肪含量。不同干預(yù)措施的健康效應(yīng)各不相同，并且與壽命延長(zhǎng)的關(guān)系不一致。40%的熱量限制具有最強(qiáng)的壽命延長(zhǎng)效果，但導(dǎo)致了瘦肉質(zhì)量的損失和免疫庫的變化，這可能會(huì)使易感性增加感染。間歇性禁食沒有延長(zhǎng)干預(yù)前體重高的小鼠的壽命，兩天的間歇性禁食與紅系細(xì)胞群的破壞有關(guān)。對(duì)飲食限制的代謝反應(yīng)，包括減少脂肪含量和降低空腹血糖，與增加壽命無關(guān)，這表明飲食限制不僅僅是抵消肥胖的負(fù)面影響。我們的發(fā)現(xiàn)表明，改善健康和延長(zhǎng)壽命并不是同義詞，并對(duì)在臨床前模型和臨床試驗(yàn)中評(píng)估衰老干預(yù)措施的最相關(guān)終點(diǎn)提出了問題。

主要

熱量限制（CR）推遲了與年齡相關(guān)的疾病的發(fā)生并延長(zhǎng)了多個(gè)物種的壽命。在人類中，遵循CR具有挑戰(zhàn)性，興趣已經(jīng)轉(zhuǎn)向更寬松的飲食限制（DR）形式，如限時(shí)喂養(yǎng)和間歇性禁食（IF），這些已被證明在促進(jìn)機(jī)體健康方面有效。在小鼠中，定期禁食可以帶來相當(dāng)大的好處，而無需減少總能量攝入。進(jìn)行CR的小鼠也經(jīng)歷了長(zhǎng)時(shí)間的每日禁食，通過在一天中的特定時(shí)間喂食可以優(yōu)化CR的健康益處，這表明熱量攝入和喂食時(shí)間都對(duì)生理反應(yīng)和壽命延長(zhǎng)有貢獻(xiàn)。盡管這些觀察很重要，但關(guān)于CR和IF在健康老齡化和長(zhǎng)壽方面的不同之處的信息有限。

對(duì)DR的反應(yīng)因個(gè)體而異，這種變異性的機(jī)制在很大程度上仍不清楚。在小鼠和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中的研究表明，DR的效果受到個(gè)體特征的影響，包括性別、體型和組成以及遺傳學(xué)。測(cè)試DR對(duì)健康的效應(yīng)的人類臨床研究主要集中在體重、脂肪含量、能量代謝和心血管風(fēng)險(xiǎn)因素的變化上。由于人類研究的樣本量小且持續(xù)時(shí)間短，對(duì)DR的長(zhǎng)期效應(yīng)的探索較少。此外，DR的安全性和有效性可能取決于年齡和健康狀況等因素。關(guān)于預(yù)測(cè)個(gè)人如何響應(yīng)DR的生理標(biāo)記的知識(shí)缺乏。識(shí)別這樣的預(yù)測(cè)因子可以幫助定制DR以滿足個(gè)人需求，作為縱向評(píng)估干預(yù)成功的工具，并闡明介導(dǎo)DR對(duì)壽命影響的生物過程。

在這項(xiàng)關(guān)于飲食限制的研究中，我們調(diào)查了熱量限制（CR）和間歇性禁食（IF）對(duì)雌性多樣性雜交（DO）小鼠的健康和壽命的影響。除了測(cè)量壽命外，我們還進(jìn)行了數(shù)百次縱向評(píng)估以評(píng)估DR的健康效應(yīng)。最近使用UM-HET3小鼠（另一個(gè)遺傳多樣性小鼠群體）的研究揭示了與規(guī)范老化相關(guān)的遺傳變異。我們使用DO小鼠是因?yàn)樵谶z傳多樣性小鼠中的發(fā)現(xiàn)更有可能跨物種推廣，并且因?yàn)镈O小鼠呈現(xiàn)出廣泛的生理特征，包括體成分和其他代謝特征的變異，這些可以作為預(yù)測(cè)個(gè)人對(duì)DR反應(yīng)的預(yù)測(cè)標(biāo)記。我們的研究目標(biāo)是（1）描述DR的壽命和健康效應(yīng)；（2）識(shí)別預(yù)測(cè)個(gè)人對(duì)DR反應(yīng)的生理和遺傳因素。

DR延長(zhǎng)了雌性DO小鼠的壽命

我們檢查了分級(jí)水平的影響CR和IF960雌性做老鼠隨機(jī)分配到五種飲食：隨意喂養(yǎng)（AL），每周禁食一天（1D組）或連續(xù)兩天（2D組），和CR在20%或40%的基線隨意的食物攝入量（圖1）。在6個(gè)月大時(shí)，我們對(duì)937只存活的小鼠進(jìn)行了DR治療，并在它們的自然壽命中維持DR治療。

圖1： DR延長(zhǎng)了DO小鼠的壽命。

a, 研究設(shè)計(jì)：960只雌性DO小鼠被隨機(jī)分配到五個(gè)飲食干預(yù)組之一：自由進(jìn)食（AL）；每周禁食一天（1D）或兩天（2D）；或者分別按估計(jì)成年食量的20%（20%）或40%（40%）進(jìn)行熱量限制（CR）。

b, 按飲食組別的Kaplan–Meier生存曲線。虛線表示中位壽命。審查事件用“X”表示。

c, 按飲食組別的Kaplan–Meier估計(jì)的中位（50%死亡率）和最大（90%死亡率）壽命，顯示相對(duì)于AL的百分比變化以及95%置信區(qū)間（使用R/survfit計(jì)算）。n=937只小鼠。

d, 從Gompertz對(duì)數(shù)線性危險(xiǎn)模型估算的死亡翻倍時(shí)間，顯示相對(duì)于AL的百分比變化以及95%置信區(qū)間（使用R/flexsurvreg計(jì)算）。n=937只小鼠。

e, 飲食組別內(nèi)的個(gè)體小鼠壽命（點(diǎn)）。n=188（AL），n=188（1D），n=190（2D），n=189（20%）和n=182（40%）。箱線圖顯示了中位壽命（中心線）、四分位數(shù)（盒邊界）和范圍（觸須）。

我們還使用了額外的160只DO小鼠來評(píng)估每日和累計(jì)食物攝入量（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1a-c）。IF小鼠在周三下午3點(diǎn)移除食物，并在24小時(shí)后（1D組）或48小時(shí)后（2D組）補(bǔ)充食物（圖1a）。這些小鼠在禁食期后表現(xiàn)出補(bǔ)償性進(jìn)食，使得1D小鼠總共攝入的食物量與AL小鼠相似，而2D小鼠比AL小鼠少攝入12%的食物（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1b、c）。在禁食期間，1D和2D IF小鼠分別平均減重2.5克和4.0克，隨后恢復(fù)體重（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1d）。CR小鼠每天下午3點(diǎn)被喂食固定量的食物。周五下午，CR小鼠收到通常在周六下午3點(diǎn)或周日下午3點(diǎn)之前消耗的三倍食物量，導(dǎo)致類似IF小鼠經(jīng)歷的每周禁食期（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1a）。盡管經(jīng)歷了禁食期，CR小鼠周末體重平均變化不到1克。

在大約5個(gè)月、16個(gè)月和26個(gè)月大時(shí)，主要研究隊(duì)列中的小鼠在代謝籠中被監(jiān)測(cè)，以觀察DR如何影響每日食物消耗波動(dòng)、呼吸商（一種代謝底物使用的衡量指標(biāo)）、能量消耗和跑輪活動(dòng)（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2a-d）。所有組別的小鼠都在熄燈前不久開始每日進(jìn)食（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2a），但CR小鼠在幾小時(shí)內(nèi)就消耗了可用的食物，導(dǎo)致長(zhǎng)時(shí)間的每日禁食。呼吸商的每日和每周波動(dòng)反映了進(jìn)食和禁食狀態(tài)，這在40% CR組中最為明顯（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2e）。調(diào)整后的能量消耗最低的是40% CR組，其次是20% CR和2D IF組（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2f）。除了40% CR小鼠外，跑輪活動(dòng)隨著年齡增長(zhǎng)而減少，這些小鼠顯示出最高的累積跑輪活動(dòng)（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2g），包括與覓食行為一致的中午跑輪活動(dòng)（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2d）。

DR延長(zhǎng)了雌性DO小鼠的壽命（log-rank P < 2.2 × 10^-16），反應(yīng)與限制程度或禁食長(zhǎng)度成正比（40% > 20% > 2D > 1D > AL；圖1b及補(bǔ)充表1）。DR影響了中位和最大壽命（Kaplan–Meier估計(jì)的50%和90%死亡率，分別見圖1c及補(bǔ)充表2）。40% CR小鼠的中位壽命比AL組小鼠長(zhǎng)約9個(gè)月（36.3%）。值得注意的是，IF小鼠在最小或沒有凈熱量攝入減少的情況下也延長(zhǎng)了中位壽命。我們通過擬合Gompertz生命模型估算了死亡率翻倍時(shí)間（圖1d及補(bǔ)充表3），并觀察到CR小鼠相比AL小鼠的年齡相關(guān)衰退速率顯著降低（總體飲食效應(yīng)對(duì)Gompertz模型斜率的影響，P = 7.78 × 10^-4）。

盡管DR有深遠(yuǎn)影響，但壽命在各飲食組內(nèi)高度可變（圖1e）。這促使我們檢查是否有任何生理特征可以解釋壽命的變異性。我們?cè)?2個(gè)實(shí)驗(yàn)組中評(píng)估了200多個(gè)特征，每個(gè)特征在不同時(shí)間重復(fù)測(cè)量，每只小鼠最多得到724個(gè)測(cè)量值。我們每周獲取體重；每六個(gè)月評(píng)估虛弱指數(shù)、握力和體溫；每年進(jìn)行評(píng)估，包括代謝籠分析、體成分、心臟超聲、跑輪、轉(zhuǎn)棒、聽覺驚嚇、膀胱功能、空腹血糖、免疫細(xì)胞分析和全血分析（參見方法部分的“表型分析”；補(bǔ)充表4和5）。我們進(jìn)行了縱向分析，以評(píng)估哪些特征受體重、年齡和飲食的影響（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3b及補(bǔ)充表6）。我們進(jìn)行線性回歸分析，以確定哪些特征在控制飲食和體重后與壽命相關(guān)（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3c-e及補(bǔ)充表7）。在以下部分，我們將探討飲食對(duì)體重和成分的影響；然后研究DR對(duì)健康指標(biāo)的影響，包括代謝、免疫和血液學(xué)特征；最后，我們考察遺傳對(duì)健康和壽命的影響。

DR對(duì)體重和成分的影響

DR顯著改變了終生體重軌跡（圖2a及擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4a）。在DR上的體重減輕大致與CR的程度成比例，但I(xiàn)F對(duì)體重也有額外影響，例如，1D小鼠盡管攝入的熱量與AL小鼠相似，但體重較輕（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1c）。40% CR小鼠在DR開始時(shí)迅速減重，并在18個(gè)月大時(shí)平均減重24.3%。相比之下，AL小鼠在同一時(shí)期平均增重28.4%。40% CR小鼠的體重減輕持續(xù)一生，表明這些動(dòng)物大多未能達(dá)到能量平衡。將實(shí)際年齡重新標(biāo)定為壽命比例（PLL = 測(cè)試時(shí)年齡/壽命）使我們能夠更好地比較臨終前的特征，而不會(huì)受到不同存活率的扭曲（圖2b）。除了40% CR組外，所有小鼠的平均體重增加持續(xù)到中年，穩(wěn)定在0.50至0.75 PLL之間，并在接近生命終點(diǎn)時(shí)迅速下降（超過0.90 PLL）。臨終前的體重減輕可能反映癌癥或其他終末期疾病的存在，但我們無法確定大多數(shù)小鼠的死因。

圖2 DR顯著改變了終生體重軌跡。

 a，按飲食組別劃分的體重（克）終身軌跡。數(shù)據(jù)是每月平均值±1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)誤。n=937。b，按PLL進(jìn)行l(wèi)oess擬合的體重（克）軌跡，帶有95%置信帶。c，經(jīng)飲食調(diào)整后與壽命相關(guān)的體重、三個(gè)月間隔體重變化（delta BW）、瘦組織質(zhì)量（LTM）和脂肪組織質(zhì)量（FTM）。星號(hào)表示通過線性回歸分析壽命特征后的多重檢驗(yàn)調(diào)整顯著性，*p < 0.01, **p < 0.001, ***p < 0.0001。d，2到6個(gè)月和18個(gè)月時(shí)每克體重的預(yù)期壽命差異按飲食分組。數(shù)據(jù)是平均值±2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)誤。n=937（2到6個(gè)月）和n=802（18個(gè)月）。e，按飲食組別（顏色）對(duì)低于和高于中位數(shù)6個(gè)月體重的小鼠進(jìn)行的Kaplan–Meier生存曲線。虛線表示中位生存時(shí)間。顯著性是通過在體重分層內(nèi)跨飲食比較的log-rank檢驗(yàn)計(jì)算得出。n=469（輕）和n=468（重）。f，按表型期間（10至11個(gè)月；PhenoDelta）體重變化的生存期，顯示回歸線、95%置信帶和特定飲食的相關(guān)性（p<2.2×10^-16; 飲食×特征: P=0.00172, r=0.287）。g，按年齡（平均數(shù)±2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)誤；n=895（10個(gè)月），n=689（22個(gè)月），n=241（34個(gè)月）小鼠）和PLL進(jìn)行l(wèi)oess平滑處理及95%置信帶的瘦組織質(zhì)量（克）（PLL: P<2.2×10^-16; 飲食: P<2.2×10^-16; 飲食×PLL: P=1.07×10^-7）。h，按年齡（平均數(shù)±2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)誤；n值如g所示）和PLL進(jìn)行l(wèi)oess平滑處理及95%置信帶的脂肪組織質(zhì)量（克）（PLL: P<2.2×10^-16, 飲食: P<2.2×10^-16, 飲食×PLL: P=0.168）。對(duì)于g和h，統(tǒng)計(jì)測(cè)試的詳細(xì)信息見“縱向特征分析”部分的方法。

早期較高的體重與小鼠和其他物種的縮短壽命相關(guān)32,33,34。與這些發(fā)現(xiàn)一致，我們觀察到壽命與干預(yù)前體重之間的負(fù)相關(guān)（圖2c（頂行）和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4b）。然而，這種負(fù)相關(guān)隨著年齡的增長(zhǎng)而減弱，并在兩年后變?yōu)檎嚓P(guān)（圖2c（頂行）和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4c）。對(duì)于2D IF小鼠，2個(gè)月齡時(shí)體重差1克對(duì)應(yīng)于預(yù)期壽命減少0.66個(gè)月（20天），但這種關(guān)聯(lián)隨年齡增長(zhǎng)而減弱（圖2d）。所有飲食組中都存在體重與壽命關(guān)聯(lián)隨年齡逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象。接下來，我們檢查了早期體重是否也可能改變對(duì)DR的反應(yīng)。按中位數(shù)6個(gè)月體重分層的Kaplan–Meier分析顯示，CR在較輕和較重的小鼠中延長(zhǎng)壽命的程度相同（圖2e，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4d和補(bǔ)充表8）。相比之下，IF小鼠在高干預(yù)前體重的情況下沒有顯示出壽命延長(zhǎng)的證據(jù)。

此外，我們?cè)u(píng)估了個(gè)體壽命延長(zhǎng)是否可以由DR后期體重變化來解釋。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)，在飲食組內(nèi)，保留更多體重的小鼠壽命更長(zhǎng)（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4e）。與傳統(tǒng)觀點(diǎn)相反，該觀點(diǎn)認(rèn)為DR的有益效果是由于減少了肥胖水平36，在任何年齡體重減輕都與壽命減少相關(guān)（圖2c（第二行））。這些結(jié)果反駁了DR僅通過對(duì)抗肥胖的負(fù)面影響而起作用的觀點(diǎn)。

在10、22和34個(gè)月齡的為期一個(gè)月的表型測(cè)定期間，由于處理導(dǎo)致的壓力，小鼠經(jīng)歷了短期體重減輕，隨后在之后的幾周恢復(fù)。從10到11個(gè)月齡的表型測(cè)定期間體重變化（PhenoDelta）顯示出與本研究中檢查的所有特征中最強(qiáng)的壽命關(guān)聯(lián)（圖2f和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3d）。對(duì)體重減輕最有抵抗力的小鼠壽命更長(zhǎng)。在22個(gè)月齡的表型測(cè)定期間體重減輕也與壽命減少相關(guān)（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4f）。

我們?cè)?0、22和34個(gè)月齡分析了體成分以獲取脂肪組織質(zhì)量（FTM）和瘦組織質(zhì)量（LTM），并計(jì)算了總組織質(zhì)量（TTM = FTM + LTM）和脂肪百分比（脂肪百分比 = FTM/TTM）。基因多樣性的小鼠在所有飲食組和年齡段表現(xiàn)出廣泛的體重和成分變化，脂肪百分比從不到10%到超過60%不等（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5a）。對(duì)于AL和IF小鼠，LTM在整個(gè)生命中增加（圖2h）。對(duì)于CR小鼠，LTM與AL小鼠相比在干預(yù)后4個(gè)月期間大幅減少，并保持恒定（20% CR）或隨年齡下降（40% CR）。所有組別的小鼠隨著年齡的增長(zhǎng)都失去了脂肪質(zhì)量，特別是在生命的后半段（圖2i）。雖然40% CR小鼠的平均脂肪百分比最低，但20% CR小鼠的脂肪百分比與AL小鼠相當(dāng)，脂肪百分比最高的個(gè)體小鼠出現(xiàn)在20% CR組（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5a）。

先前的研究表明，在慢性CR下保持脂肪可能會(huì)增加存活率11,16,37。我們檢查了10和22個(gè)月齡時(shí)壽命與脂肪百分比的關(guān)聯(lián)（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5b,c）。較高的脂肪百分比通常與較長(zhǎng)的壽命相關(guān)。這種關(guān)聯(lián)在經(jīng)受2D IF或CR的老年小鼠中更強(qiáng)。在我們測(cè)試的所有與壽命相關(guān)的特征中，只有10個(gè)月齡的TTM和LTM顯示出顯著的飲食特異性與壽命的關(guān)聯(lián)（飲食×特征: p < 0.01），而10個(gè)月齡的FTM接近顯著（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5d,e）。具體來說，較高的LTM與IF小鼠的較短壽命相關(guān)，但與40% CR小鼠的較長(zhǎng)壽命相關(guān)?？偟膩碚f，這些結(jié)果突出了一個(gè)悖論：DR在減少體重和脂肪質(zhì)量的同時(shí)延長(zhǎng)了壽命，但保持體重和脂肪質(zhì)量卻與較長(zhǎng)的壽命相關(guān)。這個(gè)悖論是本研究反復(fù)出現(xiàn)的主題。

DR對(duì)健康和代謝的影響

我們的表型管道中的大多數(shù)健康相關(guān)特征隨年齡變化并對(duì)DR有反應(yīng)（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3b），但令人驚訝的是，這些特征中很少有顯示出與壽命的關(guān)聯(lián)（圖3a,b和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3c）。一個(gè)例外是28個(gè)月的虛弱指數(shù)（FI; 圖3c,d），這是一種衡量與年齡相關(guān)的健康缺陷的病態(tài)指標(biāo)。一些最明顯受年齡影響的虛弱成分包括駝背和步態(tài)障礙的增加（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6a,b）。有益的飲食特異性反應(yīng)包括可觸摸腫瘤和腹部膨脹的發(fā)生率降低。我們還觀察到，低早期體重的小鼠這兩種特征都有所減少（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6c,d），這可能有助于這些小鼠的較長(zhǎng)壽命。

圖3 DR對(duì)健康和代謝的影響。

a,b，針對(duì)選定的健康（a）和代謝（b）特征，在年度測(cè)試間隔內(nèi)對(duì)飲食和體重進(jìn)行調(diào)整后與壽命的相關(guān)性熱圖。年齡（1年、2年和3年分別表示為Y1、Y2和Y3）根據(jù)檢測(cè)方法而變化（補(bǔ)充表4）。星號(hào)表示通過線性回歸分析壽命特征后的多重檢驗(yàn)調(diào)整顯著性，*p < 0.01。c，按年齡（平均數(shù)±2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)誤；n=770（5個(gè)月），n=909（10個(gè)月），n=834（16個(gè)月），n=704（22個(gè)月），n=489（28個(gè)月），n=260（34個(gè)月）小鼠）和PLL進(jìn)行l(wèi)oess平滑處理及95%置信帶的FI評(píng)分（經(jīng)技術(shù)和毛色調(diào)整）（PLL: P<2.2×10^-16; 飲食: P=7.37×10^-5; 飲食×PLL: P=0.633）。d，按脆弱性評(píng)分（經(jīng)技術(shù)和毛色調(diào)整）在28個(gè)月時(shí)的生存期，帶有回歸線和95%置信帶（p=0.00238; 飲食×特征: P=0.260, r=-0.90）。e，按年齡（平均數(shù)±2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)誤；樣本大小如c所述）和PLL進(jìn)行l(wèi)oess平滑處理及95%置信帶的體溫（°C; 經(jīng)毛色調(diào)整）（PLL: P<2.2×10^-16; 飲食: P<2.2×10^-16; 飲食×PLL: P=0.0242）。f，按年齡（平均數(shù)±2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)誤；樣本大小如c所述）和PLL進(jìn)行l(wèi)oess平滑處理及95%置信帶的空腹血糖（mg/dl，經(jīng)體重調(diào)整）（PLL: P<2.80×10^-4; 飲食: P<2.2×10^-16; 飲食×PLL: P=0.0368）。統(tǒng)計(jì)詳情見“縱向特征分析”（c、e、f）和“特征與壽命的關(guān)聯(lián)性”（d）部分的方法。BMD，骨密度；EE，能量消耗；RQ，呼吸商。

改善的葡萄糖穩(wěn)態(tài)、較低的能量消耗、降低的體溫和代謝靈活性的保留（delta呼吸商）是嚙齒動(dòng)物和人類中與DR相關(guān)的常見生理適應(yīng)，這些被提出作為DR延長(zhǎng)壽命的潛在機(jī)制39,40。隨著年齡的增長(zhǎng)，體溫下降（圖3e）。DR顯著降低了空腹血糖（圖3f）。然而，我們未發(fā)現(xiàn)壽命與空腹血糖、能量消耗或delta呼吸商之間存在顯著關(guān)聯(lián)（圖3b）。較高的體溫與較長(zhǎng)的壽命有中等程度的關(guān)聯(lián)，這不是預(yù)期的方向。盡管DR對(duì)代謝特征有深刻影響，但它們僅顯示弱或無關(guān)聯(lián)性與壽命。

DR對(duì)血細(xì)胞群落的影響

與健康和代謝特征不同，我們發(fā)現(xiàn)許多免疫學(xué)和血液學(xué)特征與壽命有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)（圖4a、b和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3c）。DO小鼠中隨年齡變化的免疫細(xì)胞亞群通常與之前描述的人類和常見近交系小鼠的變化一致41,42,43,44?？傮w而言，B細(xì)胞、效應(yīng)T細(xì)胞和炎性單核細(xì)胞的比例隨年齡積累增加，而淋巴細(xì)胞、成熟自然殺傷（NK）細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的總比例則下降（圖4c、d和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7a-d）。DR對(duì)淋巴細(xì)胞百分比或效應(yīng)T細(xì)胞百分比的年齡相關(guān)變化沒有顯著影響。然而，40% CR對(duì)成熟NK細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、循環(huán)B細(xì)胞和炎性單核細(xì)胞的頻率有深遠(yuǎn)影響（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7a-d）。

圖4：免疫和血液學(xué)特征隨年齡變化、響應(yīng)飲食并預(yù)測(cè)壽命。

a,b，在指定年齡對(duì)選定的血液學(xué)特征從流式細(xì)胞術(shù)（a）和免疫特征從完整血細(xì)胞計(jì)數(shù)（b）進(jìn)行飲食和體重調(diào)整后的與壽命的相關(guān)性。星號(hào)表示通過線性回歸分析壽命特征后的多重檢驗(yàn)調(diào)整顯著性，*p < 0.01, **p < 0.001, ***p < 0.0001。c，按年齡（平均數(shù)±2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)誤；n=936（5個(gè)月），n=830（16個(gè)月），n=485（28個(gè)月）小鼠）和PLL進(jìn)行l(wèi)oess平滑處理及95%置信帶的淋巴細(xì)胞（活細(xì)胞比例）（PLL: P<2.2×10^-16; 飲食: P<4.43×10^-8; 飲食×PLL: P=0.0670）。d，效應(yīng)CD4 T細(xì)胞（所有CD4 T細(xì)胞的比例）按年齡（平均數(shù)±2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)誤；樣本大小如c所述）和PLL進(jìn)行l(wèi)oess平滑處理及95%置信帶（PLL: P<2.2×10^-16; 飲食: P=0.268; 飲食×PLL: P=0.300）。e，紅細(xì)胞分布寬度（變異系數(shù)（cv））按年齡（平均數(shù)±2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)誤；n=892（10個(gè)月），n=665（22個(gè)月），n=208（34個(gè)月）小鼠）和PLL進(jìn)行l(wèi)oess平滑處理及95%置信帶（PLL: P<2.2×10^-16; 飲食: P<2.2×10^-16; 飲食×PLL: P=4.77×10^-5）。f，按10個(gè)月時(shí)的紅細(xì)胞分布寬度生存期，帶有回歸線、95%置信帶和特定飲食的相關(guān)性（p = 5.71×10^-11; 飲食×特征: P=0.395, r=-0.239）。統(tǒng)計(jì)測(cè)試的詳細(xì)信息見“縱向特征分析”（c-e）和“特征與壽命的關(guān)聯(lián)性”（f）部分的方法。CLL，慢性淋巴細(xì)胞白血病。

主要的紅細(xì)胞特征（血紅蛋白、血細(xì)胞比容、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)）隨著年齡的增長(zhǎng)而減少，而紅細(xì)胞分布寬度（RDW；紅細(xì)胞體積的變異系數(shù)）和血紅蛋白分布寬度（HDW；紅細(xì)胞血紅蛋白濃度的變異系數(shù)）均有所增加（圖4e、g 和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7g–i）。這些變化在同一動(dòng)物中同時(shí)發(fā)生，并且在老齡化人類群體中也觀察到平行的變化，在這些人群中貧血是一個(gè)常見且嚴(yán)重的問題45,46。在CR下血紅蛋白水平得到了改善（提高），但在IF下沒有，這表明CR在降低貧血風(fēng)險(xiǎn)方面具有有益效果。RDW對(duì)飲食的反應(yīng)是獨(dú)特的。到10個(gè)月大時(shí)，2D IF小鼠的RDW急劇增加，而在40% CR小鼠中增加程度較小。許多完整的血液計(jì)數(shù)（CBC）特征，包括RDW和血紅蛋白，在生命的最后25%顯示出拐點(diǎn)和更高的變化率，并作為即將發(fā)生的死亡指標(biāo)。在紅細(xì)胞特征中，HDW和RDW與壽命的關(guān)聯(lián)最強(qiáng)，大多數(shù)紅細(xì)胞特征顯示出與壽命的顯著正相關(guān)（血紅蛋白、血細(xì)胞比容、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)）或負(fù)相關(guān)（RDW、HDW）（圖4f 和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7k）。

DR對(duì)壽命影響的中介作用

鑒于有許多特征既受DR影響又與壽命相關(guān)，我們?cè)噲D估計(jì)通過測(cè)量的特征解釋的DR對(duì)壽命總效應(yīng)的比例。我們進(jìn)一步試圖通過識(shí)別條件獨(dú)立的特征組來解析DR的不同效應(yīng)，這些特征組作為潛在生理過程的代表，對(duì)壽命有影響。我們首先對(duì)194個(gè)特征進(jìn)行多元網(wǎng)絡(luò)分析，這些特征是在10至16個(gè)月大時(shí)評(píng)估的，加上壽命和飲食，并擬合了一個(gè)部分相關(guān)網(wǎng)絡(luò)（稀疏無向高斯圖形模型47）。該網(wǎng)絡(luò)揭示了高度相關(guān)的特征組，主要在表型域內(nèi)聚集（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8a 和補(bǔ)充表10），我們將這些特征與重要的生理變量（如能量消耗）聯(lián)系起來。為了識(shí)別條件獨(dú)立效應(yīng)，我們從整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的每個(gè)簇選擇了一個(gè)代表性特征子集（共21個(gè)典型特征）。然后我們擬合了一個(gè)簡(jiǎn)化的部分相關(guān)網(wǎng)絡(luò)，并執(zhí)行路徑分析48以分解飲食與壽命之間的協(xié)方差（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8b）?？傆?jì)，所有通過測(cè)量的特征路徑解釋了39%的飲食與壽命協(xié)方差（補(bǔ)充表11）。直接路徑（飲食→壽命）代表了剩余61%的未解釋協(xié)方差。下一個(gè)最高分路徑（飲食→PhenoDelta→壽命）解釋了10.8%的協(xié)方差，代表了DR對(duì)壽命的負(fù)面影響。另一個(gè)高分路徑（飲食→ RDW→壽命）也代表了DR對(duì)壽命的負(fù)面影響，解釋了0.7%的協(xié)方差。幾個(gè)包含代謝特征（能量消耗、葡萄糖、食物攝入）的路徑通過LTM匯聚，解釋了3.8%的協(xié)方差。其他高分路徑通過免疫特征起作用，包括淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和T細(xì)胞類別，并解釋了7.5%的協(xié)方差。盡管選定的特征不太可能是DR對(duì)壽命影響的直接因果中介，但它們作為代表DR影響機(jī)制的潛在機(jī)制的替代物。這些機(jī)制的鑒定可以為干預(yù)提供目標(biāo)。然而，獨(dú)立路徑的多樣性以及具有一致和不一致效應(yīng)的路徑的混合支持了DR對(duì)壽命影響的多效性模型。值得注意的是，DR對(duì)多個(gè)特征的影響，包括那些與壽命最強(qiáng)烈相關(guān)的特征，如表型期間的體重減輕和RDW，顯示出與DR對(duì)壽命直接影響相反的效果。

壽命的遺傳決定因素

我們獲得了929只（共937只）小鼠的全基因組基因型數(shù)據(jù)，并研究了飲食和遺傳學(xué)對(duì)壽命的綜合影響。對(duì)于至少活到6個(gè)月大的小鼠，遺傳背景解釋了23.6%的壽命變異（h2 = 0.236, 95% Bootstrap置信區(qū)間 0.106–0.360），而飲食僅解釋了7.4%的變異。隨著小鼠年齡的增長(zhǎng)，遺傳性下降到存活超過12個(gè)月的小鼠的17.1%，以及存活超過18個(gè)月的小鼠的15.9%。與此同時(shí)，飲食對(duì)壽命的貢獻(xiàn)隨年齡增加到12個(gè)月時(shí)的8.4%以及18個(gè)月時(shí)的11.4%。先前已報(bào)告過類似的遺傳效應(yīng)減少和DR效應(yīng)增加的趨勢(shì)，用于體重49（圖5a–c）。

圖5：DO小鼠中壽命的遺傳效應(yīng)。

a–c，由遺傳學(xué)和DR解釋的壽命變異比例隨年齡變化（>6個(gè)月 (a), >11個(gè)月 (b) 和 >17個(gè)月 (c)）。d,e，遺傳定位確定了與壽命（d）和RDW（e）在小鼠染色體18上的全基因組顯著關(guān)聯(lián)。x軸顯示基因組位置，y軸顯示對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的可能性比值（LOD分?jǐn)?shù)）。f，估計(jì)了每種創(chuàng)始品系單倍型的加性遺傳效應(yīng)（中心）對(duì)染色體18 QTL的RDW（x軸）和壽命（y軸）的影響（回歸系數(shù)±1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)誤；n=892只小鼠）。參考線（虛線）的斜率為-1，截距為0。g，按飲食組別顯示Kaplan–Meier生存曲線（顏色）針對(duì)攜帶QTL處的CAST等位基因的小鼠進(jìn)行了分層。虛線表示每組的中位生存年齡。顯著性是通過在基因型分層內(nèi)跨飲食比較的log-rank檢驗(yàn)計(jì)算得出。n=765（非CAST）和n=164（CAST）。

我們對(duì)生理特征進(jìn)行了遺傳定位分析，并鑒定了300個(gè)顯著的數(shù)量性狀基因座（QTL；全基因組調(diào)整P < 0.05；擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖9 和補(bǔ)充表12）。一個(gè)顯著的壽命QTL映射到染色體18的21.55 Mb處（95%支持區(qū)間=20.44–24.92；圖5d 和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖10a）。該QTL解釋了4.34%的飲食調(diào)整后的壽命方差，相當(dāng)于總遺傳效應(yīng)的23.4%。盡管超過75%的遺傳貢獻(xiàn)仍未解釋，但我們沒有檢測(cè)到任何額外的顯著壽命QTL。

在生理特征中，10個(gè)月時(shí)的紅細(xì)胞分布寬度（RDW）是唯一一個(gè)與壽命相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）共定位的特征（RDW QTL位于21.55 Mb處，95%支持區(qū)間=21.06–21.61；圖5e和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖10b）。我們估計(jì)了這些QTL處的創(chuàng)始株系單倍型的加性遺傳貢獻(xiàn)（DO小鼠源自八個(gè)近交系創(chuàng)始株），發(fā)現(xiàn)兩者都是由CAST/EiJ（CAST）創(chuàng)始株系單倍型驅(qū)動(dòng)的（圖5f）。在該位點(diǎn)存在CAST單倍型與縮短壽命和較高的RDW相關(guān)。在929只小鼠中，有164只至少攜帶一份CAST單倍型，這些小鼠的壽命平均減少了3.7個(gè)月（12.5%，P=6.66×10?7）。通過Kaplan-Meier分析壽命，按該QTL處是否存在CAST等位基因分層，證實(shí)飲食對(duì)兩種基因型組的壽命都有顯著影響（圖5g）。此外，攜帶CAST等位基因的小鼠顯示出壽命縮短，可能的例外是40% CR組，對(duì)于這組內(nèi)的基因型效應(yīng)測(cè)試不顯著（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖10c和補(bǔ)充表13）。

壽命和RDW的變異關(guān)聯(lián)作圖（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖10d,e）將QTL縮小到一個(gè)包含約20個(gè)位置候選基因的區(qū)域，包括Garem1、Klhl14、Asxl3、Mep1b、Rnf138和Rnf125，以及一個(gè)包含desmocollin和desmoglein家族成員（Dsc和Dsg）的簇。后者在維持紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和大小方面具有合理的功能作用。Garem1的功能喪失與小鼠的脾臟大小和形態(tài)有關(guān)50，這表明通過回收紅細(xì)胞與RDW之間可能存在聯(lián)系。在其他候選基因中，我們識(shí)別出一個(gè)在小鼠肝臟中有與CAST等位基因相關(guān)聯(lián)的eQTL（https://qtlviewer.jax.org/#datasets）。在QTL區(qū)域，包括Garem在內(nèi)的11個(gè)基因中，有34個(gè)錯(cuò)義變異具有私有的CAST等位基因。人類研究中已將RDW與壽命關(guān)聯(lián)起來52。盡管已報(bào)告了數(shù)百種與人類GWAS關(guān)聯(lián)的RDW53,54，但似乎沒有與小鼠染色體18 QTL同源或與人類壽命的GWAS關(guān)聯(lián)共定位。明確鑒定一個(gè)因果基因候選者可以進(jìn)一步闡明RDW與壽命之間的機(jī)制聯(lián)系。

討論

在這里，我們報(bào)告了分級(jí)CR和IF對(duì)近1000只雌性DO小鼠健康和壽命的影響，我們對(duì)數(shù)百個(gè)生理特征進(jìn)行了縱向剖析?？偟膩碚f，我們的研究突顯了生理韌性，特別是體重、體成分和關(guān)鍵免疫細(xì)胞群的維持，作為長(zhǎng)壽的主要生物標(biāo)志，并表明DR的促長(zhǎng)壽效應(yīng)可能與其對(duì)代謝特征的影響解耦。盡管本研究中DR的強(qiáng)大效果，但遺傳背景被證明是決定壽命的更重要因素。

我們的結(jié)果有幾個(gè)重要的含義（補(bǔ)充討論）。首先，它們表明DR對(duì)健康和長(zhǎng)壽的影響有所分歧。DR對(duì)代謝健康的幾種描述良好的影響，如改善空腹血糖、能量消耗和呼吸商的波動(dòng)，并未預(yù)測(cè)飲食組內(nèi)的壽命。這意味著，盡管DR誘導(dǎo)的代謝特征變化對(duì)健康有益，但不一定轉(zhuǎn)化為壽命的大幅延長(zhǎng)。這一見解對(duì)人類飲食干預(yù)研究中生物標(biāo)志物的選擇具有重要意義，這些研究通常關(guān)注代謝健康55。

其次，我們的發(fā)現(xiàn)更一般地意味著DR對(duì)健康和壽命的影響可能是部分不重疊的，某些延長(zhǎng)壽命的DR屬性實(shí)際上可能對(duì)其他生理健康方面有害。例如，盡管40% CR上的小鼠在大多數(shù)指標(biāo)上是健康的，但我們看到了一些不利影響的跡象，包括終生瘦體重?fù)p失、體溫降低、食物尋求行為（饑餓的跡象）和免疫譜系的變化，這可能會(huì)增加感染的易感性。這些在小鼠中的效果可能引發(fā)人們對(duì)人類極端DR潛在風(fēng)險(xiǎn)的擔(dān)憂。

最后，是否IF和CR會(huì)延長(zhǎng)人類的壽命仍有待確定性調(diào)查56。由于代謝率的差異，這些DR干預(yù)措施的人類等效尚不清楚。盡管需要進(jìn)一步工作來解析DR的復(fù)雜生理效應(yīng)，我們的發(fā)現(xiàn)表明，基于遺傳背景，人類對(duì)DR的反應(yīng)將是高度個(gè)體化的，適度減少熱量攝入和規(guī)律的日常喂養(yǎng)及禁食周期是關(guān)鍵的貢獻(xiàn)因素7,8，并且特定的血液生物標(biāo)志物可以預(yù)測(cè)個(gè)人從DR的某些生理效應(yīng)中受益的能力，同時(shí)承受其他方面的影響，以最大化其健康和長(zhǎng)壽效果。

實(shí)驗(yàn)方法 

小鼠

我們招募了960只雌性DO小鼠，分12個(gè)批次進(jìn)行，對(duì)應(yīng)于第22至24代和第26至28代的出生隊(duì)列，每代分別有80只初產(chǎn)婦和80只二胎動(dòng)物，這些動(dòng)物大約每隔3周出生一次。每個(gè)窩中最多只有一只小鼠被納入研究。第一批小鼠于2016年3月進(jìn)入研究，到2017年11月研究完全招募完畢。這一時(shí)間表旨在高效利用我們的表型分析能力，并盡量減少季節(jié)性混雜因素的干擾。樣本量確定為能夠檢測(cè)干預(yù)組之間10%的平均壽命變化，同時(shí)允許因非年齡相關(guān)事件造成的一些動(dòng)物損失。由于擔(dān)心雄性攻擊性，我們使用了雌性小鼠。小鼠被分配到八個(gè)一組的居住群體中，住在大型斷奶盒中，帶有正壓通風(fēng)和進(jìn)入空氣溫度為24.4至25.6攝氏度的環(huán)境。提供了包括巢穴、生物管和啃咬塊在內(nèi)的環(huán)境豐富物。根據(jù)住房組，將小鼠隨機(jī)分配到五種飲食干預(yù)措施之一。由于每個(gè)干預(yù)組有不同的喂養(yǎng)要求，無法實(shí)現(xiàn)盲法。在研究中登記的960只小鼠中，當(dāng)干預(yù)措施在6個(gè)月大時(shí)開始時(shí)，有937只小鼠存活，并且只有這些小鼠被納入我們的分析。所有用于研究的流程均經(jīng)過杰克遜實(shí)驗(yàn)室IACUC協(xié)議06005的審查和批準(zhǔn)。

飲食限制（DR）

通過控制提供給小鼠的食物的時(shí)間和數(shù)量來實(shí)施DR。DR的喂養(yǎng)計(jì)劃從6個(gè)月大時(shí)開始。所有小鼠都喂食標(biāo)準(zhǔn)的小鼠飼料（5K0G, LabDiet）。自由進(jìn)食（AL）組提供無限量的食物和水。間歇性禁食（IF）小鼠提供無限量的食物和水。每周三下午3點(diǎn)，將IF小鼠放入干凈的籠子中，并在接下來24或48小時(shí)內(nèi)分別對(duì)1D和2D組撤除食物。熱量限制（CR）小鼠提供無限量的水，每天下午3點(diǎn)左右提供固定量的食物，20% CR每天每只小鼠2.75克，40% CR每天每只小鼠2.06克。這些數(shù)量基于我們根據(jù)歷史上的DO小鼠飼養(yǎng)數(shù)據(jù)估計(jì)的AL攝入量3.43克/每只小鼠/每天。對(duì)于40% CR方案，實(shí)施了逐漸減少食物攝入的方法：首先讓小鼠接受20% CR兩周，然后額外兩周接受30% CR，再過渡到完整的40% CR。在2D IF方案中，最初讓小鼠適應(yīng)1D IF方案兩周。小鼠與多達(dá)八只小鼠共同飼養(yǎng)。共同飼養(yǎng)是CR研究的標(biāo)準(zhǔn)做法；通過將食物直接放入籠子底部，最小化了競(jìng)爭(zhēng)，允許個(gè)體小鼠“抓取”一個(gè)顆粒并在進(jìn)食時(shí)隔離自己。CR小鼠在周五下午被提供三天的食物量，這導(dǎo)致了每周的盛宴期，接著是大約1天的食物剝奪期（對(duì)于20% CR小鼠）和2天的食物剝奪期（對(duì)于40% CR小鼠），與IF禁食期相當(dāng)。下午3點(diǎn)的喂食時(shí)間緊密地接近了喂食的晝夜節(jié)律，正好在黑暗周期開始之前，這是小鼠的正?；钴S和進(jìn)食時(shí)間。這種時(shí)機(jī)安排已被證明能最大程度地延長(zhǎng)受30% CR處理的小鼠的壽命。周五三倍喂食引發(fā)的盛宴-饑荒周期在其他CR研究中也被使用過，但直接評(píng)估其健康影響的研究缺乏。

食物攝入（160只獨(dú)立的小鼠隊(duì)列）

為了準(zhǔn)確估計(jì)食物攝入以及每周禁食周期引起的體重變化，我們?cè)O(shè)立了一個(gè)獨(dú)立的160只雌性DO小鼠隊(duì)列。將這些小鼠置于與主研究相同的DR方案中。在小鼠30、36和43周齡時(shí)，每天稱量食物一周。食物攝入數(shù)據(jù)按每只小鼠每天的克數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并按時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)每日和每周平均值。在43和45周齡時(shí)，使用非成像核磁共振（NMR）設(shè)備Echo MRI進(jìn)行體成分測(cè)定，該設(shè)備配有5高斯磁體，適用于小動(dòng)物研究。NMR數(shù)據(jù)用于檢測(cè)禁食前后的體重和體成分變化。禁食前的體重、瘦體重、脂肪重量和脂肪率（100%×脂肪重量/總重量）與禁食后的差異（對(duì)于AL和CR是周五到周一；對(duì)于1D IF是周二到周四；對(duì)于2D IF是周二到周五）共同繪制。

表型分析

我們?cè)谠缙?、中期和晚期進(jìn)行了三次健康評(píng)估周期。這些評(píng)估包括在大約16、62和114周齡時(shí)進(jìn)行的為期7天的代謝籠實(shí)驗(yàn)；在24、71和122周齡時(shí)收集血液進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析；在大約44、96和144周齡時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)輪試驗(yàn)、體成分、超聲心動(dòng)圖、聽覺驚嚇反應(yīng)、膀胱功能、跑輪和CBC分析的血液收集。此外，每周記錄體重，每6個(gè)月進(jìn)行手動(dòng)虛弱和握力評(píng)估。所有實(shí)驗(yàn)均按照杰克遜實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行。

體重

我們?cè)谡麄€(gè)生命周期內(nèi)每周稱重一次小鼠，共縱向收集了超過100,000個(gè)值，涉及937只小鼠。體重?cái)?shù)據(jù)在小鼠內(nèi)部經(jīng)過局部多項(xiàng)式回歸擬合（即loess平滑）后進(jìn)行分析。

虛弱、握力和體溫

我們應(yīng)用了臨床相關(guān)的FI38的修改版本，該指數(shù)計(jì)算為31個(gè)指示年齡相關(guān)缺陷和健康惡化的特征的平均值。每個(gè)特征按0、0.5或1的等級(jí)評(píng)分，其中0表示沒有缺陷；0.5表示輕度缺陷；1表示嚴(yán)重缺陷。測(cè)量在基線時(shí)（5個(gè)月）進(jìn)行，并大約每6個(gè)月重復(fù)一次。簡(jiǎn)單平均得到每只小鼠之間的原始FI分?jǐn)?shù)，范圍從0到1。通過估計(jì)批次、毛色和實(shí)驗(yàn)者效應(yīng)作為隨機(jī)因素，從原始虛弱分?jǐn)?shù)中減去這些效應(yīng)進(jìn)行調(diào)整，然后在統(tǒng)計(jì)分析前進(jìn)行調(diào)整。Body 好的，以下是您需要的中文譯文： 

我們使用LUNAR PIXImus II雙能X射線骨密度儀進(jìn)行了雙能X射線吸收法分析，以收集小鼠的骨密度和體成分（包括脂肪和非脂肪瘦肉組織）。小鼠被麻醉后單獨(dú)放置在一個(gè)一次性塑料托盤上，然后將托盤放置在PIXImus的曝光平臺(tái)上。獲取單次掃描的過程大約需要4分鐘。測(cè)量在大約44周齡、96周齡和144周齡時(shí)進(jìn)行。

流式細(xì)胞術(shù)免疫細(xì)胞分型

外周血樣本通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析，以確定主要循環(huán)免疫細(xì)胞亞群的頻率。分析在飲食干預(yù)開始前的5個(gè)月進(jìn)行，然后在16個(gè)月和24個(gè)月齡時(shí)進(jìn)行。這些時(shí)間點(diǎn)分別對(duì)應(yīng)于飲食干預(yù)后的11個(gè)月和19個(gè)月。PBL樣本中的紅細(xì)胞被裂解，樣本用FACS緩沖液（Mitenyi, 130-091-222）洗滌。細(xì)胞重懸在含有0.5% BSA的25μl FACS緩沖液中（Miltenyi, 130-091-222 with 130-091-376）。添加了包括Fc阻斷劑（2.4G2, Leinco Technologies）在內(nèi)的抗體，并在4°C下孵育30分鐘。標(biāo)記后的細(xì)胞經(jīng)洗滌，加入DAPI后在LSRII（BD Bioscience）系統(tǒng)上進(jìn)行分析?？贵w雞尾酒包含CD11c FITC, N418 (Tonbo Biosciences, 1:100); NKG2D (CD314) PE, CX5 (BD Biosciences, 1:80); CD3e PE-CF594, 145-2C11 (BD Biosciences, 1:40); CD19 BB700, 1D3 (BD Biosciences, 1:40); CD62L PE-Cy7, MEL-14 (Tonbo Biosciences, 1:100); CD25 APC, PC61 (BioLegend, 1:80); CD44 APC-Cy7, IM7 (Tonbo Biosciences, 1:40); Ly6G BV421, 1A8 (BD Biosciences, 1:80); CD4 BV570, RM4-5 (BioLegend, 1:40); CD11b BV650, M1/70 (BD Biosciences, 1:160); CD45R/B220 BUV496 (RA3-6B2, BD Biosciences, 1:20); Fc阻斷劑, 2.4G2 (C247, Leinco Technologies, 1:100)。

由于這些小鼠的雜交性質(zhì)，流式細(xì)胞術(shù)標(biāo)記受到限制，T細(xì)胞亞群通常根據(jù)CD62L和CD44的存在被分為初始和非初始。NKG2D陽性細(xì)胞被計(jì)數(shù)，可能代表在免疫反應(yīng)后積累的記憶T細(xì)胞。由于識(shí)別小鼠品系中NK細(xì)胞及其亞群的流式細(xì)胞術(shù)標(biāo)記的限制，NK細(xì)胞被定義為表達(dá)NKG2D的非T非B淋巴細(xì)胞。在這個(gè)群體中，CD11c和CD11b被用于一般定義成熟亞群。CD11b表達(dá)標(biāo)記更成熟的NK細(xì)胞，而CD11c在最不成熟的NK亞組上減少。

血糖

在16周、62周和114周的流式細(xì)胞術(shù)血液采集時(shí)，小鼠被禁食4小時(shí)，并使用LifeScan的OneTouch Ultra2血糖儀及OneTouch Ultra測(cè)試條測(cè)量血糖。在24周、71周和122周的每次CBC血液采集時(shí)，非禁食血糖使用血糖儀測(cè)量。

超聲心動(dòng)圖

使用VisualSonics（VSI）Vevo 770/2100高頻超聲系統(tǒng)進(jìn)行超聲檢查，配備30 MHz和40 MHz探頭。超聲心動(dòng)圖利用脈沖多普勒超聲技術(shù)，通過超聲探頭測(cè)量血流速率和體積。

代謝監(jiān)測(cè)籠

小鼠在Promethion Model代謝籠（Sable Systems International）中單獨(dú)飼養(yǎng)7天，跟蹤其活動(dòng)、進(jìn)食和呼吸情況。維持飲食干預(yù)的喂養(yǎng)方案。代謝籠數(shù)據(jù)用于評(píng)估Y1、Y2和Y3期間小鼠的代謝、能量消耗和活動(dòng)情況。動(dòng)物級(jí)數(shù)據(jù)經(jīng)過清理，去除異常值和儀器故障，匯總為累積值（食物、跑輪距離）或每5分鐘間隔的中位數(shù)（呼吸商、能量消耗）。計(jì)算4小時(shí)和1小時(shí)間隔的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并繪制為時(shí)間點(diǎn)間隔的均值±2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)誤。計(jì)算動(dòng)物級(jí)匯總數(shù)據(jù)，作為每天（24小時(shí)）、光照期（12小時(shí)）或暗期（12小時(shí)）中值的平均值。此外，我們還計(jì)算了‘變化’特征（例如，delta呼吸商和delta能量消耗），作為整個(gè)7天運(yùn)行中所有1小時(shí)匯總的5th到95th百分位之間的差異。

CBC分析

血液樣本在Siemens ADVIA 2120血液學(xué)分析儀上運(yùn)行，并使用之前描述的小鼠專用軟件進(jìn)行分析。

聽覺驚嚇反應(yīng)

使用自動(dòng)化驚嚇室測(cè)量嚙齒類動(dòng)物的驚嚇反應(yīng)，將小鼠放置在透明的丙烯酸管中，該管放置在高度敏感的平臺(tái)上，平臺(tái)校準(zhǔn)以跟蹤其驚嚇反射，同時(shí)暴露于一系列不同分貝和時(shí)間的聲刺激。小鼠最初暴露于頭頂揚(yáng)聲器發(fā)出的白噪聲，然后轉(zhuǎn)變?yōu)橐幌盗须S機(jī)生成的計(jì)算機(jī)化刺激，音量范圍從70到120分貝，持續(xù)時(shí)間為40毫秒，間隔為9–22秒。測(cè)試運(yùn)行約30分鐘。

轉(zhuǎn)輪試驗(yàn)

我們使用了Ugo-Basile轉(zhuǎn)輪儀，該儀器有五個(gè)均勻分布在電機(jī)驅(qū)動(dòng)的水平旋轉(zhuǎn)桿上的通道，允許同時(shí)測(cè)試多達(dá)五只小鼠。每個(gè)通道下方都有一個(gè)帶有跳板的平臺(tái)，用于記錄每只小鼠掉落的潛伏時(shí)間。在測(cè)試開始時(shí)，小鼠被放置在旋轉(zhuǎn)桿上，旋轉(zhuǎn)桿以4轉(zhuǎn)/分鐘的速度開始旋轉(zhuǎn)，并在300秒內(nèi)緩慢加速到最大速度40轉(zhuǎn)/分鐘。小鼠進(jìn)行了三次連續(xù)試驗(yàn)。我們報(bào)告了平均潛伏時(shí)間（跌落時(shí)間）和各次試驗(yàn)中潛伏時(shí)間的斜率，以及沒有跌落的試驗(yàn)次數(shù)和立即跌落的試驗(yàn)次數(shù)。如果小鼠不配合測(cè)試，試驗(yàn)將被記錄為缺失。

排空測(cè)定

通過剪一塊360克重的吸水紙至標(biāo)準(zhǔn)雙層籠子尺寸來準(zhǔn)備籠子。從干凈的籠子中移除刨花，并將紙張粘貼到籠子底部。在此測(cè)試期間提供食物；然而，移除水以防止可能泄漏到吸水紙上。小鼠被單獨(dú)放置在準(zhǔn)備好的籠子里4小時(shí)。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將小鼠返回到其原始住所，取出并晾干紙張2–4小時(shí)，然后分別裝袋。將紙張運(yùn)送到Beth Israel Deaconess醫(yī)學(xué)中心，在那里用紫外線掃描以成像和量化排便斑點(diǎn)。

自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)

在大約44周、96周和144周齡時(shí)收集自由轉(zhuǎn)輪運(yùn)動(dòng)數(shù)據(jù)。小鼠被單獨(dú)放置在一個(gè)特殊籠子中至少36小時(shí)，該籠子適合容納Med Associate低輪廓跑輪和無線發(fā)射器。移除食物漏斗以允許跑輪順暢移動(dòng)，并將食物放置在籠子地板上。直徑15.5厘米的塑料跑輪位于電子底座上的一個(gè)角度，底座跟蹤轉(zhuǎn)數(shù)。電池供電的底座允許持續(xù)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，然后以30秒的間隔無線傳輸?shù)奖镜赜?jì)算機(jī)。

壽命

研究工作人員定期評(píng)估小鼠的預(yù)定臨床癥狀：可觸摸的低溫、對(duì)刺激的反應(yīng)能力、進(jìn)食或飲水的能力、皮炎、腫瘤、腹部膨脹、活動(dòng)能力、眼部狀況（如角膜潰瘍）、錯(cuò)頜、創(chuàng)傷和攻擊傷口。如果小鼠符合這些類別中的任何觀察標(biāo)準(zhǔn)，將聯(lián)系獸醫(yī)人員。如果臨床團(tuán)隊(duì)確定小鼠明顯低溫且無反應(yīng)，無法進(jìn)食或飲水，和/或符合嚴(yán)重皮炎、腫瘤和/或戰(zhàn)斗傷口的協(xié)議標(biāo)準(zhǔn)，則進(jìn)行預(yù)防性安樂死以防止痛苦；否則，獸醫(yī)人員提供治療。無論是安樂死還是發(fā)現(xiàn)的死亡小鼠均在生存曲線中表示為死亡。因與臨近死亡無關(guān)的傷害而被安樂死的小鼠被視為截尾（我們記錄了總共13個(gè)截尾事件）。

數(shù)據(jù)準(zhǔn)備和分析

使用云端研究管理軟件（Climb by Rockstep）來追蹤動(dòng)物、安排測(cè)試并為原始數(shù)據(jù)收集提供穩(wěn)定的存儲(chǔ)庫。數(shù)據(jù)在研究期間由統(tǒng)計(jì)分析師定期審查異常情況。初始數(shù)據(jù)質(zhì)量控制包括識(shí)別和解決設(shè)備誤校準(zhǔn)、動(dòng)物標(biāo)簽錯(cuò)誤和技術(shù)不可能值。如果我們不能使用實(shí)驗(yàn)室記錄手動(dòng)更正這些問題，它們將被移除。探索了包括體重和體溫在內(nèi)的定量測(cè)定中的離群值。除體重外的定量特征被校正為批次效應(yīng)。為了量化批次效應(yīng)，我們基于飲食、測(cè)試時(shí)的體重和年齡擬合了一個(gè)完全隨機(jī)效應(yīng)的線性混合模型。我們通過減去批次模型系數(shù)來調(diào)整特征值。壽命數(shù)據(jù)以天記錄，但為了便于解釋，以月（每月30.4天）為單位呈現(xiàn)。主要文本中報(bào)告的極其小的P值的統(tǒng)計(jì)顯著性為P < 2.2 × 10^-16；非截?cái)嗟腜值在補(bǔ)充信息中提供。所有分析均使用R v.4.2.2和RStudio v.2022.12.0+353進(jìn)行。數(shù)據(jù)分析腳本是可用的（數(shù)據(jù)可用性）。

生存分析

我們對(duì)五個(gè)研究組的壽命結(jié)果進(jìn)行了生存分析。我們繪制了Kaplan-Meier生存曲線，并使用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)測(cè)試了不同飲食組之間生存分布的等同性，使用總體檢驗(yàn)（4 d.f.）和飲食之間的所有成對(duì)比較。P值未進(jìn)行多重測(cè)試調(diào)整報(bào)告，我們認(rèn)為P < 0.01的比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們估計(jì)了各飲食組的中位壽命和最大壽命（90%存活率），以及相對(duì)于AL組的95%置信區(qū)間和百分比變化。使用Gompertz對(duì)數(shù)線性危險(xiǎn)模型估算了死亡率翻倍時(shí)間，95%置信區(qū)間和相對(duì)于AL組的百分比變化（flexsurv R包v.2.2.2）。

縱向特征分析

對(duì)于每年或每?jī)赡晔占奶卣?，我們能夠探索與飲食、體重和年齡相關(guān)的假設(shè)直接和間接關(guān)系。我們使用廣義可加性混合模型（GAMMs）與高斯/恒等鏈接分析這些效應(yīng)，通過擬合特征響應(yīng)與協(xié)變量之間的一系列非線性關(guān)系。GAMMs結(jié)合了固定效應(yīng)和隨機(jī)效應(yīng)（如下所示的公式），使用R中的gam()函數(shù)擬合mgcv包，采用Newton優(yōu)化器和默認(rèn)控制參數(shù)。將年齡重新縮放為已生活的比例（PLL = 測(cè)試時(shí)的年齡/壽命）。PLL比例尺消除了不同壽命組之間因生存偏差而產(chǎn)生的偽像。在擬合模型之前，除PLL外的所有連續(xù)變量都被轉(zhuǎn)換為排名正態(tài)得分（RZ）。

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