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導(dǎo)讀  

肝細(xì)胞癌(HCC)是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，而晚期HCC的治療選擇有限。本研究觀察到腸道生態(tài)失調(diào)會(huì)影響抗腫瘤免疫監(jiān)測并推動(dòng)肝病向癌癥發(fā)展。Nlrp6-/-小鼠中失調(diào)的微生物群誘導(dǎo)肝單核型髓系抑制性細(xì)胞(mMDSC)擴(kuò)增，并抑制T細(xì)胞增殖。這種表型可通過糞便菌群移植傳播，經(jīng)抗生素治療后可逆轉(zhuǎn)，表明腫瘤微環(huán)境具有高度可塑性。Akkermansia muciniphila的缺失與mMDSC豐度相關(guān)，重新引入此菌可恢復(fù)腸道屏障功能并降低肝臟炎癥和纖維化。肝硬化患者肝組織中細(xì)菌豐度增加，可引起明顯的轉(zhuǎn)錄變化，包括激活纖維-炎癥通路以及介導(dǎo)癌癥免疫抑制的回路。本研究表明，腸道菌群可重塑肝臟炎癥微環(huán)境，為癌癥預(yù)防和治療開辟了新途徑。  

論文ID

原名：Imbalanced gut microbiota fuels hepatocellular carcinoma development by shaping the hepatic inflammatory microenvironment

譯名：不平衡的腸道菌群通過塑造肝臟炎癥微環(huán)境促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)展

期刊：Nature Communication

IF：17.694

發(fā)表時(shí)間：2022.7

通訊作者：Christian Trautwein

通訊作者單位：德國亞琛工業(yè)大學(xué)

DOI號(hào)：10.1038/s41467-022-31312-5

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

結(jié)果

1 NLRP6缺失促進(jìn)NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝病進(jìn)展

NLRP6炎性小體是腸道中維持宿主-微生物穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子，為了研究Nlrp6-/-介導(dǎo)的腸道生態(tài)失調(diào)對(duì)脂肪性肝炎進(jìn)展的影響，我們將NEMOΔhepa與Nlrp6-/-小鼠交配得到NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠。與NEMOΔhepa小鼠相比，52周齡的NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠顯示出更高的腫瘤負(fù)荷，而且肝臟/體重比也明顯增加(圖1a-b)。與NEMOΔhepa小鼠相比，NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷氨酸脫氫酶(GLDH)、堿性磷酸酶(AP)和膽紅素水平升高，肝損傷增加(圖1c)。肝切片H&E和CD45免疫組織化學(xué)染色顯示，NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠顯示出明顯的免疫細(xì)胞浸潤(圖1d)。天狼星紅(SR)染色以及促纖維化基因Tgfβ和Collagen1a1的mRNA表達(dá)水平證實(shí)肝纖維化(圖1d-e)。肝切片染色顯示NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠均表現(xiàn)出明顯的免疫細(xì)胞浸潤(圖1d)。然而，與NEMOΔhepa小鼠相比，NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝臟中CD11b+細(xì)胞數(shù)量顯著增加(圖1f)。相反，當(dāng)NLRP6缺失時(shí)，CD8+ T細(xì)胞減少(圖1f)。值得注意的是，WT小鼠中NLRP6的缺失不足以導(dǎo)致肝損傷、炎癥或纖維化(圖1)。

如前所述，在NEMO缺失的情況下，經(jīng)典NF-kB通路的激活所導(dǎo)致的肝細(xì)胞死亡是由于抗凋亡基因表達(dá)缺失。因此，本研究聚焦肝臟炎癥如何影響小鼠的細(xì)胞死亡和代償性增殖。雖然腫瘤組織中促炎細(xì)胞因子Tnfa、Il6、Il1β以及炎性小體成分Caspase-1和Nlrp3的mRNA表達(dá)水平保持不變，但在沒有腫瘤的整個(gè)肝組織中，髓系CD11b+細(xì)胞浸潤與促炎細(xì)胞因子Tnfa、Tlr4、Il1β、Nlrp3和Ccl5的高表達(dá)密切相關(guān)(圖1g)。先前的研究表明，NLRP6的缺失會(huì)導(dǎo)致NLRP327的過度激活。雖然Nlrp3 mRNA表達(dá)水平增加，但我們無法在蛋白質(zhì)水平上證實(shí)這一點(diǎn)(補(bǔ)充圖1e, f)。此外，Nlrp3基因表達(dá)在早期13周時(shí)間點(diǎn)沒有變化，表明在NLRP6缺失的情況下，Nlrp3炎性小體過表達(dá)并不會(huì)介導(dǎo)觀察到的表型(補(bǔ)充圖1g)。52周齡NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的炎癥表型與pJNKd的顯著激活相關(guān)(圖1h)，這與裂解Caspase3染色和代償性增殖顯示的凋亡性肝細(xì)胞死亡增加相關(guān)(圖1i-j)。綜上，這些結(jié)果表明NLRP6缺失重塑NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠腫瘤微環(huán)境的炎癥反應(yīng)，并推動(dòng)肝臟疾病向纖維化和癌癥發(fā)展。

圖1. NLRP6缺失促進(jìn)NEMOΔhepa小鼠肝病進(jìn)展。a. 52周齡NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝臟的外觀圖。b. 對(duì)NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝臟中直徑大于1cm的腫瘤進(jìn)行量化。c. 52周齡NEMOΔhepa (n=12)、NEMOΔhepa/Nlrp6-/-(n=8)小鼠與相應(yīng)對(duì)照組WT(n=6)、Nlrp6-/-(n=6)小鼠血清中ALT和GLDH水平。d. 52周齡WT、Nlrp6-/-、NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝切片H&E染色、CD45免疫組織化學(xué)(IHC)染色和天狼星紅染色代表圖片。e. RT-qPCR分析NEMOΔhepa、NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠與相應(yīng)對(duì)照組WT、Nlrp6-/-小鼠肝臟中促纖維因子(TGFβ、Col1al)mRNA表達(dá)水平。f.NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠與相應(yīng)對(duì)照組WT、Nlrp6-/-小鼠肝臟CD11b和CD8免疫熒光染色圖，DAPI用于染細(xì)胞核。g. RT-qPCR分析NEMOΔhepa，NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠與相應(yīng)對(duì)照組WT，Nlrp6-/-小鼠肝臟中炎性因子(TNFα、IL-1β、Tlr4) mRNA表達(dá)水平。h.以JNK、p-JNK和GAPDH為對(duì)照的52周齡的各基因型小鼠肝蛋白提取物的免疫印跡分析。i. 每個(gè)視野中裂解Caspase 3陽性細(xì)胞的組織學(xué)定量。j. KI67的IF染色代表性圖片。比例尺：100 μm。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)表示。

2 Nlrp6缺失與NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠腸道菌群失調(diào)和屏障受損相關(guān)

來自雜合Nlrp6+/-親代的WT和Nlrp6-/-同窩仔，在斷奶后分別在無特定病原體(SPF)條件下至少繁殖3代，以促進(jìn)Nlrp6-/-小鼠中失調(diào)菌群的發(fā)展。后續(xù)利用這些雄性小鼠研究腸道菌群失調(diào)對(duì)脂肪性肝炎進(jìn)展的影響。采用16S rRNA基因擴(kuò)增子測序分析13周齡和52周齡NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠以及對(duì)照組WT和Nlrp6-/-小鼠的盲腸微生物群組成。首先，基于Bray-Curtis差異比較了13周齡和52周齡小鼠之間的β多樣性，即小鼠之間腸道菌群組成的差異。為評(píng)估基因型(WT、Nlrp6-/-、NEMOΔhepa、NEMOΔhepa/Nlrp6-/-)、飼養(yǎng)籠、NEMO基因型(WT，Nlrp6-/- vs NEMOΔhepa，NEMOΔhepa/Nlrp6-/-)以及小鼠品系(Nlrp6-/-，NEMOΔhepa/Nlrp6-/- vs WT，NEMOΔhepa)對(duì)組間微生物組成差異的相對(duì)貢獻(xiàn)，我們進(jìn)行了置換多變量方差分析(ADONIS)?；蛐汀曫B(yǎng)籠、NEMOΔhepa基因型和小鼠品系解釋了13周齡小鼠中微生物群總變異的很大比例(圖2a)。這些分析結(jié)果也表明了顯著的飼養(yǎng)籠效應(yīng)。將基因型和飼養(yǎng)籠納入ADONIS分析，基因型仍然可以解釋微生物群總變異的很大一部分(R=0.296，p =0.003)。NEMOΔhepa和NEMOfl/fl，NEMOΔhepa/Nlrp6-/-和NEMOfl/fl/Nlrp6-/-同窩小鼠同籠飼養(yǎng)，NEMO條件性缺失以及所導(dǎo)致的脂肪性肝炎對(duì)腸道微生物群組成仍有可重復(fù)的影響。β多樣性分析證實(shí)了Nlrp6-/-品系中獨(dú)特的微生物群，這解釋了微生物群總變異的16%(圖2a)。

基于DESeq2和LEfSe進(jìn)行差異豐度分析，結(jié)果顯示NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中Muribaculum豐度相對(duì)增加，而Verrucomicrobiaceae和Lachnospiraceae中幾種菌顯著減少(圖2b-c)。所有組進(jìn)行成對(duì)比較顯示，與WT小鼠相比，Nlrp6-/-小鼠中Roseburia和Lachnospiraceae減少。與WT同窩小鼠相比，NEMOΔhepa中Akkermansia增加，而此菌在NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中完全消失。這些細(xì)菌在13周齡和52周齡NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中均不存在，可在LEfSe分析中區(qū)分NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠(圖3c)。接下來，分析了不同基因型小鼠的腸組織切片，以探索菌群變化對(duì)腸道功能的影響。A. muciniphila可降解粘蛋白，與粘液層的增厚和腸道屏障的改善有關(guān)。因此，我們分析了結(jié)腸粘液層，結(jié)果顯示NLRP6的缺失與結(jié)腸粘液層變薄相關(guān)，且在NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中最為明顯。通過對(duì)腸道不同部位的緊密連接蛋白ZO-1進(jìn)行免疫熒光染色，探究腸道屏障功能。與WT小鼠相比，52周齡NEMOΔhepa小鼠的十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸中ZO-1的表達(dá)降低(圖2d)。NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中ZO-1進(jìn)一步減少，在回腸和結(jié)腸最為明顯。與NEMOΔhepa小鼠相比，52周齡NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的回腸和結(jié)腸組織裂解物中閉鎖蛋白表達(dá)降低(圖2e，f)。然而，NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠顯示出ZO-1進(jìn)一步減少，這在回腸和結(jié)腸中最為明顯。與NEMOΔhepa小鼠相比，52周齡NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的回腸和結(jié)腸組織裂解物中occludin蛋白表達(dá)降低(圖2e, f)。有趣的是，TJ屏障的破壞與炎癥基因(如Il1β、Il18、Mcp1和Ccl5)的mRNA表達(dá)增加以及回腸組織中CD11b+細(xì)胞浸潤增加有關(guān)(圖2g)?？傊@些結(jié)果顯示NLRP6表達(dá)缺失所引起的腸道生態(tài)失調(diào)促使腸道TJ屏障破壞，炎癥基因表達(dá)增加。

圖2. NLRP6缺失導(dǎo)致腸道生態(tài)失調(diào)和與脂肪性肝炎活性和腫瘤負(fù)荷相關(guān)的腸道屏障受損。a.16S rRNA基因擴(kuò)增子測序分析13周齡WT、Nlrp6-/-、NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠盲腸菌群組成。b. DESq分析13周齡NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的差異菌群。c. LEFSe分析NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠腸道菌群。d. NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-和相應(yīng)的對(duì)照組WT和Nlrp6-/-小鼠回腸和結(jié)腸ZO-1 IF染色的代表性圖片。e,f. 免疫印跡分析52周齡小鼠回腸和結(jié)腸組織蛋白提取物中Occludin的表達(dá)，β-actin作為內(nèi)參。g. RT-qPCR分析NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠回腸中炎性因子(IL-1β、Il-18、TNFα、Mcp1、Ccl5)的mRNA表達(dá)水平。h. 灌胃FITC-葡聚糖評(píng)估NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠腸道通透性。i. FITC-葡聚糖通透性與腸道屏障功能強(qiáng)相關(guān)，紅點(diǎn)代NEMOΔhepa/Nlrp6-/-，藍(lán)點(diǎn)代表NEMOΔhepa小鼠。

3 腸道通透性與脂肪性肝炎和增加的腫瘤負(fù)荷相關(guān)

接下來，我們研究了NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠腸道生態(tài)失調(diào)和腸道屏障損傷對(duì)腸道功能的影響。與NEMOΔhepa對(duì)照相比，NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠腸通透性明顯增加(圖2h)。值得注意的是，ALT水平和腫瘤數(shù)量與腸道通透性密切相關(guān)(圖2i)，表明腸道屏障受損加劇NEMOΔhepa小鼠的肝臟疾病。

4 NLRP6缺失重塑肝臟免疫微環(huán)境

13周齡NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝組織中白細(xì)胞浸潤增加，SR染色顯示肝纖維化加重，Ki67免疫組織化學(xué)(IHC)染色表明肝細(xì)胞增殖增加(圖3a-b)。與NEMOΔhepa小鼠相比，NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的ALT、AST和GLDH水平顯著增加，表明肝損傷更為嚴(yán)重(圖3c)；且NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的肝臟/體重比顯著增加。星狀細(xì)胞可觸發(fā)HCC發(fā)展過程中的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。與NEMOΔhepa小鼠相比，aSMA染色顯示13周齡NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠星狀細(xì)胞活化增加。然而，沒有證據(jù)表明NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝臟中hedgehog信號(hào)激活增加(補(bǔ)充圖3f)。腸道生態(tài)失調(diào)和屏障受損促進(jìn)MAMPs通過門靜脈進(jìn)入肝臟，從而激活由病原體識(shí)別受體(PRR)介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)。與NEMOΔhepa小鼠相比，NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝臟中CD45+白細(xì)胞浸潤顯著增加(圖3d-e)。與NEMOΔhepa相比，流式細(xì)胞術(shù)分析(FACS)顯示髓系抑制性細(xì)胞(CD45+CD11b+Ly6G-Gr1hi)以及CD11b+Ly6G+細(xì)胞浸潤顯著增加(圖3f)。值得一提的是，mMDSC豐度與ALT水平密切相關(guān)，表明它們介導(dǎo)NEMOΔhepa小鼠肝損傷(圖3g)。mMDSC在腫瘤發(fā)展中對(duì)T細(xì)胞具有明顯抑制效應(yīng)，NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中細(xì)胞毒性CD8+ T細(xì)胞(CD45+CD3+CD8+)和CD4+ T細(xì)胞(CD45+CD3+CD4+)明顯減少(圖3h)。mMDSC豐度與細(xì)胞毒性T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)(圖3i)。其他免疫細(xì)胞亞群，如Kupffer細(xì)胞、NK/NKT細(xì)胞和B細(xì)胞保持不變。此外，在NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中觀察到M2標(biāo)志物Arg1表達(dá)增加，而M1標(biāo)志物Nos2表達(dá)降低，表明這些小鼠中存在促腫瘤微環(huán)境。

5 NEMOΔhepa/Nlrp6-/-mMDSCs在體外抑制T細(xì)胞增殖

根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)不能充分定義MDSCs。因此，我們進(jìn)行了額外的染色和功能分析，以進(jìn)一步確定細(xì)胞表型。CD11b+ mMDSCs和CD8+ T細(xì)胞非常接近，在NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的肝臟中最為明顯(補(bǔ)充圖5a)。接下來，我們分離并進(jìn)一步表征了這些細(xì)胞，并通過體外實(shí)驗(yàn)檢測它們對(duì)T細(xì)胞的抑制能力。從WT和Nlrp6-/-小鼠脾臟中分離T細(xì)胞，用CFSE標(biāo)記，CD3/CD28刺激后，與NEMOΔhepa或NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝臟中分離的粒細(xì)胞MDSC(CD45+Ly6G+Gr1hi)或mMDSC(CD45+Ly6G-Gr1hi)共培養(yǎng)，結(jié)果顯示mMDSCs明顯抑制CD8+ T細(xì)胞增殖，且在與NEMOΔhepa/Nlrp6-/- mMDSCs共培養(yǎng)時(shí)抑制效應(yīng)最明顯(圖3i)。這些結(jié)果說明，NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠腸道生態(tài)失調(diào)與mMDSCs擴(kuò)增密切相關(guān)，同時(shí)與NEMOΔhepa mMDSCs相比，NEMOΔhepa/Nlrp6-/-mMDSCs具有更強(qiáng)的抑制效應(yīng)。

圖3. mMDSCs促進(jìn)NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠脂肪性肝炎進(jìn)展。a. 13周齡WT、Nlrp6-/-、NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝切片KI67免疫組織化學(xué)染色和HE染色代表性圖片。比例尺:100 μm。b. 每個(gè)視野中Ki67+細(xì)胞的組織學(xué)定量。c. 13周齡NEMOΔhepa、NEMOΔhepa/Nlrp6-/-和相應(yīng)的對(duì)照組WT、Nlrp6-/-小鼠血清中ALT和GLDH水平。d,e. 13周齡小鼠CD45肝切片免疫組化代表性圖片(d)及定量分析(e)。f. 流式細(xì)胞術(shù)分析各基因型13周齡小鼠(NEMOΔhepa、NEMOΔhepa/Nlrp6-/-和對(duì)照WT、Nlrp6-/-)肝臟中單核細(xì)胞骨髓源性抑制細(xì)胞(mMDSC)。g. NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中，CD45+活細(xì)胞中mMDSCs的比例與ALT水平密切相關(guān)。h.流式細(xì)胞術(shù)分析各基因型13周齡小鼠(NEMOΔhepa、NEMOΔhepa/Nlrp6-/-和對(duì)照WT、Nlrp6-/-)肝臟中CD3+CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的比例。i. CD45+活細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的mMDSCs百分比呈負(fù)相關(guān)。j. 體外T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。T細(xì)胞與粒細(xì)胞MDSCs或單核MDSCs共培養(yǎng)。

6 微生物減少重塑肝臟炎癥微環(huán)境并改善脂肪性肝炎

為探究腸道微生物群是否影響NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝臟中炎癥反應(yīng)，我們利用廣譜抗生素(ABx)組合處理8周齡小鼠直至第13周?？股靥幚韺?dǎo)致腸道菌群幾乎完全清除。值得注意的是，ABx處理后NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的肝轉(zhuǎn)氨酶水平與NEMOΔhepa小鼠相似，并且與未處理小鼠相比顯著降低(圖4a)。重要的是，ABx處理導(dǎo)致mMDSC顯著降低，F(xiàn)ACS證明了這一點(diǎn)，同時(shí)也反映在IF染色中CD11b+細(xì)胞的數(shù)量減少(圖4b，c)。相反，ABx處理導(dǎo)致CD8+ T細(xì)胞和CD4+ T細(xì)胞擴(kuò)增，幾乎達(dá)到NEMOΔhepa小鼠肝臟中的水平(圖4b)。

7 NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的免疫表型可通過FMT傳遞到NEMOΔhepa小鼠并涉及TLR4信號(hào)

在NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中，ABx清除腸道菌群可改善肝損傷、抑制mMDSC浸潤并恢復(fù)細(xì)胞毒性T細(xì)胞豐度(圖4b)。為了進(jìn)一步探究Nlrp6-/-小鼠腸道菌群的致病性，我們將NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠糞便菌群移植(FMT)到NEMOΔhepa小鼠。微生物群轉(zhuǎn)移導(dǎo)致NEMOΔhepa腸道菌群沿NMDS軸1移動(dòng)。DESeq2和LEfSe分析比較了進(jìn)行/不進(jìn)行FMT的NEMOΔhepa小鼠菌群組成，表明這種轉(zhuǎn)變主要由A. muciniphila的差異豐度導(dǎo)致(圖4d)。值得注意的是，在FMT中，所有受體NEMOΔhepa小鼠均缺乏A. muciniphila，在比較NEMOΔhepa FMT-受體與NEMOΔhepa/Nlrp6-/- FMT-供體的LEfSe分析中，只觀察到一個(gè)差異OTU (OTU23_ambiguous_taxa)，進(jìn)一步支持了成功的微生物轉(zhuǎn)移。FMT導(dǎo)致NEMOΔhepa小鼠的肝轉(zhuǎn)氨酶AST和ALT顯著增加(圖4e)。NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠微生物的FMT導(dǎo)致受體NEMOΔhepa小鼠肝臟中CD45+白細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量增加，mMDSC顯著擴(kuò)增，并有效抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞(圖4f-h)。

由于NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的腸道生態(tài)失調(diào)會(huì)損害腸道屏障功能，從而促進(jìn)PRRs的激活，我們測試了TLR4是否參與FMT介導(dǎo)的mMDSCs增殖。利用NEMOΔhepa/Tlr4-/-作為受體小鼠，將NNEMOΔhepa或NEMOΔhepa/Nlrp6-/-腸道菌群轉(zhuǎn)移到同窩受體小鼠中。與移植NEMOΔhepa腸道菌群相比，移植NEMOΔhepa/Nlrp6-/-腸道菌群的NEMOΔhepa/Tlr4-/-小鼠，其肝損傷并未增加，血清AST和ALT水平以及mMDSC豐度保持不變(圖4i-j)。與TLR4參與mMDSC擴(kuò)增一致，8周齡和52周齡的NEMOΔhepa/Tlr4-/-小鼠mMDSC豐度降低。這一觀察結(jié)果也與肝轉(zhuǎn)氨酶水平降低、細(xì)胞死亡和增殖減少以及52周齡小鼠的腫瘤負(fù)荷降低相關(guān)。此外，mMDSC豐度降低與CD3+CD4+ T細(xì)胞增加有關(guān)。為了確定這種免疫表型是由造血細(xì)胞還是實(shí)質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)，我們進(jìn)行了骨髓移植實(shí)驗(yàn)。與接受WT骨髓的NEMOΔhepa小鼠相比，接受Tlr4-/-供體骨髓的嵌合小鼠顯示出mMDSC豐度顯著降低了6倍以上，表明造血細(xì)胞中TLR4參與上述免疫表型調(diào)控?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的免疫表型可經(jīng)FMT傳遞給NEMOΔhepa小鼠。確切地說，造血細(xì)胞中的TLR4信號(hào)增強(qiáng)了mMDSC浸潤并促進(jìn)脂肪性肝炎向HCC發(fā)展。

圖4. 腸道菌群重塑NEMOΔhepa小鼠肝臟免疫微環(huán)境。a.從第8周起至第13周，用抗生素處理NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠，分析小鼠血清AST和ALT水平。b. 流式細(xì)胞術(shù)分析 經(jīng)/未經(jīng)ABX處理NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝臟中mMDSC細(xì)胞與CD3+CD8+ T細(xì)胞。c. 經(jīng)/未經(jīng)ABX處理的NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠CD11b免疫熒光染色代表性圖片。d. DESeq分析13周齡NEMOΔhepa和NEMOΔhepa-FMT小鼠微生物群差異豐度。e. NEMOΔhepa小鼠(有/沒有移植NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠腸道菌群)血清中AST水平。f. 有/沒有FMT的NEMOΔhepa小鼠中CD11b的免疫熒光染色。g.h. 流式細(xì)胞術(shù)分析有/沒有FMT的NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠肝臟中mMDSC細(xì)胞和CD3+CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞。i-j. 流式細(xì)胞術(shù)分析NEMOΔhepa和NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠腸道菌群的NEMOΔhepa/Tlr4-/-小鼠血清中ALT和AST水平(i)和肝臟中mMDSC細(xì)胞(j)。

8 NEMOΔhepa小鼠腸道菌群的特定改變與肝病表型相關(guān)

13周齡和52周齡NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的腸道微生物群與NEMOΔhepa小鼠明顯不同。腸道菌群可重塑肝臟炎癥微環(huán)境。因此，我們探究哪些微生物群的特定變化可能影響NEMOΔhepa小鼠的肝病。LEfSe分析顯示，與NEMOΔhepa小鼠相比，A. muciniphila在13周和52周齡的NEMOΔhepa/Nlrp6-/-以及接受FMT的NEMOΔhepa小鼠中顯著減少(圖2b)。此外，在NEMOΔhepa小鼠中，A. muciniphila的相對(duì)豐度與肝臟mMDSC豐度以及血清ALT和GLDH水平呈負(fù)相關(guān)，表明這些細(xì)菌在介導(dǎo)表型中的相關(guān)性(圖5a)。因此，我們?cè)贜EMOΔhepa小鼠中驗(yàn)證A. muciniphila移植是否可以改善肝臟疾病。用2×108CFU的A. muciniphila或厭氧PBS對(duì)8周的NEMOΔhepa同窩小鼠進(jìn)行口服灌胃，每周3次，持續(xù)5周(圖5b)。通過對(duì)灌胃5周前后的糞便樣本進(jìn)行RT-qPCR和16S rRNA基因擴(kuò)增子測序，證實(shí)了成功的微生物群移植(圖5c)。PCA分析顯示，AKK處理不僅增加了這種特定細(xì)菌的豐度，而且導(dǎo)致微生物群組成發(fā)生顯著變化(圖5c)。A. muciniphila處理解釋了在這些小鼠中觀察到的微生物群總變異的很大比例。LEfSe分析顯示擬桿菌門減少，Akkermansia增加(圖5d)。DESeq2分析顯示，補(bǔ)充Akkermansia還導(dǎo)致Lachospiraceae和Blautia豐度增加，這與微生物群整體豐度的增加有關(guān)。與PBS處理的對(duì)照小鼠相比，經(jīng)A. muciniphila灌胃的NEMOΔhepa小鼠的結(jié)腸粘液層明顯增厚且ZO-1表達(dá)增加。結(jié)腸組織裂解物的蛋白質(zhì)印跡分析顯示，A. muciniphila灌胃后，Occludin蛋白水平顯著增加(圖5g)。與PBS對(duì)照相比，經(jīng)A. muciniphila灌胃的NEMOΔhepa小鼠中，肝損傷標(biāo)志物(即ALT、AST、LDH和GLDH)的血清水平明顯降低(圖5h)。CD45和CD11b染色顯示，A. muciniphila處理導(dǎo)致肝纖維化和白細(xì)胞浸潤顯著減少(圖5i)。與此一致，A. muciniphila灌胃的NEMOΔhepa小鼠中纖維炎癥基因的mRNA表達(dá)顯著降低(圖5j)。最后，我們探究在Nlrp6-/-生態(tài)失調(diào)模型中是否可以改善肝臟疾病的進(jìn)展。與PBS處理的NEMOΔhepa小鼠相比，A. muciniphila處理可降低NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的肝損傷，這與骨髓CD11b+細(xì)胞浸潤顯著減少和SR染色證明的肝纖維化降低有關(guān)。這些數(shù)據(jù)共同表明，即使存在促進(jìn)生態(tài)失調(diào)的宿主因素(如NLRP6缺失)，持續(xù)補(bǔ)充A. muciniphila也可以減少肝損傷、炎癥和纖維化。

圖5. 補(bǔ)充A. muciniphila可改善NEMOΔhepa小鼠的肝臟疾病。a. NEMOΔhepa小鼠盲腸A. muciniphila的相對(duì)豐度與mMDSCs的相關(guān)性分析。b. 實(shí)驗(yàn)流程，8周齡的NEMOΔhepa小鼠連續(xù)5周灌胃2.1×108 CFU AKK或厭氧PBS。c.d. PCoA分析(c)和LEFSe分析(d) NEMOΔhepa小鼠AKK處理前后的微生物群。e.f. AKK或PBS處理NEMOΔhepa小鼠結(jié)腸MUC2免疫熒光染色(e)和回腸、結(jié)腸ZO-1免疫熒光染色(f)的代表性圖片。免疫印跡分析NEMOΔhepa小鼠灌胃AKK菌或PBS 5周后結(jié)腸蛋白提取物中occludin蛋白表達(dá)，β-actin作為內(nèi)參。h. NEMOΔhepa小鼠灌胃AKK菌或PBS 5周后血清中ALT和AST水平，非配對(duì)t檢驗(yàn)。i. NNEMOΔhepa小鼠灌胃AKK菌或PBS后H＆E染色的肝切片和CD11b免疫熒光染色的代表性圖片。j. RT-qPCR分析NNEMOΔhepa小鼠灌胃AKK菌或PBS 5周后肝臟組織中炎癥因子和促纖維化因子(TGFβ、Col1a1、Mcp-1、Tlr4)的mRNA表達(dá)水平。

9 肝硬化患者的細(xì)菌易位較高，影響肝臟轉(zhuǎn)錄譜

接下來，我們探究在小鼠中觀察到的結(jié)果是否也適用于人類。因此，我們從接受肝移植的晚期混合病因肝硬化患者(n=43)和接受其他腹部手術(shù)的對(duì)照組患者(n=12)中收集速凍肝組織。利用16S rRNA基因擴(kuò)增子測序分析肝臟細(xì)菌DNA豐度。同時(shí)通過mRNA測序研究宿主基因表達(dá)，以評(píng)估細(xì)菌易位如何影響肝臟轉(zhuǎn)錄譜。RT-qPCR檢測顯示，與對(duì)照組相比，肝硬化患者每納克總DNA中具有更高的16S rRNA基因拷貝(圖6b)。肝硬化患者表現(xiàn)出更高的α多樣性(Shannon指數(shù))。NMDS排序顯示肝硬化患者與對(duì)照組之間存在中度聚類(補(bǔ)充圖9b)(R2= 0.038, p = 0.01, ADONIS)，并且在LEfSe分析中，Stenotrophomonas、Roseburia、Sphingobiom以及Psychrobacter將肝硬化患者與對(duì)照區(qū)分開。乳桿菌目與患者的MELD評(píng)分和膽紅素水平呈負(fù)相關(guān)(補(bǔ)充表3)。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的PCA分析顯示肝硬化患者和對(duì)照的明顯聚類?；赑ROGENy的通路分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，肝硬化患者中纖維炎癥通路TGFβ、NFκB、TNFα和缺氧以及與肝損傷修復(fù)、再生和惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)的通路(如EGFR、MAPK、P53、PI3K和WNT)顯著上調(diào)(圖6c)。MAPK和TGFβ信號(hào)通路的激活與肝臟中16S rDNA豐度相關(guān)(圖6c)。此外，梭菌屬豐度與MAPK、EGFR、TNFa和NFκB通路激活相關(guān)?；贒oRothEA推測的幾種致癌轉(zhuǎn)錄因子(如FOS、ETS2、RELB、SOX10、ERG、WT1和JUND)以及干性轉(zhuǎn)錄因子(如PBPJ和ARID3A)在肝硬化患者中上調(diào)并與細(xì)菌易位相關(guān)。此外，癌癥相關(guān)基因也與16S rRNA基因豐度相關(guān)。

10 細(xì)菌易位塑造炎癥微環(huán)境并促進(jìn)肝硬化中T細(xì)胞耗竭標(biāo)志物的表達(dá)

基于小鼠數(shù)據(jù)，我們下一步專門研究了細(xì)菌易位對(duì)人類肝硬化肝臟炎癥環(huán)境的影響。為此，利用xCell對(duì)肝細(xì)胞基因表達(dá)譜分析，肝硬化表現(xiàn)出整體免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的富集，而肝細(xì)胞評(píng)分相對(duì)降低(圖6d)。有趣的是，16Sr RNA基因豐度升高與CD8+ T細(xì)胞、NKT細(xì)胞、CD4+中央記憶性T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增加有關(guān)，后者與腫瘤免疫抑制相關(guān)(圖6d)。包括編碼PD-1的PDCD1和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4 (CTLA4)在內(nèi)的幾個(gè)免疫檢查點(diǎn)基因顯示出與16S rRNA豐度的強(qiáng)相關(guān)性(圖6e，f)。與這些研究結(jié)果一致，胸腺細(xì)胞選擇相關(guān)基因TOX、IRF4以及REL和BACH2(指導(dǎo)人類癌癥中的T細(xì)胞耗竭和免疫抑制)與16S rRNA 基因豐度高度相關(guān)(圖6g)。相反，與T細(xì)胞活化狀態(tài)相關(guān)的TOX3轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和活性是與16S rDNA豐度負(fù)相關(guān)最強(qiáng)的5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子之一。暴露于MAMPs和PAMPs時(shí)，先天免疫反應(yīng)的激活依賴于通過PRRs感知。幾種PRRs(如NOD1、NLRP3和TLR2)的表達(dá)均與細(xì)菌易位相關(guān)。MDSCs是MAMPs和PAMP的重要傳感器，可能抑制T細(xì)胞功能。MDSC標(biāo)記集落刺激因子受體2a(CSFR2A)和白細(xì)胞介素1受體2(IL1R2)的表達(dá)水平均與16S rRNA基因豐度密切相關(guān)。總之，這些數(shù)據(jù)表明，肝硬化患者的細(xì)菌易位與纖維炎癥通路以及與免疫抑制和T細(xì)胞耗竭相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子激活密切相關(guān)。

圖6. 肝硬化患者細(xì)菌16S rDNA增加并改變肝臟轉(zhuǎn)錄譜。a.研究流程：速凍手術(shù)肝組織標(biāo)本取自44名接受肝移植的肝硬化患者或11名健康對(duì)照者。從同一組織標(biāo)本和組織區(qū)域分離DNA和mRNA，并進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增子測序或mRNA測序。b. RT-qPCR分析對(duì)照(n = 12)和肝硬化患者(n = 43)患者每納克DNA中16S rRNA基因拷貝數(shù)。c.基于mRNA測序數(shù)據(jù)和PROGENy推測健康對(duì)照和肝硬化患者的信號(hào)通路分析。d.健康對(duì)照和肝硬化患者中細(xì)胞類型富集，以及與16S rRNA基因相對(duì)豐度的相關(guān)性分析。e.16S rRNA基因豐度與免疫檢查點(diǎn)基因的表達(dá)密切相關(guān)。f-g. 每納克基因組DNA中rRNA基因拷貝與CTLA4和T細(xì)胞耗竭相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(TOX,IRF4)表達(dá)的相關(guān)性。

討論

腸-肝軸和腸道菌群是慢性肝病研究的熱點(diǎn)，也是進(jìn)行慢性肝病發(fā)病機(jī)制探究的基石。本研究認(rèn)為腸道屏障損傷和細(xì)菌易位是重塑肝臟炎癥微環(huán)境和促進(jìn)肝臟疾病向肝硬化和HCC發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制。慢性疾病、與現(xiàn)代西方生活方式相關(guān)的環(huán)境和飲食因素以及藥物治療已被發(fā)現(xiàn)有助于腸道生態(tài)失調(diào)。這些因素改變腸道菌群構(gòu)成，并直接影響機(jī)體炎癥狀態(tài)。由于肝臟通過門靜脈不斷地暴露于來自腸道的大量微生物衍生物，腸道穩(wěn)態(tài)的變化影響肝臟的生理機(jī)能。

小鼠模型是進(jìn)行腸-肝軸機(jī)制研究的有效工具。NLRP6炎性小體是腸道中維持宿主-微生物穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)因子，而NEMOΔhepa小鼠是自發(fā)性脂肪性肝炎、肝纖維化小鼠模型，最終可發(fā)展為肝細(xì)胞癌。因此，本研究利用NLRP6缺失的NEMOΔhepa小鼠(即NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠)進(jìn)行慢性肝病的機(jī)制探索。有趣的是，NEMOΔhepa小鼠的微生物群不同于WT小鼠，并且NEMOΔhepa小鼠腸屏障受損。肝臟中NEMO缺失損害腸道屏障的機(jī)制值得未來進(jìn)一步探究，這可能受膽汁酸成分的變化或系統(tǒng)性炎癥失調(diào)的影響。NLRP6 NEMO其他IKK組分的缺失在人類HCC中尚未被報(bào)道，本研究所利用的小鼠模型很好地反映了人類肝臟疾病進(jìn)展的基本機(jī)制，為探究NLRP6缺失所引起的腸道生態(tài)失調(diào)對(duì)肝臟疾病進(jìn)展的影響提供有力的工具。本研究顯示NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的腸道菌群變化可轉(zhuǎn)化為與脂肪性肝炎活動(dòng)性標(biāo)志物以及腫瘤負(fù)荷密切相關(guān)的腸道屏障功能受損。NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的微生物群與NEMOΔhepa小鼠存在顯著差異。NLRP6缺失與致病菌Muribaculum豐度增加相關(guān)，而A. muciniphila缺失。幾項(xiàng)人類和小鼠研究表明，A. muciniphila通過改善腸屏障功能有益宿主健康。有趣的是，有研究指出在早期HCC患者中發(fā)現(xiàn)A. muciniphila缺失。

為了探究觀察到的表型變化是否是由改變的腸道菌群介導(dǎo)，我們進(jìn)行了腸道菌群調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)。有趣的是，NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的表型可通過糞便移植(FMT)傳播，并在Abx治療時(shí)可逆。NEMOΔhepa小鼠NLRP6缺失或者將NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的腸道菌群移植到NEMOΔhepa小鼠中引發(fā)了明顯的肝髓系細(xì)胞浸潤(定義為CD11b+Ly6G+Gr1hi)。根據(jù)表面標(biāo)志物的表達(dá)并在體外證實(shí)其對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)后，將這些細(xì)胞稱為mMDSCs。這些動(dòng)態(tài)變化與T細(xì)胞豐度減少有關(guān)，表明與腸道菌群相關(guān)的肝臟炎癥微環(huán)境具有高度的細(xì)胞可塑性。既往研究報(bào)道了CD8+ T細(xì)胞在HCC中的抗腫瘤活性，但這取決于它們的表型和組織微環(huán)境。它們還可能促進(jìn)肝損傷并向HCC發(fā)展。未來CD8+ T細(xì)胞耗竭實(shí)驗(yàn)可能有助于在該模型中建立因果關(guān)系。既往報(bào)道認(rèn)為肝癌發(fā)展過程中Kupffer細(xì)胞和巨噬細(xì)胞會(huì)發(fā)生表型變化并形成促腫瘤微環(huán)境。本研究沒有觀察到Kupffer細(xì)胞豐度的變化，肝臟基因表達(dá)分析顯示存在促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化的微環(huán)境。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以在腸道中進(jìn)行重編程，并可能在肝臟中發(fā)揮其免疫抑制功能。雖然這不是本研究的重點(diǎn)，但未來對(duì)該機(jī)制的研究可加深對(duì)HCC發(fā)展過程中腸道介導(dǎo)的免疫調(diào)控的理解。我們假設(shè)PRR信號(hào)尤其是TLR4可能是這種應(yīng)答的重要協(xié)調(diào)者，本研究發(fā)現(xiàn)52周齡NEMOΔhepa/Tlr4-/-小鼠的MDSCs明顯降低，CD4+T細(xì)胞增加，這與腫瘤負(fù)荷的降低密切相關(guān)。此外，將NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的失調(diào)腸道菌群移植到NEMOΔhepa/Tlr4-/-小鼠中并未能促進(jìn)mMDSCs擴(kuò)增。這與之前的研究一致，即TLR4介導(dǎo)的PRR信號(hào)參與MDSC增殖。但我們不能排除其他PRRs或者菌群依賴的方式所形成的信號(hào)回路對(duì)肝硬化中炎癥反應(yīng)的調(diào)控。幾乎所有HCC病例都發(fā)生在肝硬化的背景下，由先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)介導(dǎo)的慢性炎癥驅(qū)動(dòng)疾病進(jìn)展。T細(xì)胞和B細(xì)胞的免疫監(jiān)視也可以限制肝癌的發(fā)生。因此，T細(xì)胞和MDSCs之間的相互作用至關(guān)重要，因?yàn)镸DSCs積累可導(dǎo)致T細(xì)胞衰竭，從而促進(jìn)HCC的進(jìn)展?？傊?，免疫調(diào)控在肝病惡性轉(zhuǎn)化的過程中至關(guān)重要，探索其中的分子機(jī)制可為疾病治療提供新的途徑。腸道菌群可以通過MAMPs、微生物代謝物、膽汁酸以及短鏈脂肪酸等多種方式調(diào)控肝臟免疫反應(yīng)。

在患者中，評(píng)估腸道屏障功能、細(xì)菌易位及其對(duì)肝臟的影響具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)槿狈α己玫姆乔秩胄匝鍢?biāo)志物來檢測屏障功能受損和肝臟炎癥。雖然一系列研究已將腸道菌群的變化和宏基因組分析與臨床和組織病理學(xué)肝硬化表型聯(lián)系起來，但尚不清楚這些變化是否直接影響肝臟炎癥反應(yīng)或肝臟轉(zhuǎn)錄組?；诒狙芯康男∈竽Ｐ停覀兗僭O(shè)細(xì)菌易位可能影響晚期肝硬化患者的肝臟炎癥微環(huán)境。因此，本研究通過對(duì)肝組織16S rRNA分析評(píng)估細(xì)菌易位，量化總細(xì)菌DNA含量，進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增子測序并將這些數(shù)據(jù)與來自同一組織樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。根據(jù)本研究的小鼠數(shù)據(jù)，細(xì)菌易位與人類肝硬化中的纖維-炎癥轉(zhuǎn)錄通路密切相關(guān)，表明細(xì)菌易位是肝病進(jìn)展的驅(qū)動(dòng)因素。本研究NEMOΔhepa小鼠的數(shù)據(jù)與一項(xiàng)臨床研究一致，與健康對(duì)照組相比，肝硬化患者腸道炎癥(鈣衛(wèi)蛋白)以及通透性(ZO-1和LPS)的血清標(biāo)志物增加。有趣的是，與對(duì)照組相比，NAFLD肝硬化患者屏障功能受損與Akkermansia豐度降低以及循環(huán)mMDSCs降低相關(guān)。此外，我們發(fā)現(xiàn)短期調(diào)節(jié)NEMOΔhepa小鼠的腸道菌群，可引起mMDSC和T細(xì)胞豐度的顯著變化。補(bǔ)充單一細(xì)菌Akkermansia muciniphila可改善腸道屏障功能，減少M(fèi)DSCs的浸潤并抑制脂肪性肝炎活動(dòng)?？傊@些數(shù)據(jù)需要進(jìn)一步研究以評(píng)估在HCC患者中補(bǔ)充Akkermansia的治療效果。理想的研究將涉及肝臟活檢和菌群樣本的收集，這將建立起腸道菌群與肝臟16S rRNA基因豐度和肝臟轉(zhuǎn)錄譜的相關(guān)性。

最近的一項(xiàng)臨床試驗(yàn)顯示，連續(xù)3個(gè)月每天補(bǔ)充A. muciniphila具有良好的耐受性，改善了肥胖性胰島素抵抗受試者的胰島素敏感性和血脂狀況。與本研究的小鼠數(shù)據(jù)類似，調(diào)節(jié)腸道菌群有可能重塑HCC患者的肝臟炎癥環(huán)境，這一假設(shè)也受到一系列強(qiáng)調(diào)腸道菌群在免疫檢查點(diǎn)治療中的作用的研究的啟發(fā)。最近的研究將Akkermansia的豐度與良好的治療效果聯(lián)系起來，但在治療前攝入廣譜抗生素會(huì)導(dǎo)致腸道生態(tài)失調(diào)，從而損害治療反應(yīng)。盡管研究的肝硬化組織可能無法具體反映HCC微環(huán)境，但觀察到的肝臟16S rRNA豐度與纖維-炎癥通路的表達(dá)、癌癥免疫抑制基因以及MDSCs、T細(xì)胞耗竭和PRR信號(hào)通路等與HCC疾病進(jìn)展密切相關(guān)。推測肝臟16S rRNA基因豐度可作為腸道屏障受損和生態(tài)失調(diào)的生物標(biāo)志物，有助于預(yù)測對(duì)免疫療法的治療反應(yīng)，并識(shí)別可能受益于菌群調(diào)節(jié)治療的患者。基于PCR的檢測可以在標(biāo)準(zhǔn)的臨床活檢工作流程中輕松實(shí)施。本研究的局限性是功能微生物群調(diào)節(jié)研究僅在小鼠中進(jìn)行，還需要在臨床上進(jìn)行大規(guī)模研究?；诒狙芯康哪c道菌群分析以及其他關(guān)于A. muciniphila和腸道穩(wěn)態(tài)的研究，我們將功能實(shí)驗(yàn)集中在這種共生菌上。本研究發(fā)現(xiàn)NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠中Blautia的豐度也有所降低。既往研究認(rèn)為Blautia可產(chǎn)生短鏈脂肪酸，進(jìn)而發(fā)揮抗炎效應(yīng)。Blautia或其他共生菌株也可能具有保護(hù)作用。未來的研究可以探索Blautia在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用。最后，使用無菌小鼠進(jìn)行的菌群調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)將提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，以此來探究Nlrp6-/-小鼠腸道菌群的轉(zhuǎn)移是否導(dǎo)致HCC發(fā)展將會(huì)很有趣。本研究中RNA測序數(shù)據(jù)將細(xì)菌易位與纖維-炎癥通路以及參與T細(xì)胞衰竭的TF表達(dá)聯(lián)系起來。但未來研究需要涉及蛋白質(zhì)和組織學(xué)數(shù)據(jù)以進(jìn)一步證實(shí)這些發(fā)現(xiàn)。

結(jié)論

綜上，本研究基于小鼠模型和人類臨床研究數(shù)據(jù)，表明腸道菌群直接影響肝臟炎癥微環(huán)境。NEMOΔhepa/Nlrp6-/-小鼠的失調(diào)不良菌群可傳播至NEMOΔhepa小鼠，通過促進(jìn)mMDSCs和抑制CD8+ T細(xì)胞加劇肝臟疾病進(jìn)展。重要的是，通過調(diào)控腸道菌群重塑炎癥微環(huán)境，為微生物群靶向治療提供了合理的依據(jù)。肝硬化患者的肝組織微生物群與肝轉(zhuǎn)錄組特征的關(guān)聯(lián)仍需要大規(guī)模的研究來評(píng)估其診斷應(yīng)用。

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網(wǎng)址: 科研丨Nature子刊(IF:17.69): 不平衡的腸道菌群通過塑造肝臟炎癥微環(huán)境促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)展 http://m.u1s5d6.cn/newsview638717.html