本發(fā)明涉及低鐵補(bǔ)血?jiǎng)?、黑木耳黑色素活性成分及其用途?br>背景技術(shù)：
：缺鐵性貧血(irondeficiencyanemia，ida)是人體內(nèi)鐵儲(chǔ)備耗竭導(dǎo)致血紅蛋白合成減少而引起的貧血。這類貧血的特點(diǎn)是骨髓、肝、脾等組織中缺乏可染色鐵，血清鐵、轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度和鐵蛋白降低。導(dǎo)致缺鐵性貧血的發(fā)病原因較多，一般歸納為：(1)鐵需要增加，多發(fā)生于嬰幼兒和妊娠期婦女；(2)鐵攝入不足及吸收不良，造成鐵攝入不足的常見原因是食物中鐵的含量不足、偏食，食物中蔬菜、谷類、茶葉中的磷酸鹽、植酸、單寧酸均會(huì)減少鐵在胃腸道的吸收；(3)慢性出血，導(dǎo)致慢性失血的原因很多，男性患者一般為胃腸道的急性和慢性出血，女性患者的患病原因多為月經(jīng)過(guò)多。缺鐵性貧血最終結(jié)果均是由于體內(nèi)的鐵不足以維系機(jī)體代謝對(duì)鐵的需求，影響血細(xì)胞內(nèi)血紅素的合成從而導(dǎo)致缺鐵性貧血的發(fā)生。作為全世界發(fā)病率居高不下的營(yíng)養(yǎng)缺乏類型疾病之一，缺鐵性貧血不同程度的影響著全世界約22億人口，該病在發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率明顯高于發(fā)達(dá)國(guó)家，在我國(guó)各階層及年齡段人群中缺鐵性貧血發(fā)病率約為20％，情況嚴(yán)重地區(qū)兒童缺鐵性貧血的發(fā)病率高達(dá)70％。根據(jù)調(diào)查顯示：在6個(gè)月～2歲嬰幼兒中鐵缺乏癥的年發(fā)病率為75.0％～82.5％、妊娠3個(gè)月以上婦女患有鐵缺乏癥的比例為66.7％、育齡婦女此比例為43.3％，10歲～17歲青少年此比例為13.2％；以上人群中缺鐵性貧血(ida)患病率分別是33.8％～45.7％，19.3％，11.4％，9.8％。當(dāng)缺鐵性貧血發(fā)生時(shí)，機(jī)體最開始的改變是多個(gè)組織或器官缺鐵，表現(xiàn)為鐵缺乏癥，組織中與鐵相關(guān)的酶活性和酶活力顯著下降，患有缺鐵性貧血的人表現(xiàn)出體力、免疫力、肌肉耐力等下降，由于血紅蛋白和紅細(xì)胞數(shù)量的減少，血液的運(yùn)氧能力下降，這可導(dǎo)致組織缺氧，患者出現(xiàn)神疲乏力、精神狀態(tài)下降、胸悶氣短、頭暈?zāi)垦５劝Y狀。世界上大多數(shù)人口的飲食中是缺乏鐵元素，尤其是在以植物性食物為主的國(guó)家。在預(yù)防和治療缺鐵性貧血過(guò)程中，口服鐵劑顯然是最為理想的，使用鐵補(bǔ)充劑或營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑是目前用于治療或防治缺鐵性貧血的主要方法，由于其簡(jiǎn)單方便易于臨床應(yīng)用，膳食補(bǔ)鐵和口服補(bǔ)鐵藥物來(lái)預(yù)防和治療缺鐵性貧血被廣泛應(yīng)用。截至目前，世界衛(wèi)生組織允許使用的用于治療缺鐵性貧血的補(bǔ)血?jiǎng)┐蟾庞?0余種，這些鐵補(bǔ)充劑按照鐵的存在狀態(tài)主要分為無(wú)機(jī)鐵和有機(jī)鐵兩大類，按照其在人體中的存形式分為血紅素鐵和非血紅素鐵兩大類。然而，雖然這些補(bǔ)鐵劑經(jīng)過(guò)了長(zhǎng)期的應(yīng)用和發(fā)展，但仍存在一些不足和其他副作用。亞鐵鹽類化合物是補(bǔ)鐵效果最好的補(bǔ)鐵劑，但可以引起多種副作用。研究發(fā)現(xiàn)口服補(bǔ)鐵劑可能會(huì)使結(jié)腸中產(chǎn)生的自由基增加導(dǎo)致粘膜細(xì)胞損傷，還可以增加大鼠結(jié)腸中的脂質(zhì)過(guò)氧化，從而影響腸上皮細(xì)胞完整性；另有研究發(fā)現(xiàn)，鐵缺乏和鐵超載都與免疫應(yīng)答受損有關(guān)，原因在于服用補(bǔ)鐵劑后會(huì)有大量不能被人體吸收的鐵進(jìn)入腸道所導(dǎo)致。長(zhǎng)期服用補(bǔ)鐵劑的副作用包括上腹疼痛、惡心、腹瀉、便秘，以至于患者不得不停止治療。為了能夠治療缺鐵性貧血，患者在忍受高劑量水平鐵劑補(bǔ)充帶來(lái)痛苦的同時(shí)，大量未被吸收的鐵會(huì)隨著食物和胃腸的蠕動(dòng)到達(dá)大腸而被腸道菌群利用，打破腸道菌群的平衡，對(duì)腸道健康造成不利的影響。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有補(bǔ)鐵劑會(huì)引起惡心、腹痛、腹瀉、便秘，腸道菌群失調(diào)、對(duì)胃腸健康造成危害等副作用，在保持至少相等補(bǔ)血效果的同時(shí)大量降低藥劑中的鐵含量，避免鐵超載影響人體免疫應(yīng)答，而提供的低鐵補(bǔ)血?jiǎng)⒑谀径谏鼗钚猿煞謋1及其用途。黑木耳黑色素活性成分f1按以下步驟制備獲得：一、將黑木耳黑色素以5mg/ml的濃度溶于naoh溶液中，然后上樣葡聚糖凝膠sephadexg-200柱；二、用濃度為50mmol/l、ph為7.5的pbs緩沖液進(jìn)行洗脫，流速為1.2ml/min，收集第34～50min洗脫液，并調(diào)節(jié)ph值至2，然后靜置、再4000r/min離心15min后用蒸餾水洗滌沉淀，之后真空冷凍干燥，即得到黑木耳黑色素活性成分f1；其中，步驟一中naoh溶液的濃度為0.2mol/l。本發(fā)明中黑木耳黑色素的制備方法：黑木耳經(jīng)烘干后粉碎，過(guò)60目篩。準(zhǔn)確稱取黑木耳粉末樣品10g，加入250ml濃度為3mol/l的鹽酸，70℃下攪拌浸提1h，混合物經(jīng)4000r/min離心15min，分離上清和沉淀，收集沉淀用氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph值至12，充分溶解攪拌后，再經(jīng)4000r/min離心15min，取上清，上清液用濃度為3mol/l的鹽酸調(diào)節(jié)ph至2，靜置，4000r/min離心15min后得到黑色素粗品，黑色素粗品用濃度為7mol/l的hcl在100℃下水解2h，10000r/min離心20min，沉淀依次用氯仿、乙酸乙酯和乙醇洗滌，之后沉淀再用蒸餾水洗滌3～5次，再一次離心，取沉淀，經(jīng)冷凍干燥即得黑色固體粉末狀的黑木耳黑色素。本發(fā)明黑木耳黑色素活性成分f1的紅外掃描圖譜如圖1所示，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與復(fù)雜的生物大分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)十分相似，黑木耳黑色素活性成分f1具有多種官能團(tuán)才得以使其紅外光譜掃描圖中具有多個(gè)寬而強(qiáng)的吸收峰。在黑木耳黑色素活性成分f1的紅外光譜掃描圖譜中，在3200cm-1附近出現(xiàn)的寬峰，是由oh和nh2基團(tuán)伸縮振動(dòng)引起的；在2950～2850cm-1處的吸收峰說(shuō)明有脂肪族c-h的存在；1650～1500cm-1處的強(qiáng)烈吸收，與芳香族c＝c和coo的振動(dòng)有關(guān)；1400～1200cm-1位置的吸收峰顯示酚類coh和吲哚以及nh的存在；800～600cm-1范圍的相對(duì)小的吸收峰代表著芳香環(huán)的存在。在黑木耳黑色素活性成分f1的1hnmr光譜中，0.8～1.0ppm范圍為脂肪族區(qū)，出現(xiàn)的信號(hào)認(rèn)定為烷基片段的ch3基團(tuán)，例如ch2ch3，ch(ch3)2，可能來(lái)自殘留的蛋白質(zhì)；在2.0ppm附近的信號(hào)是屬于亞甲基或酯基(-ococh3)，表明羧酸結(jié)構(gòu)的存在；在4ppm周圍的峰被認(rèn)定為結(jié)合于吲哚或吡咯環(huán)的甲基(n-ch3)和結(jié)合到環(huán)上的第一個(gè)位置的-och3；6.5和7.3ppm的信號(hào)是吲哚或吡咯環(huán)的芳香族氫原子；8.5ppm附近的信號(hào)是吲哚或吡咯環(huán)上的羧基質(zhì)子。其中，位置在5ppm出現(xiàn)的強(qiáng)信號(hào)是溶劑中naoh中h的峰。黑木耳黑色素的1hnmr光譜中，2.0ppm附近的信號(hào)強(qiáng)于黑木耳黑色素活性成分f1，說(shuō)明黑木耳黑色素的羧酸結(jié)構(gòu)比例更高；4ppm周圍的峰面積小于黑木耳黑色素活性成分f1，代表吲哚或吡咯環(huán)的比例較小。表明黑木耳黑色素含有更多的蛋白質(zhì)，而黑木耳黑色素活性成分f1含有更多的用來(lái)構(gòu)成骨架的吲哚或吡咯環(huán)。將黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素噴涂au后用環(huán)境掃描電子顯微鏡直接成像，觀察黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素的微觀結(jié)構(gòu)。黑木耳黑色素是由表面不規(guī)則的球形單體組成，并且呈層層堆疊結(jié)構(gòu)，通過(guò)軟件測(cè)量黑木耳黑色素單體平均粒徑約為1μm(如圖4所示)。大量黑木耳黑色素單體聚合如圖5所示，呈較大體積的不規(guī)則塊狀形態(tài)，表面的氣孔表示黑木耳黑色素的結(jié)合并不緊密。本發(fā)明黑木耳黑色素活性成分f1有更明顯的片層結(jié)構(gòu)，且表面比黑木耳黑色素光滑，單體間結(jié)合的更加緊密(如圖6所示)。黑木耳黑色素活性成分f1大量聚合如圖7所示，形成較大體積的不規(guī)則塊狀形態(tài)，但表面比黑木耳黑色素更光滑致密，說(shuō)明單純黑木耳黑色素活性成分f1比黑木耳黑色素結(jié)合的更加緊密，單體與單體之間的連接更加堅(jiān)固。本發(fā)明黑木耳黑色素活性成分f1在光照條件下和室溫條件下具有比黑木耳黑色素更為優(yōu)異的穩(wěn)定性。本發(fā)明黑木耳黑色素活性成分f1可以明顯提高ida小鼠模型的血紅蛋白和血紅細(xì)胞數(shù)，改善造血因子，增加鐵吸收，有效改善缺鐵性貧血。由于黑木耳黑色素活性成分f1中并不含大量的鐵元素，因此不會(huì)在結(jié)腸中產(chǎn)生自由基損傷粘膜細(xì)胞，不會(huì)增加結(jié)腸中的脂質(zhì)過(guò)氧化，影響腸上皮細(xì)胞的完整性。而且不會(huì)損害人體免疫應(yīng)答系統(tǒng)，不會(huì)引起惡心、腹痛、腹瀉、便秘等不良癥狀。本發(fā)明黑木耳黑色素活性成分f1能夠改善缺鐵性貧血人群腸道菌群結(jié)構(gòu)、增加豐度。低鐵補(bǔ)血?jiǎng)┲饕赡径谏鼗钚猿煞謋1組成。其中，低鐵補(bǔ)血?jiǎng)┲羞€包括黑木耳黑色素。黑木耳黑色素活性成分f1作為低鐵補(bǔ)血?jiǎng)┑膽?yīng)用。黑木耳黑色素作為低鐵補(bǔ)血?jiǎng)┑膽?yīng)用。黑木耳黑色素活性成分f1作為缺鐵性貧血患者腸道菌群調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用。黑木耳黑色素作為缺鐵性貧血患者腸道菌群調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用。黑木耳黑色素活性成分f1可以有效提高缺鐵性貧血小鼠紅細(xì)胞數(shù)量及血紅蛋白的濃度，灌胃口服黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素的缺鐵性貧血小鼠紅細(xì)胞的數(shù)量和血紅蛋白濃度均顯著高于ida組，并恢復(fù)到正常水平。黑木耳黑色素活性成分f1對(duì)缺鐵性貧血的恢復(fù)作用并不受飲食成分的干擾。附圖說(shuō)明圖1是本發(fā)明黑木耳黑色素活性成分f1的紅外掃描圖譜。圖2是本發(fā)明黑木耳黑色素活性成分f1的1hnmr掃描圖譜。圖3是黑木耳黑色素的1hnmr掃描圖譜。圖4是黑木耳黑色素的掃描電鏡圖。圖5是大量單體聚合黑木耳黑色素的掃描電鏡圖。圖6是黑木耳黑色素活性成分f1的掃描電鏡圖。圖7是大量單體聚合黑木耳黑色素活性成分f1的掃描電鏡圖。圖8是實(shí)驗(yàn)2中根據(jù)各組小鼠糞便總dna，得到的小鼠腸道菌群細(xì)菌群落組成分析圖譜。圖9是實(shí)驗(yàn)3中黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素自然光照射條件下保存率檢測(cè)結(jié)果圖。圖10是實(shí)驗(yàn)3中黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素室溫條件下保存率檢測(cè)結(jié)果圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式，還包括各具體實(shí)施方式間的任意組合。具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式黑木耳黑色素活性成分f1按以下步驟制備獲得：一、將黑木耳黑色素以5mg/ml的濃度溶于naoh溶液中，然后上樣葡聚糖凝膠sephadexg-200柱；二、用濃度為50mmol/l、ph為7.5的pbs緩沖液進(jìn)行洗脫，流速為1.2ml/min，收集第34～50min洗脫液，并調(diào)節(jié)ph值至2，然后靜置、再4000r/min離心15min后用蒸餾水洗滌沉淀，之后真空冷凍干燥，即得到黑木耳黑色素活性成分f1；其中，步驟一中naoh溶液的濃度為0.2mol/l。黑木耳黑色素及黑木耳黑色素活性成分f1的元素含量如表1所示，黑木耳黑色素的n、c、h、s四種元素的含量均高于黑木耳黑色素活性成分f1。其中，黑木耳黑色素的n含量為10.38％高于黑木耳黑色素活性成分f1的n含量，說(shuō)明黑木耳黑色素可能含有更多的蛋白質(zhì)，這與傅里葉紅外掃描圖的結(jié)果相互印證。表1注：表中o％＝100％-n％-c％-h％-s％本實(shí)施方式所使用的黑木耳為東寧黑木耳產(chǎn)業(yè)基地提供，菌種編號(hào)：hdxz-1。鐵調(diào)素(hepcidin)作為鐵代謝調(diào)節(jié)中最關(guān)鍵的調(diào)節(jié)分子(如胰島素調(diào)節(jié)血糖一樣)，調(diào)節(jié)人體對(duì)鐵的代謝吸收能力，鐵調(diào)素的活性與人體鐵吸收能力呈負(fù)相關(guān)性。分析認(rèn)為黑木耳黑色素活性成分f1可作用于鐵調(diào)素，提高鐵的吸收和利用。低溫有利于黑木耳黑色素活性成分f1的保存，長(zhǎng)時(shí)間加熱會(huì)降低黑木耳黑色素活性成分f1保存率；ph值會(huì)顯著的影響黑木耳黑色素活性成分f1的溶解性，堿性條件更有利于黑木耳黑色素活性成分f1的溶解；k+、ca2+和mg2+會(huì)顯著降低黑木耳黑色素活性成分f1的吸光值，cu2+和fe3+會(huì)使黑木耳黑色素活性成分f1的吸光值升高；黑木耳黑色素活性成分f1容易被氧化劑氧化，但還原劑對(duì)其穩(wěn)定性沒有顯著影響；苯甲酸鈉、山梨酸鉀、谷氨酸鈉和丁基化羥基茴香醚這四種食品添加劑對(duì)黑木耳黑色素活性成分f1穩(wěn)定性影響不大。黑木耳黑色素活性成分f1以吡咯環(huán)和吲哚環(huán)為骨架，骨架上連接著脂肪碳鏈和羰基，這些結(jié)構(gòu)大量聚合后形成不規(guī)則的單體，單體以層疊的形式聚合，組成表面較光滑的不規(guī)則黑木耳黑色素活性成分f1。在207nm處有強(qiáng)吸收峰，通過(guò)對(duì)黑木耳黑色素活性成分f1中s元素的含量計(jì)算可知，黑木耳黑色素活性成分f1中真黑色素與棕黑色素的含量比為10.36:1。具體實(shí)施方式二：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一的不同點(diǎn)是：步驟二中葡聚糖凝膠sephadexg-200均先用濃度為50mmol/l、ph為7.5的pbs緩沖液沖洗穩(wěn)定后再上樣。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一相同。具體實(shí)施方式三：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一或二的不同點(diǎn)步驟二中葡聚糖凝膠sephadexg-200直徑為1.6cm、長(zhǎng)度為64cm。其它步驟及參數(shù)與實(shí)施方式一或二相同。具體實(shí)施方式四：本實(shí)施方式低鐵補(bǔ)血?jiǎng)┲饕赡径谏鼗钚猿煞謋1組成。本實(shí)施方式低鐵補(bǔ)血?jiǎng)┲羞€可以包括黑木耳黑色素；黑木耳黑色素與黑木耳黑色素活性成分f1的質(zhì)量比為1～100:1。具體實(shí)施方式五：本實(shí)施方式黑木耳黑色素活性成分f1作為低鐵補(bǔ)血?jiǎng)┑膽?yīng)用。具體實(shí)施方式六：本實(shí)施方式黑木耳黑色素作為低鐵補(bǔ)血?jiǎng)┑膽?yīng)用。具體實(shí)施方式七：本實(shí)施方式黑木耳黑色素活性成分f1作為缺鐵性貧血患者腸道菌群調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用。具體實(shí)施方式八：本實(shí)施方式黑木耳黑色素作為缺鐵性貧血患者腸道菌群調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)1：1.1缺鐵性貧血小鼠模型造模方法參照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范實(shí)施手冊(cè)》中的方法，試驗(yàn)采用體重14.0±1.7g昆明種24日齡雄性小鼠，小鼠在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)3～5天后，隨機(jī)選取130只小鼠開始喂飼低鐵飼料，飲用去離子水，采用非鐵制籠蓋和塑料籠體，嚴(yán)格避免鐵的污染。兩周后隨機(jī)選10只小鼠從尾部采血，采用血細(xì)胞自動(dòng)分析儀測(cè)定小鼠的血紅蛋白含量，若飼低鐵飼料試驗(yàn)小鼠平均血紅蛋白(hb)≤100g/l為造模成功。1.2小鼠飼養(yǎng)和分組小鼠飼養(yǎng)于黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物培養(yǎng)室。實(shí)驗(yàn)室設(shè)施條件及動(dòng)物日常管理工作依照《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)》實(shí)施，環(huán)境溫度為20±2℃，環(huán)境相對(duì)濕度為45％～65％，自動(dòng)控制12h晝夜更替。造模成功后，隨機(jī)分成4組，每組30只，分別為缺鐵性貧血組(ida)，缺鐵性貧血+黑木耳黑色素組(ida+m)，缺鐵性貧血+黑木耳黑色素活性成分f1組(ida+f1)，缺鐵性貧血+硫酸亞鐵組(ida+fe2+)；另外取30只29日齡正常健康雄性小鼠作為正常對(duì)照組(control)。control組和ida組灌胃蒸餾水，ida+m組灌胃黑色素、給藥劑量為200mg/kg·d，ida+f1組灌胃黑色素f1、給藥劑量為179.51mg/kg·d，ida+fe2+組灌胃硫酸亞鐵組、給藥劑量為5mg/kg·d，連續(xù)灌胃。正常組始終飼喂正常飼料，各缺鐵性貧血組始終飼喂低鐵飼料。自試驗(yàn)開始，所有組小鼠每7d測(cè)量一次體重，并做好記錄。停止灌胃當(dāng)天，取小鼠眼球血，用于外周血常規(guī)分析、血清促紅細(xì)胞生成素(epo)、干細(xì)胞因子(scf)、血清特異轉(zhuǎn)錄因子gata-1、血清鐵(si)含量的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)觀察：造模過(guò)程中小鼠開始出現(xiàn)掉毛，皮毛稀疏，腳爪和尾部皮膚蒼白，活動(dòng)減少，萎蔫，畏寒怕冷等現(xiàn)象，隨著試驗(yàn)的延長(zhǎng)，以上現(xiàn)象越發(fā)明顯，并且生長(zhǎng)緩慢，皮毛失去光澤。血常規(guī)指標(biāo)可見，造模結(jié)束后小鼠血紅蛋白(hb)含量、紅細(xì)胞數(shù)(rbc)、紅細(xì)胞壓積(hct)、血小板數(shù)(plt)與control組相比分別下降了47.5％、36.89％、37.58％、64.46％，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的極顯著差異(p<0.01)，平均紅細(xì)胞體積(mcv)與control組相比下降了16.15％，有顯著性差異(p<0.05)。ida組小鼠平均血紅蛋白含量(hb)≤100g/l，紅細(xì)胞數(shù)(rbc)≤7.7×1012/l，紅細(xì)胞壓積(hct)≤36％，平均紅細(xì)胞體積(mcv)≤48μm3，血小板數(shù)(plt)≤157×106/l。表明飼喂低鐵飼料的小鼠出現(xiàn)了明顯的貧血現(xiàn)象，說(shuō)明造模成功。表2造模結(jié)束時(shí)小鼠外周血象hb(g/l)rbc(1012/l)hct(％)mcv(μm3)plt(106/l)正常對(duì)照組166.67±15.2810.93±0.7451.67±4.7351.13±2.06192.67±29.56模型組87.50±12.58**6.90±0.63**32.25±3.59**42.88±2.90*68.50±24.84**參考值100～1907.7～12.536～5048～51157～260正常組始終飼喂正常飼料，各缺鐵性貧血組始終飼喂低鐵飼料。實(shí)驗(yàn)前2周小鼠均灌胃蒸餾水，小鼠處于快速生長(zhǎng)期，各缺鐵性貧血組與正常飼料組體重穩(wěn)步增長(zhǎng)，各組間沒有差異(p<0.05)。從第3周開始給予相應(yīng)的灌胃(ida+m組灌胃黑色素、給藥劑量為200mg/kg·d，ida+f1組灌胃黑色素f1、給藥劑量為179.51mg/kg·d，ida+fe2+組灌胃硫酸亞鐵、給藥劑量為5mg/kg·d)各組小鼠的體重都隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而穩(wěn)步增加，但是增加的速度各不相同，control組體重增長(zhǎng)最快，ida+m組次之，ida+f1組小鼠增長(zhǎng)速度略低于ida+m組，ida+fe2+組體重增長(zhǎng)速度低于ida+f1組，ida組的體重低于其余各組，為各組最低。各組小鼠血液常規(guī)如表3所示。給予藥物灌胃干預(yù)3周后，ida+f1組小鼠紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白量、紅細(xì)胞壓積、平均紅細(xì)胞體積、平均血紅蛋白量、平均血紅蛋白濃度、血小板相對(duì)于ida組平均升高了43.56％、94.34％、60％、6.31％、14.33％、5.42％、21.81％(p<0.05)，同時(shí)與control組無(wú)顯著差異(p>0.05)，已達(dá)到正常水平；黑木耳黑色素活性成分f1可以有效改善小鼠缺鐵性貧血。黑木耳黑色素活性成分f1可以有效提高缺鐵性貧血小鼠紅細(xì)胞數(shù)量及血紅蛋白的濃度，灌胃黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素的缺鐵性貧血小鼠紅細(xì)胞的數(shù)量和血紅蛋白濃度均顯著高于ida組，并恢復(fù)到control組水平。而ida組小鼠血紅蛋白，紅細(xì)胞數(shù)仍然保持較低的水平，處于貧血狀態(tài)，說(shuō)明試驗(yàn)期間持續(xù)的飼喂低鐵飼料，保證了小鼠不會(huì)因飲食恢復(fù)正常而使得貧血的得到恢，從側(cè)面驗(yàn)證了黑木耳黑色素活性成分f1對(duì)缺鐵性貧血的作用非因飲食改變而使得貧血得到恢復(fù)。小鼠血液常規(guī)檢測(cè)數(shù)據(jù)反映出黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素具有提高紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞體積、平均血紅蛋白量和平均血紅蛋白濃度的作用。表3controlidaida+fe2+ida+mida+f1wbc(109/l)6.42±0.90a1.82±0.50c3.28±1.06b6.45±1.20a6.80±0.86arbc(1012/l)10.10±0.82b7.15±0.74c10.88±0.92ab11.38±1.37a10.22±1.31bhb(g/l)155.00±15.17bc85.00±15.17d156.67±8.16bc171.67±7.53ab171.67±11.69abhct(％)51.67±6.22a38.83±4.75b51.17±4.36a54.50±8.02a52.00±6.72amcv(fl)51.08±2.69a47.58±2.81b47.05±2.52b52.63±1.55a50.30±3.10amch(pg)15.37±0.54ab13.88±1.33c14.43±0.58bc15.90±0.47a15.15±1.67abmchc(g/l)300.67±8.82cd291.33±12.31d307.17±18.03c340.67±9.56a314.50±14.27bplt(109/l)818.33±262.94ab653.33±269.79b1058.33±132.27a885.00±227.93ab806.17±109.43b試驗(yàn)期間持續(xù)飼喂低鐵飼料，排除了小鼠貧血癥狀恢復(fù)受飲食成分干擾的因素。實(shí)驗(yàn)時(shí)間3周，ida+fe2+組小鼠平均紅細(xì)胞體積相對(duì)于control組出現(xiàn)了顯著下降，血清干細(xì)胞因子下降3.86％，血清促紅細(xì)胞生成素的濃度顯著下降11.05％，血清特異轉(zhuǎn)綠因子gata-1的濃度則顯著的降低20.26％，這都顯示硫酸亞鐵在治療缺鐵性貧血時(shí)，除了引起腸胃不適癥狀外，很可能會(huì)對(duì)機(jī)體造血功能造成損害，存在較大的潛在危險(xiǎn)；而ida+m組和ida+f1組小鼠均未出現(xiàn)上述癥狀。實(shí)驗(yàn)時(shí)間3周，雖然ida+fe2+組小鼠白細(xì)胞數(shù)比ida組有比較大的回升，但是仍然明顯低于control組、ida+m組和ida+f1，實(shí)驗(yàn)是時(shí)間延長(zhǎng)至2個(gè)月，ida+fe2+組小鼠白細(xì)胞數(shù)仍維持在(3.46±1.21)×109/l沒有改善；而且ida+fe2+組小鼠還出現(xiàn)腹瀉、便秘，情緒煩躁等情況，而ida+m組和ida+f1組小鼠均未出現(xiàn)類似癥狀。各組小鼠的造血功能因子數(shù)據(jù)如表4所示。表4controlidaida+fe2+ida+mida+f1scf751.90±50.92bc827.31±64.84b610.48±98.13d904.01±53.30a889.91±52.19aepa136.57±13.64c137.62±11.62c154.65±11.38b182.28±17.70a181.70±14.66agata-111.35±2.12ab10.72±1.02c10.66±1.62c13.00±0.42a13.08±1.53asi1.24±0.06b0.75±0.04d1.20±0.14c1.44±0.06a1.41±0.14a干細(xì)胞因子scf是重要的造血細(xì)胞因子，血清scf低下可作為引起造血功能障礙的原因，并且scf對(duì)于造血干細(xì)胞和早期祖細(xì)胞粘附骨髓造血微環(huán)境起著關(guān)鍵作用。與ida組相比，ida+m組和ida+f1組血清干細(xì)胞因子的濃度分別顯著升高了12.89％和10.21％(p<0.05)，而ida+fe2+組血清干細(xì)胞因子的濃度并沒有顯著差異(p>0.05)。并且相比于control組，ida+m組和ida+f1組血清干細(xì)胞因子濃度顯著升高了19.20％和16.37％(p<0.05)，而ida組的血清干細(xì)胞因子濃度略有升高，但并不顯著(p>0.05)。由此可見，當(dāng)機(jī)體發(fā)生缺鐵性貧血時(shí)，機(jī)體自身的應(yīng)激反應(yīng)會(huì)使得機(jī)體的血清干細(xì)胞因子濃度升高，但這一升高并不顯著，在缺鐵性貧血發(fā)生時(shí)灌胃黑木耳黑色素和黑木耳黑色素活性成分f1可以顯著提高血清干細(xì)胞因子濃度，這表明黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素有較好的促進(jìn)血清干細(xì)胞因子產(chǎn)生的功能。促紅細(xì)胞生成素(epo)是一種主要有腎臟產(chǎn)生的糖蛋白激素，是參與紅系造血的主要調(diào)控因子，具有促進(jìn)紅系祖細(xì)胞增殖、分化，維持紅細(xì)胞、血紅蛋白穩(wěn)定的作用。與ida組相比，ida+m組和ida+f1組小鼠血清促紅細(xì)胞生成素濃度顯著提高28.48％和26.25％(p<0.05)，然而，ida+fe2+組小鼠血清促紅細(xì)胞生成素的濃度與ida組沒有顯著差異(p>0.05)；當(dāng)缺鐵性貧血發(fā)生時(shí)，小鼠血清促紅細(xì)胞生成素濃度并沒有降低，但control組沒有顯著差異(p>0.05)。由此可見，當(dāng)缺鐵性貧血發(fā)生時(shí)，給予黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素會(huì)提高血清促紅細(xì)胞生成素的濃度。血清鐵(si)是指在血液中與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合了的鐵，是和轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合形成的復(fù)合物，血清鐵用于鑒別缺鐵性以及非缺鐵性的貧血。而轉(zhuǎn)鐵蛋白對(duì)鐵的結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)能力受到調(diào)節(jié)因子鐵調(diào)素的調(diào)控，并與其呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。ida+f1組與control組和ida+m組血清鐵濃度無(wú)顯著差異(p>0.05)，均維持在正常水平；與ida組小鼠相比，ida+m組和ida+f1組小鼠的血清鐵濃度有顯著提高(p<0.05)，分別提高了87.53％和84.68％；而ida+fe2+組小鼠的血清鐵濃度并沒有得到恢復(fù)，與ida組無(wú)顯著差異(p>0.05)。由此可見，對(duì)于ida組小鼠而言，補(bǔ)充黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素可以使得血清鐵濃度得到恢復(fù)。綜上，黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素可以改善貧血狀況，由于現(xiàn)有補(bǔ)鐵、補(bǔ)血藥劑都是在其中加入大量鐵源，通過(guò)大量的鐵元素補(bǔ)充來(lái)改善人體缺鐵、貧血的癥狀。一旦停藥，缺鐵性貧血很容易復(fù)發(fā)，而持續(xù)倉(cāng)時(shí)間服用對(duì)人體造血機(jī)能反而造成不良影響。本發(fā)明不是利用增加鐵源單純性的補(bǔ)鐵，黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素能夠激活和提高體內(nèi)的血清干細(xì)胞因子濃度，所以用藥后會(huì)持續(xù)、長(zhǎng)時(shí)間產(chǎn)生補(bǔ)鐵、補(bǔ)血效果，具有作用時(shí)間長(zhǎng)、缺鐵性貧血不易復(fù)發(fā)，長(zhǎng)時(shí)間服用安全有效的優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)2：2.1缺鐵性貧血小鼠模型造模方法參照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范實(shí)施手冊(cè)》中的方法，試驗(yàn)采用體重14.0±1.7g昆明種24日齡雄性小鼠，小鼠在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)3～5天后，隨機(jī)選取70只小鼠開始喂飼低鐵飼料，飲用去離子水，采用非鐵制籠蓋和塑料籠體，嚴(yán)格避免鐵的污染。兩周后隨機(jī)選10只小鼠從尾部采血，采用血細(xì)胞自動(dòng)分析儀測(cè)定小鼠的血紅蛋白含量，若飼低鐵飼料試驗(yàn)小鼠平均血紅蛋白(hb)≤100g/l為造模成功。2.2小鼠飼養(yǎng)和分組小鼠飼養(yǎng)于黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物培養(yǎng)室。實(shí)驗(yàn)室設(shè)施條件及動(dòng)物日常管理工作依照《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)》實(shí)施，環(huán)境溫度為20±2℃，環(huán)境相對(duì)濕度為45％～65％，自動(dòng)控制12h晝夜更替。造模成功后，隨機(jī)分成3組，每組20只，分別為缺鐵性貧血組(ida)，缺鐵性貧血+黑木耳黑色素活性成分f1組(ida+f1)，缺鐵性貧血+硫酸亞鐵組(ida+s)；另外取20只29日齡正常健康雄性小鼠作為正常對(duì)照組(control)。實(shí)驗(yàn)4周，正常組始終飼喂正常飼料，各缺鐵性貧血組始終飼喂低鐵飼料。control組和ida組小鼠灌胃蒸餾水，ida+f1組灌胃黑色素f1、給藥劑量為179.51mg/kg·d，ida+s組灌胃硫酸亞鐵組、給藥劑量為5mg/kg·d。2.3提取各組小鼠糞便總dna實(shí)驗(yàn)觀察：根據(jù)各組小鼠糞便總dna，分析獲得各組小鼠腸道菌群細(xì)菌群落組成分如圖8所示。s24-7_norank種屬細(xì)菌在正常組、正常+硫酸亞鐵組、正常+黑木耳黑色素組和缺鐵性貧血+黑木耳黑色素組小鼠腸道內(nèi)是豐度最高的菌群，豐度值分別是23.48％、46.73％、24.85％和24.77％；但是，在缺鐵性貧血組和缺鐵性貧血+硫酸亞鐵組小鼠腸道內(nèi)，豐度最高的細(xì)菌是allobaculum種屬細(xì)菌，豐度值分別為30.74％和29.65％。豐度第二的菌群在正常組為alistipes，豐度為10.73％；在正常+硫酸亞鐵組和正常+黑木耳黑色素組分別為ruminococcaceae_uncultured和ruminococcaceae_unclassified，豐度分別為7.81％和11.36％；在缺鐵性貧血組和缺鐵性貧血+硫酸亞鐵組為s24-7_norank，豐度分別為20.90％和17.21％；在缺鐵性貧血+黑木耳黑色素組為bacteroides，豐度為15.99％；豐度第三的菌群在正常+硫酸亞鐵組和缺鐵性貧血+硫酸亞鐵組為alistipes，豐度分別為6.90％和14.27％；在正常對(duì)照組為prevotellaceae_uncultured，豐度為9.51％，在正常+木耳黑色素組為blautia，豐度為9.09％；在缺鐵性貧血組為bacteroides，豐度為9.60％；在缺鐵性貧血組為allobaculum，豐度為9.53％。黑木耳黑色素活性成分f1可以扭轉(zhuǎn)缺鐵性貧血小鼠腸道內(nèi)豐度出現(xiàn)的下降，s24-7_norank,alistipes,ruminococcaceae_uncultured,blautia,ruminococcaceae(瘤胃菌科)_unclassified,prevotellaceae_uncultured(普雷沃菌屬)等6個(gè)主要種屬細(xì)菌的豐度。黑木耳黑色素活性成分f1可以降低缺鐵性貧血小鼠腸道內(nèi)豐度升高的支原體科allobaculum和紫單胞菌科parabacteroides豐度。說(shuō)明發(fā)生缺鐵性貧血時(shí)，小鼠腸道內(nèi)占主要地位菌群的豐度發(fā)生顯著改變，黑木耳黑色素活性成分f1可以對(duì)主要菌群的豐度變化起到調(diào)節(jié)作用，使其得到恢復(fù)；而硫酸亞鐵則無(wú)法達(dá)到上述效果。黑木耳黑色素活性成分f1相對(duì)于硫酸亞鐵，不會(huì)對(duì)正常小鼠腸道菌群的種屬分類水平的豐度產(chǎn)生顯著差異性影響，而會(huì)對(duì)缺鐵性貧血小鼠腸道菌群的豐度產(chǎn)生顯著差異性影響。小鼠腸道菌群整體差異性分析發(fā)現(xiàn)黑木耳黑色素活性成分f1可以縮小缺鐵性貧血小鼠腸道菌群與正小鼠的差異，而硫酸亞鐵無(wú)此作用。小鼠腸道菌群微生物多樣性指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，在缺鐵性貧血發(fā)生時(shí)，小鼠腸道菌群的豐度、均勻度及多樣性指數(shù)都會(huì)降低，給予缺鐵性貧血小鼠和正常組小鼠黑木耳黑色素活性成分f1，其腸道菌群的豐度、均勻度和多樣性均會(huì)增加；給與缺鐵性貧血小鼠硫酸亞鐵，腸道菌群的豐度、均勻度和多樣性指數(shù)僅有略微上升。小鼠腸道代謝物分析：發(fā)生缺鐵性貧血時(shí)，小鼠腸道內(nèi)丙酸、丁酸、乳酸含量顯著降低，并低于正常對(duì)照組，乙酸的含量無(wú)顯著變化。黑木耳黑色素活性成分f1可以顯著提高缺鐵性貧血小鼠腸道內(nèi)丙酸、丁酸、乳酸的含量，硫酸亞鐵除可以顯著提高小鼠腸道內(nèi)乳酸的含量，但反而會(huì)使得小鼠腸道內(nèi)丙酸、丁酸含量顯著低于缺鐵性貧血組。實(shí)驗(yàn)證明黑木耳黑色素活性成分f1提高缺鐵性貧血小鼠腸道菌群豐度、均勻度和多樣性指數(shù)，縮小缺鐵性貧血小鼠與正常小鼠腸道菌群的差異，具有一定的調(diào)節(jié)腸道菌群的作用。黑木耳黑色素活性成分f1可以顯著提高缺鐵性貧血小鼠腸道內(nèi)丙酸、丁酸、軟脂酸、硬脂酸、油酸、氨基酸等代謝物的濃度，并能從總體上縮小貧血小鼠與正常小鼠腸道代謝物的差異，使其腸道代謝物的異常變化得到恢復(fù)，并逐漸趨于正常。實(shí)驗(yàn)3：黑木耳黑色素活性成分f1和黑木耳黑色素的性能對(duì)比試驗(yàn)：3.1光照自然光照射4w(保存率測(cè)定結(jié)果如圖9所示)，黑木耳黑色素活性成分f1及黑木耳黑色素的保存率均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且與初始值相比差異顯著(p<0.05)。說(shuō)明光照對(duì)黑木耳黑色素的破壞作用隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，可能是由于光照使黑木耳黑色素各組分的結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同程度的變化，從而使得其保存率有不同程度的下降。所以黑木耳黑色素對(duì)光照敏感，需避光保存。對(duì)比發(fā)現(xiàn)黑木耳黑色素活性成分f1較黑木耳黑色素在光照條件下的穩(wěn)定性更好，二者在第3w和第4w的保存率呈現(xiàn)顯著性差異(p>0.05)。黑木耳黑色素活性成分f1對(duì)光照射的穩(wěn)定性優(yōu)于黑木耳黑色素。3.2室溫將黑木耳黑色素活性成分f1及黑木耳黑色素置于溫度為25℃環(huán)境中，黑木耳黑色素活性成分f1的保存率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)沒有顯著差異(p>0.05)，而黑木耳黑色素在各時(shí)間段間保存率下降顯著(p<0.05)，測(cè)定結(jié)果如圖10所示。說(shuō)明黑木耳黑色素活性成分f1在室溫條件下具有比黑木耳黑色素更為優(yōu)異的室溫耐保存性。當(dāng)前第1頁(yè)12

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